陳皮中黃酮的提取分離純化方法*

谷雪賢

(中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院健康產(chǎn)業(yè)學(xué)院，廣東 中山 528436)

陳皮分為陳皮和廣陳皮，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材之一，其中廣陳皮作為廣東省江門市新會(huì)區(qū)的地理標(biāo)志特色產(chǎn)物。陳皮中含有黃酮、生物堿、揮發(fā)油等活性成分。其中揮發(fā)油主要成分為檸檬烯，別名苧烯，屬于單萜類化合物，化學(xué)式C10H16，是一種天然的功能單萜，因?yàn)槠溆歇?dú)特的香味，在食品、化妝品中可作香精香料；黃酮類物質(zhì)具有良好的抗氧化功效，是一種具有藥用價(jià)值的天然綠色成分，對(duì)陳皮中黃酮類化合物提取及其活性研究一直是陳皮研究的熱點(diǎn)，目前已從該屬植物中分離和鑒定的黃酮類化合物多達(dá)六十多種，主要包括：橙皮苷、新橙皮甙、柑橘素、二氫川陳皮素及5-去甲二氫川陳皮素等。其中橙皮苷含量最高，被2015版藥典定義為陳皮的指標(biāo)性成分，要求其含量不得低于3.5%[1]。

近10年內(nèi)眾多學(xué)者通過(guò)各種實(shí)驗(yàn)方法在各種植物中提取黃酮類化合物，其中使用得最多的方法是超聲波法，微波反應(yīng)器輔助法，CO2超臨界流體法，有機(jī)溶劑熱回流法，靜態(tài)浸泡法等；分離純化方法主要有大孔樹脂吸附法、層析法、制備高效液相色譜法等，定性定量分析方法主要包括紫外分光光度法、高效液相色譜法及液相色譜——質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。

1 陳皮中黃酮混合液的提取方法

1.1 堿性水提取法

由于黃酮化合物分子結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的羥基，使其具有親水和酸度，所以能在弱堿水中溶解。常用氫氧化鈉稀溶液浸泡提取植物中的黃酮類物質(zhì)。焦鐳等[2]驗(yàn)證：用pH值為8.5，液料比25∶1 mL/g，溫度為90 ℃的條件下提取3 h可得山楂葉總黃酮的提取量為7.97 mg/g。

1.2 有機(jī)溶劑提取法

用石油醚、乙酸乙酯、乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑提取陳皮中的黃酮是實(shí)驗(yàn)室中最常見(jiàn)的方法，其主要原因是黃酮苷元難溶或不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。但該方法采用的有機(jī)溶劑大多都對(duì)人體有害，并可造成環(huán)境污染，同時(shí)提取過(guò)程中因采用了加熱工藝，可能破壞其有效成分。

鐘桂云等研究了乙醇提取陳皮中黃酮含量的影響因素，結(jié)果表明主要的影響因素有乙醇和水的比例、料液比、溫度、提取次數(shù)及提取時(shí)間，其中乙醇和水的比例對(duì)提取率的影響很大，乙醇濃度高能促進(jìn)黃酮的提取。經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定提取黃酮的最佳工藝條件為： 乙醇和水的比例為4∶1 (體積比)、料液比1∶30、提取溫度75 ℃、提取時(shí)間2.5 h，在此條件下提取率為0.75%[3]。吳昊等[4]利用響應(yīng)面法對(duì)陳皮黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，在料液比為1∶30(g/mL)，乙醇濃度為70%，提取溫度為73.2 ℃，提取時(shí)間為2.25 h的最佳工藝條件下，黃酮得率實(shí)測(cè)值為2.02%。吳迪[5]通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)證明提取陳皮中的黃酮化合物最適溶劑是乙醇，其次是甲醇，提取率最低的是水溶液，并用乙醇熱回流法提取了陳皮中的黃酮類化合物，確定了8倍量60%乙醇回流提取3次(時(shí)間分別為1.5 h、1.0 h、0.5 h)為最佳工藝條件，總黃酮提取率為0.1351 mg/g。逢顯娟等[6]采用溶劑熱法提取陳皮中的橙皮苷，其最佳提取工藝條件為，提取溫度120 ℃，乙醇濃度60%，液料比70∶1 mL/g，提取時(shí)間45 min，橙皮苷得率為6.07%±0.03%。比傳統(tǒng)的乙醇回流法提取時(shí)間縮短了近70%，橙皮苷得率約提高1倍。

宋玉鵬等以丙酮-石油醚-水(6∶5∶5)為溶劑體系，采用簡(jiǎn)單、高效的多溶劑萃取法，從陳皮三氯甲烷萃取部分粗提物中分離得到純度高于98%的川陳皮素和橘皮素[7]。

1.3 纖維素酶預(yù)處理聯(lián)合熱回流提取法

陳皮中的黃酮等大部分有效成分都被包裹在其細(xì)胞壁內(nèi)，為了獲取為獲取目標(biāo)成分，必須破壞其細(xì)胞壁，植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要成分為纖維素，而纖維素酶能夠有效地破壞纖維素的β-1，4糖苷鍵，從而破壞纖維素的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高有效成分的提取收率[8]。

2017年張利等利用響應(yīng)面法優(yōu)化了纖維素酶提取陳皮中橙皮苷的工藝條件，結(jié)果顯示最佳工藝條件為：加酶量=0.79%、pH=3.45、T=59.07 ℃、t=2.13 h，此條件下預(yù)測(cè)橙皮苷得率為4.15%。比傳統(tǒng)乙醇工藝提取橙皮苷得率提高了11.32%[9]。

2022年劉謙鴻等[10]利用纖維素酶預(yù)處理聯(lián)合熱回流提取法對(duì)陳皮中橙皮苷進(jìn)行提取，其提取工藝為：首先將陳皮粉碎過(guò)0.150 mm孔徑篩、然后用纖維素酶進(jìn)行預(yù)處理、隨后加入乙醇進(jìn)行熱回流提取。確定了最佳工藝條件為：(1)纖維素酶預(yù)處理：pH 4.8、溫度45 ℃、酶解時(shí)間1.5 h、酶∶陳皮粉的質(zhì)量比1∶30，(2)熱回流提?。簻囟?5 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間3 h、料液比1∶25(g/mL)。在此條件的處理下，橙皮苷提取率為5.99%。一定程度地提高橙皮苷提取率，降低了污染。

1.4 超聲波輔助提取法

超聲提取法也是用于陳皮中黃酮類成分提取的常用方法之一，這是因?yàn)槌暰哂锌栈?、熱、力學(xué)等效應(yīng)。在空化過(guò)程中，微泡的爆炸將會(huì)產(chǎn)生巨大的壓力，從而在一瞬間引起植物細(xì)胞壁的破裂，利用植物的內(nèi)液釋放，從而減少了細(xì)胞內(nèi)液體的溶解。破壞陳皮的細(xì)胞膜，促進(jìn)黃酮等成分的釋放。

鄭美玲等利用超聲波法提取了陳皮中的黃酮，確定了最佳工藝條件為料液比1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取時(shí)間 20 min。在此條件下，陳皮黃酮的提取率為1.467%[11]。韓鵬虎等用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化了超聲波輔助提取陳皮總黃酮的工藝，最終確定乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶20(g/mL)、超聲時(shí)間為30 min為其最佳工藝條，此條件下陳皮總黃酮提取率為0.55%[12]。蘇學(xué)軍等[13]利用表面活性劑協(xié)同超聲提取了陳皮中的總黃酮，在最佳提取工藝下提取率可達(dá)6.83%，其中表面活性劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Tween20、乙醇的濃度為60%、料液比為1∶50(g/mL)、溫度為70 ℃。何露等[14]用超聲波輔助溶劑提取法提取了陳皮黃酮類化合物，設(shè)計(jì)響應(yīng)面法對(duì)其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，超聲時(shí)間為36 min，料液比為1∶25(g/mL)，所得黃酮提取率為24.75 mg/g，并且黃酮提取液用乙酸乙酯萃取和AB-8樹脂純化后，其抗氧化能力在純顯著增強(qiáng)，抗氧化能力的順序?yàn)椋篈B-8 樹脂純化>乙酸乙酯萃取>純化前。

1.5 微波輔助提取法

趙珉等[15]對(duì)比了純水、堿水和乙醇三種不同溶劑對(duì)微波提取法提取率的影響，最終確定了最佳的提取溶劑為乙醇，提取率為2.268%。黃智等[16]研究采用微波輔助提取陳皮中橙皮苷的最優(yōu)工藝條件：料液比1∶50、微波時(shí)間40 s、微波功率為240 W，在該條件下橙皮苷的提取為8.12%±0.04%。王慧芳等[17]依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)建立BBD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停庙憫?yīng)面優(yōu)化了微波輔助乙醇法提取陳皮中總黃酮的工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)乙醇體積濃度為60%、微波功率為619 W、時(shí)間為3 min、提取溫度為62 ℃、料液比 1∶21(g/mL)時(shí)的黃酮得率最高，為1.3468%±0.0142%。

1.6 超臨界萃取法

超臨界流體萃取利用超臨界流體為萃取劑多選用CO2，將原料中的黃酮化合物提取出來(lái)。超臨界CO2萃取法具有提取工藝簡(jiǎn)單、操作條件溫和、提取效率高、無(wú)有機(jī)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，并且還有利于熱不穩(wěn)定成分存在，使其生物活性成分不易發(fā)生改變，因此適用于黃酮化合物的提取。羅歡等采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選了超臨界CO2萃取陳皮中川陳皮素和橘皮素的工藝，確定了最佳的萃取工藝條件為：t=2 h，T=35 ℃，P=30 MPa，流速u=20 kg/h，萃取率達(dá)1.96%，川陳皮素和橘皮素總含量為45.23 mg/g[18]。

油田的概念同時(shí)具有空間和類型兩方面的涵義。就三維空間而言，油氣的聚集應(yīng)位于一定的地區(qū)、特定的地質(zhì)單元的特定層系。就類型而言分類的方法很多，如業(yè)內(nèi)常把是否能以傳統(tǒng)方式打井直接開采而分為常規(guī)和非常規(guī)，以生儲(chǔ)油組合的地層特點(diǎn)分海相和陸相等領(lǐng)域。在我們討論的問(wèn)題中新區(qū)一般指沒(méi)有或僅有少量油田的一個(gè)較大的地區(qū)/地質(zhì)單元（例如西藏高原、南黃海），新領(lǐng)域是指沒(méi)有或僅有少量油氣發(fā)現(xiàn)的勘探新層系、新類型。在實(shí)際工作中新區(qū)、新領(lǐng)域二者可有一定程度的交叉重疊。

除上述的四種萃取方法外，黃酮類化合物提取的方法還有多種，但是每種方法都各有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，因此，在選取最佳的萃取工藝時(shí)，應(yīng)綜合考慮原料性質(zhì)、成本、設(shè)備等方面的因素，最終選擇最為合適的提取方法。在實(shí)際操作中，為了提高黃酮化合物的的得率，一般會(huì)采用多種提取方法相結(jié)合的方式。

2 陳皮中黃酮的分離純化方法

2.1 柱色譜法

柱色譜法是一種具有樣品處理量大、分離速度快、分離效率高成本低等優(yōu)點(diǎn)的高效的物理分離方法[19-21]。楊潔等[22]從陳皮80%乙醇的提取物中利用硅膠、ODS柱層析色譜法和重結(jié)晶分離純化得到了12個(gè)單體化合物，其中8個(gè)是PMFs(多氧甲基黃酮)，首次從陳皮中分離得到了 8-羥基-3，5，6，7，3′，4′-六甲氧基黃酮和5，4′-二羥基-3，6，7，8，3′-五甲氧基黃酮。Fu等[23]采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20與ODS柱層析法相結(jié)合的方式，從陳皮中分離得到了9中聚甲氧基黃酮成分。呂小健等[24]先用無(wú)水乙醇浸提、然后依次用正己烷和二氯甲烷萃取得到了陳皮粗提物，再以硅膠做吸附劑，乙酸乙酯-石油醚做洗脫劑，分離得到了高純度的川陳皮素和橘皮素。

2.2 高速逆流色譜法

高速逆流色譜法具有上樣量大、分離效率高、產(chǎn)物純度高、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。孫印石等[25]采用高速逆流色譜法，以 2∶4∶3∶3的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水為溶劑體系，從陳皮粗產(chǎn)物中一步分離制備得到了桔皮素、5-羥基-6，7，8，3′，4′-五甲氧基黃酮，純度均達(dá)到97.0%以上。鄭國(guó)棟等[26]利用高速逆流色譜法，以1∶0.8∶0.7∶0.8的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水為溶劑體系，從300 mg廣陳皮乙酸乙酯粗提物中一次性制備分離得到了川陳皮素、3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮和橘皮素，其純度分別為96.25%、97.10%、99.22%。

2.3 大孔樹脂吸附法

大孔樹脂吸附法是利用特殊的吸附劑與陳皮中的黃酮所產(chǎn)生的范德華引力或氫鍵作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)黃酮的吸附分離，然后再通過(guò)選擇合適的溶劑將吸附在吸附劑上的黃酮物質(zhì)洗脫下來(lái)，實(shí)現(xiàn)黃酮組分的富集。

劉韶等[27]篩選陳皮中多甲氧基黃酮類的大孔樹脂純化工藝，比較了D101型和DM130型大孔樹脂對(duì)陳皮中多甲氧基類黃酮的吸附效果，結(jié)果表明D101型大孔樹脂為較佳的吸附樹脂，經(jīng)過(guò)處理后川陳皮素和橘皮素的純度分別提高了3.7倍和3.2倍。

王惠芳等[28]考察了HPD-100、HP-20、AB-8、X-5、NKA-Ⅱ五種大孔樹脂對(duì)黃酮的靜態(tài)吸附及其解吸作用并篩選了最佳吸附脫附條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HP-20大孔樹脂最適合分離純化陳皮中的黃酮，在最佳工藝條件為下黃酮回收率達(dá)64.95%。

3 陳皮提取物中化學(xué)成分定性與定量分析的方法

目前，陳皮中黃酮類化合物的定性定量分析方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等。因?yàn)樽贤夥止夤舛确ǖ膶傩暂^差，所以應(yīng)用并不廣泛。HPLC法具有分析快速，分離高效，檢測(cè)靈敏等特點(diǎn)，王健芬[29]利用HCLP法測(cè)定橙皮苷含量，平均回收率分別為100.90%和99.25%，RSD分別為0.16%和1.20%高效液相色譜法在黃酮類化合物含量測(cè)定方面的應(yīng)用較多。

王文昌等[30]利用超高效液相色譜法快速測(cè)定了陳皮及其提取物中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷4種黃酮類化合物的含量，與常規(guī)方法不同的主要是其流動(dòng)相的組成，該方法中使用的流動(dòng)相為17∶83的乙腈-1%乙酸溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明精密度和準(zhǔn)確度均較好。

李穎詩(shī)[31]UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)，通過(guò)對(duì)得到的高分陳皮提取物的高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜總離子流色譜圖進(jìn)行分析，最終鑒定出50個(gè)化學(xué)成分，其中主要成分為甲氧基黃酮及其同分異構(gòu)體物質(zhì)。

4 結(jié) 語(yǔ)

陳皮作為中國(guó)的傳統(tǒng)中藥材之一中含有豐富的黃酮的物質(zhì)并且組成復(fù)雜，目前研究較多的仍是混合黃酮成分的提取，而對(duì)高效且適于工業(yè)化的分離純化方法研究較少，而如果要對(duì)陳皮中黃酮物質(zhì)的具體化學(xué)組分、結(jié)構(gòu)研究及其活性進(jìn)行深入研究仍需對(duì)其分離純化方法、工藝以及定性定量分析方法等進(jìn)一步研究?jī)?yōu)化。