基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的黨參抗氧化損傷研究

廖江敏，朱 彤，楊雪峰,2，冷崇姣,2，楊軍宣*

1重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016；2重慶市永川食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 402160

黨參為桔梗科植物黨參Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.、素花黨參CodonopsispilosulaNannf.var.modesta(Nannf.) L.T.Shen或川黨參CodonopsistangshenOliv.的干燥根[1]。黨參是我國(guó)常用的一種補(bǔ)益類(lèi)中藥，主要含有糖類(lèi)、生物堿類(lèi)、聚炔類(lèi)、苷類(lèi)及萜類(lèi)等成分，具有調(diào)節(jié)血糖、促進(jìn)造血機(jī)能、抗缺氧、抗應(yīng)激、抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、延緩衰老、調(diào)節(jié)胃收縮、保護(hù)胃腸道黏膜及抗?jié)兊榷喾N藥理作用[2]。截至目前，黨參藥材缺乏性質(zhì)穩(wěn)定、具有專(zhuān)屬性且與臨床功效緊密關(guān)聯(lián)的標(biāo)志性活性成分研究，這也成為制約黨參藥材全面質(zhì)量控制的瓶頸。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中藥復(fù)雜體系研究提供了強(qiáng)有力的方法和工具，該方法應(yīng)用于中藥復(fù)方配伍規(guī)律的闡釋、活性成分篩選、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及作用機(jī)制研究等，取得了一系列研究進(jìn)展[3-5]。但是，目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍然面臨一些挑戰(zhàn)，例如采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)針對(duì)疾病篩選出的活性成分并非是中藥材現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的主要質(zhì)控成分或藥材中含量較高的成分，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)表明，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得到的部分成分在原藥材或原復(fù)方中含量較低[6]。所以為了尋找更有價(jià)值的黨參活性成分，本文通過(guò)查閱文獻(xiàn)，查找黨參中可HPLC分析的多種成分，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以“氧化應(yīng)激”為檢索詞，對(duì)多個(gè)單體進(jìn)行抗氧化應(yīng)激的主要作用機(jī)理的探討；并以H2O2誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞為模型，驗(yàn)證黨參中活性成分的抗氧化作用，為黨參藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件

PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；Swiss Target Prediction(http://swisstarget prediction.ch/)網(wǎng)站；CTD比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(CTD，Comparative Toxicogenomics Database，https://ctdbase.org)；Metascape(http://metascape.org)；STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)；Cytoscape3.8.0軟件。

1.2 細(xì)胞株

小鼠RAW 264.7巨噬細(xì)胞株，購(gòu)自重慶金喜鵲科技發(fā)展有限公司，實(shí)驗(yàn)室液氮罐長(zhǎng)期保存。

1.3 儀器與試劑

Synergy HTX全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：1609131B)；低溫高速離心機(jī)(杭州奧盛儀器公司，型號(hào)：ICEN-24R)；低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器公司，型號(hào)：TGL-16M)；超凈水產(chǎn)生系統(tǒng)儀器(重慶奧思德儀器設(shè)備公司，型號(hào)：AS-S20-R)；梯度PCR儀(美國(guó)Bio-rad公司，型號(hào)：CFX ConnectTMOptics Module)；NANODROP 2000 微量核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó) Bio Tek 公司，型號(hào)：P6730)。

黨參炔苷、紫丁香苷、L-色氨酸(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)分別為：wkq21041905、wkq21022507、wkq21050607，≥98%)；胎牛血清(FBS，北美維森特，批號(hào)：086110054)；DMEM(美國(guó)Gibco，批號(hào)：8121295)；雙抗(上海碧云天，批號(hào)：C022)；無(wú)血清凍存液(中國(guó)新賽美，批號(hào)：C40100)；CCK-8(北京金克隆，批號(hào)：20210531)；引物(北京擎科，批號(hào)：TSC0004)；Steady Pure快速RNA提取試劑盒(中國(guó)艾科瑞，批號(hào)：A3A0944)；M5 Super plus qPCR RT kit-with gDNA remover Ta KaRa(北京聚合美，批號(hào)：MF166-plus-T)；2X M5 HiPer SYBRP remix EsTaq(北京聚合美，批號(hào)：MF787-T)；BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天，批號(hào)：P0010)；Nrf2抗體(核因子紅系2相關(guān)因子2，ABclonal，批號(hào)：A1244)；Keap1抗體(樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1，ABclonal，批號(hào)：A1820)；二抗(武漢三鷹，批號(hào)：SA00001-1)；GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，ABclonal，批號(hào)：AC033)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(蘇州格銳思生物，批號(hào)：G0109F)；過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒(蘇州格銳思生物，批號(hào)：G0105F)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(蘇州格銳思生物，批號(hào)：G0101F)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(蘇州格銳思生物，批號(hào)：G0204W)。

1.4 方法

1.4.1 Swiss target prediction預(yù)測(cè)10個(gè)單體靶蛋白

通過(guò)PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)查找黨參炔苷、紫丁香苷、黨參苷 Ⅰ、心葉黨參炔苷A、黨參炔醇、黨參炔苷寧、L-色氨酸、管花黨參堿B、管花黨參堿A、心葉黨參炔苷B 10個(gè)單體的Canonical SMILES式，分別導(dǎo)入Swisstarget prediction網(wǎng)站，選擇Homo sapiens預(yù)測(cè)其所有蛋白靶點(diǎn)。

1.4.2 氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白靶點(diǎn)查找

CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“oxidative stress”為檢索詞，在線(xiàn)獲取包括Genes、Go Terms和Pathways所涉及的所有氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4.3 蛋白互作分析

將取交集后的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為人，進(jìn)行蛋白互作分析，下載TSV格式文件，再導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 3.8.0的插件Network analyzer，分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置節(jié)點(diǎn)的顏色和大小來(lái)反映degree值。

1.4.4 GO富集分析

為了進(jìn)一步探討黨參中10個(gè)單體抗氧化損傷的機(jī)理，使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)交集蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，初步探索黨參中主要潛在活性成分抗氧化損傷的作用機(jī)制。

1.4.5 CCK-8檢測(cè)3個(gè)單體對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞的影響

取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞，在96孔板中，以1×104個(gè)/孔接種細(xì)胞，每孔100 μL。根據(jù)前期檢測(cè)結(jié)果，選定H2O2的干預(yù)濃度為490 μmol/L，分別設(shè)置空白調(diào)零孔組、空白對(duì)照組、H2O2組、H2O2+黨參炔苷(100、200 μmol/L)組、H2O2+紫丁香苷(100、200 μmol/L)組、H2O2+L-色氨酸(100、200 μmol/L)組，種板同時(shí)分別加相應(yīng)濃度的黨參炔苷、紫丁香苷、L-色氨酸預(yù)處理24 h。每組6個(gè)復(fù)孔。24 h后，向每孔(除空白調(diào)零孔、空白對(duì)照組外)，其余組均加入490 μmol/L的H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。24 h后，吸掉舊含H2O2培養(yǎng)基，加入10%的含CCK-8的新鮮培養(yǎng)基100 μL，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h。避光條件下取出孔板，打開(kāi)酶標(biāo)儀設(shè)置相關(guān)檢測(cè)參數(shù)，進(jìn)行吸光度檢測(cè)(A)。最后根據(jù)所得結(jié)果計(jì)算各組細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As實(shí)驗(yàn)孔，Ac對(duì)照孔，Ab空白孔。重復(fù)3次以上實(shí)驗(yàn)步驟。

1.4.6 抗氧化酶活性測(cè)定

取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞，在6孔板中，以2.5×105/mL，每孔2 mL進(jìn)行種板。種板同時(shí)用黨參炔苷(100、200 μmol/L)、紫丁香苷(100、200 μmol/L)、L-色氨酸(100、200 μmol/L)分別刺激RAW 264.7細(xì)胞24 h(除H2O2組和空白對(duì)照組外)。然后將H2O2組和黨參炔苷(100、200 μmol/L)、紫丁香苷(100、200 μmol/L)、L-色氨酸(100、200 μmol/L)處理組分別暴露于H2O2(490 μmol/L)24 h。24 h后，用1 mL/孔PBS洗細(xì)胞2次，再加2 mL/孔PBS分別收集細(xì)胞于5 mL EP管中，用一次性PU手套包著于液氮和37 ℃水浴鍋反復(fù)凍融5次，再4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清于1.5 mL EP管中，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用試劑盒測(cè)定細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px和MDA的活性。

1.4.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞，在6孔板中，以2.5×105/mL，每孔2 mL進(jìn)行種板。細(xì)胞分組與加藥同“1.4.5”，在加藥干預(yù)完成后，根據(jù)各試劑盒說(shuō)明書(shū)依次提取RNA；測(cè)RNA濃度、逆轉(zhuǎn)錄；擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn)，根據(jù)Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，重復(fù)3次。

1.4.8 蛋白質(zhì)印跡分析

選取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，細(xì)胞分組與加藥同“1.4.5”，用50 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)各組別細(xì)胞，在加藥干預(yù)完成后，按照BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟測(cè)定各蛋白濃度，蛋白定量后，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用TBS漂洗PVDF膜5 min后放入封閉液中，4 ℃孵育一抗(Nrf2、Keap1、GAPDH稀釋比例為1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000)，置于搖床上過(guò)夜且平緩搖動(dòng)。置于搖床上室溫平緩搖動(dòng)2 h進(jìn)行二抗孵育(稀釋比例1∶2 500)，化學(xué)發(fā)光、顯影，定影并拍攝膠片。

2 結(jié)果

2.1 10個(gè)單體預(yù)測(cè)靶蛋白

10個(gè)單體共預(yù)測(cè)到214個(gè)靶點(diǎn)，如圖1中綠色節(jié)點(diǎn)所示。其中心葉黨參炔苷A、管花黨參堿B在PubMed中沒(méi)有收載其化學(xué)式，黨參苷 Ⅰ 在Swiss Target Prediction中沒(méi)有預(yù)測(cè)到靶點(diǎn)。黨參炔苷預(yù)測(cè)到8個(gè)靶點(diǎn)，紫丁香苷31個(gè)，心葉黨參炔苷B 8個(gè)，L-色氨酸49個(gè)，黨參炔醇84個(gè)，管花黨參堿A 32個(gè)，黨參炔苷寧1個(gè)。如圖1所示。其中紅色代表黨參炔苷(lobetyolin)、L-色氨酸(L-tryptophan)、紫丁香苷(syringin)、心葉黨參炔苷B(cordifolioidyne B)、黨參炔醇(lobetyol)、管花黨參堿A(codonopyrrolidium A)、黨參炔苷寧(lobetyolinin)共7個(gè)單體。

圖1 單體預(yù)測(cè)靶點(diǎn)Fig.1 Monomers target prediction

2.2 氧化應(yīng)激相關(guān)靶蛋白

在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)881個(gè)。包括：直接獲得的24個(gè)；通過(guò)42個(gè)GO Terms條目獲得蛋白857個(gè)。

2.3 蛋白互作分析

黨參7個(gè)單體預(yù)測(cè)蛋白靶點(diǎn)與氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白靶點(diǎn)取交集后得到33個(gè)交集靶點(diǎn)(見(jiàn)表1)。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置“Highest confidence 0.9”，對(duì)交集蛋白靶點(diǎn)作蛋白互作分析后，得到蛋白相互作用關(guān)系圖，其中TACR1、ADA和CAMKK2與輸入的其他蛋白靶點(diǎn)之間沒(méi)有相互作用，隱藏沒(méi)有連接Nrf2 and Keap1 protein expression levels的靶點(diǎn)，余25個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中MMP9、MMP3、MMP2與其他蛋白靶點(diǎn)不存在相互作用，故刪除，還剩22個(gè)節(jié)點(diǎn)，將下載的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖2)。圖中節(jié)點(diǎn)表示交集蛋白靶點(diǎn)個(gè)數(shù)，邊表示各靶點(diǎn)之間的關(guān)系。如圖所示，共有節(jié)點(diǎn)22個(gè)，邊49條。

表1 黨參中7個(gè)單體抗氧化應(yīng)激靶蛋白Table 1 Seven monomeric anti-oxidative stress target protein sin Codonopsis Radix

續(xù)表1(Continued Tab.1)

利用Cytoscape 3.8.0，分析網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的Degree值，用節(jié)點(diǎn)的大小和顏色深淺來(lái)反映degree值的大小，degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大、節(jié)點(diǎn)顏色越由淺紫色接近深紫色。由圖2可知，基因AKT1、CASP3、APP、MAPK1、MAPK8、MAPK3、LCK等聯(lián)系緊密。

圖2 交集靶蛋白的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Protein-protein interaction network of intersecting target proteins

2.4 GO富集分析

為繼續(xù)探究黨參中潛在活性單體抗氧化損傷的作用機(jī)制，利用Metascape平臺(tái)將7個(gè)單體氧化應(yīng)激蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中33個(gè)靶蛋白，進(jìn)行GO富集分析。展示(P<0.01)前20個(gè)富集結(jié)果(見(jiàn)圖3)。

圖3 GO富集分析(FDR<0.01)Fig.3 Go enrichment analysis(FDR<0.01)

GO富集分析的結(jié)果表明，共涉及到生物過(guò)程的條目有20個(gè)：細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞死亡的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化的調(diào)節(jié)、蛋白水解的調(diào)節(jié)、酶聯(lián)受體、蛋白信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、細(xì)胞定位的調(diào)節(jié)、凋亡信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、肽的正向調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)、造血或淋巴器官發(fā)育、細(xì)胞組織的正向調(diào)節(jié)、對(duì)激素的反應(yīng)、對(duì)紫外線(xiàn)的反應(yīng)、肽基絲氨酸修飾、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)、腺體發(fā)育、對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)、調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖。共涉及的分子功能條目有14個(gè)，其中與結(jié)合相關(guān)的條目有8個(gè)，有泛素蛋白連接酶結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)N末端結(jié)合、血紅素結(jié)合、鈣調(diào)素結(jié)合。涉及與活性相關(guān)6個(gè)條目，有蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、內(nèi)肽酶活性、MAP激酶活性、酶激活劑活性、組蛋白激酶活性。涉及細(xì)胞組分7個(gè)條目，包括胞質(zhì)溶膠和細(xì)胞質(zhì)部分等。膜筏、囊泡腔、中心體、突觸后、內(nèi)吞囊泡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、質(zhì)膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的外在成分。

2.5 CCK-8檢測(cè)3個(gè)單體對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞的影響

由圖4可知，與空白組(Con)對(duì)照相比，模型組(H2O2)490 μmol/L干預(yù)24 h后，細(xì)胞增殖明顯抑制(P<0.01)。黨參炔苷、L-色氨酸、紫丁香苷分別100、200 μmol/L均可抵抗H2O2對(duì)RAW 264.7細(xì)胞的抑制(P<0.05)。

圖4 3個(gè)單體對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞的影響Fig.4 Effects of three monomers on H2O2 induced RAW 264.7 cells注：Con為空白組；H2O2為模型組；A、B分別為黨參炔苷100、200 μmol/L+ H2O2；C、D分別為L(zhǎng)-色氨酸100、200 μmol/L+ H2O2；E、F分別為紫丁香苷100、200 μmol/L+ H2O2；與H2O2組相比，*P<0.05， ***P<0.001，下同。Note:Con is the blank group,H2O2 is the model group group;A,B are lobetyolin 100 and 200 μmol/L + H2O2,respectively;C,D are L-tryptophan 100 and 200 μmol/L + H2O2,respectively;E,F are syringin 100 and 200 μmol/L + H2O2,respectively;Compared with H2O2 group,*P<0.05,***P<0.001,the same below.

2.6 抗氧化酶活性測(cè)定

由圖5a、5b可知，與空白對(duì)照組比較，H2O2干預(yù)24 h后，CAT、GSH-Px含量明顯降低(P<0.01)，與H2O2組相比，黨參炔苷100、200 μmol/L、L-色氨酸100 μmol/L、紫丁香苷100、200 μmol/L組的CAT、GSH-Px活性顯著增加(P<0.001)，而L-色氨酸200 μmol/L無(wú)明顯影響。如圖5c所示，與空白對(duì)照相比，在H2O2處理24 h后，MDA水平顯著上升(P<0.01)，與H2O2組相比，黨參炔苷100、200 μmol/L、L-色氨酸100、200 μmol/L、紫丁香苷100、200 μmol/L均可顯著降低H2O2引起MDA升高(黨參炔苷100 μmol/L組P<0.05，其他組P<0.001)。如圖5d所示，與空白對(duì)照相比，在H2O2處理24 h后，SOD水平顯著下降(P<0.01)，與H2O2組相比，黨參炔苷100、200 μmol/L、L-色氨酸100、200 μmol/L、紫丁香苷100、200 μmol/L均可顯著提高H2O2引起SOD降低(P<0.001)。

圖5 抗氧化酶活力Fig.5 Antioxidant enzyme activity

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

如圖6所示，與空白組相比，在H2O2干預(yù)24 h后，H2O2組Keap1(樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1)、Nrf2(核因子紅系2相關(guān)因子2)、NQO1(醌氧化還原酶)、HO-1(血紅素加氧酶1)、GCLM(谷氨酸-半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基)、GCLC(谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基)的mRNA表達(dá)水平均提高(P<0.01)，黨參炔苷100、200 μmol/L，L-色氨酸100 μmol/L、紫丁香苷100 μmol/L均可顯著降低H2O2引起的Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、GCLM、GCLC的mRNA表達(dá)水平均提高(P<0.05)。紫丁香苷200 μmol/L對(duì)H2O2引起的Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、GCLM、GCLC的mRNA表達(dá)水平升高無(wú)顯著性影響。L-色氨酸200 μmol/L對(duì)H2O2引起的Keap1、Nrf2、HO-1、GCLM、GCLC的mRNA表達(dá)水平升高也沒(méi)有顯著性影響，只對(duì)H2O2引起的NQO1的mRNA表達(dá)水平升高有顯著抑制作用(P<0.001)。

圖6 Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1、GCLC、GCLM的mRNA表達(dá)水平Fig.6 mRNA expression levels of Keap1,Nrf2,NQO1,HO-1,GCLC and GCLM

2.8 蛋白質(zhì)印跡分析

由蛋白印跡分析(見(jiàn)圖7)可知，與空白對(duì)照相比，在H2O2干預(yù)24 h后，H2O2組Nrf2蛋白水平明顯下調(diào)，黨參炔苷100、200 μmol/L、L-色氨酸100、200 μmol/L、紫丁香苷100、200 μmol/L均可明顯上調(diào)H2O2引起的Nrf2蛋白水平下調(diào)。與空白對(duì)照相比，在H2O2干預(yù)24 h后，H2O2組Keap1蛋白水平均有明顯上調(diào)，黨參炔苷100、200 μmol/L、L-色氨酸100、200 μmol/L、紫丁香苷100、200 μmol/L均可明顯下調(diào)H2O2引起的Keap1蛋白水平上調(diào)。

圖7 Nrf2和Keap1蛋白表達(dá)水平Fig.7 Nrf2 and Keap1 protein expression levels

3 討論與結(jié)論

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，心葉黨參炔苷A、管花黨參堿B在PubMed中沒(méi)有收載其化學(xué)式，黨參苷Ⅰ 在Swiss Target Prediction中沒(méi)有預(yù)測(cè)到靶點(diǎn)，黨參炔苷寧1個(gè)。10個(gè)單體中可能有抗氧化作用的成分為：黨參炔苷、紫丁香苷、心葉黨參炔苷B、L-色氨酸、黨參炔醇、管花黨參堿A。而黨參炔苷、黨參炔苷寧、黨參炔醇、心葉黨參炔苷 B同屬于黨參炔烯類(lèi)成分[2]，紫丁香苷為苯丙素類(lèi)成分[7]，L-色氨酸、管花黨參堿A為生物堿類(lèi)成分[7]。本文選擇黨參炔烯類(lèi)成分中黨參炔苷，苯丙素類(lèi)成分中紫丁香苷，生物堿類(lèi)成分中L-色氨酸為代表，針對(duì)Nrf2-Keap1信號(hào)通路進(jìn)行抗氧化應(yīng)激作用的體外實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)構(gòu)建體外H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞氧化損傷模型，探討對(duì)該模型的保護(hù)作用和對(duì)Nrf2-Keap1途徑的影響。

在黨參的藥理作用中，抗應(yīng)激、延緩衰老、保護(hù)胃腸黏膜、抗疲勞和抗缺氧等與抗氧化的藥理作用有一定聯(lián)系[8-11]，所以本文以“氧化應(yīng)激”為檢索詞，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)黨參抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)理進(jìn)行探討。

黨參7個(gè)成分預(yù)測(cè)靶蛋白與氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白進(jìn)行交集后獲得33個(gè)黨參抗氧化損傷靶蛋白。對(duì)33個(gè)交集靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中AKT1、CASP3、APP、MAPK1、MAPK8、MAPK3、LCK聯(lián)系緊密。NFE2L2、KEAP1是Nrf2-Keap1途徑重要分子，而APP、CASP3、CASP6、SYK、AKT1、GSK3B、MDM2、MMP2、PARP1、HSPA8、CDK2可通過(guò)激活MAPK1/MAP2K1/MAPK3/MAPK9/MAPK8等信號(hào)通路激活Nrf2信號(hào)途徑。因此推測(cè)Nrf2-Keap1可能是黨參中潛在活性成分發(fā)揮抗氧化損傷作用的重要途徑。LCK、JAK2、EGFR這些黨參活性成分靶蛋白均與免疫炎癥關(guān)系密切，提示黨參亦可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫炎癥起到抗氧化損傷作用。GO富集分析黨參潛在活性成分抗氧化應(yīng)激33個(gè)靶蛋白，提示這些靶蛋白可能通過(guò)蛋白激酶活性、藥物結(jié)合、核苷酸結(jié)合等分子功能，以及細(xì)胞對(duì)含氧化合物的反應(yīng)和調(diào)控細(xì)胞生物過(guò)程發(fā)揮抗氧化損傷作用。

在體外實(shí)驗(yàn)的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，篩選出490 μmol/L H2O2作為后期干預(yù)濃度，且發(fā)現(xiàn)100、200 μmol/L的黨參炔苷、L-色氨酸、紫丁香苷干預(yù)24 h對(duì)RAW 264.7細(xì)胞增殖均無(wú)明顯影響，故后期使用100、200 μmol/L的黨參炔苷、L-色氨酸、紫丁香苷作為實(shí)驗(yàn)濃度。

He等[12]對(duì)黨參中黨參炔苷和紫丁香苷進(jìn)行了含量測(cè)定，分別為404.71±5.90、25.23±0.21 μg/g。Gao[13]分別對(duì)烘干、曬干和陰干黨參中黨參炔苷、紫丁香苷、L-色氨酸含量進(jìn)行了測(cè)定，分別為：黨參炔苷1134.7、1581.3、1985.7 μg/g，紫丁香苷7.3、27.6、121.6 μg/g，L-色氨酸96.9、135.0、148.7 μg/g。說(shuō)明黨參中黨參炔苷、紫丁香苷、L-色氨酸含量均可定量。

綜上所述，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)黨參中主要潛在活性成分抗氧化應(yīng)激的主要機(jī)制，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了其中代表性成分黨參炔苷、L-色氨酸、紫丁香苷對(duì)H2O2作用的RAW 264.7細(xì)胞的影響，研究結(jié)果為黨參藥材、飲片及制劑的質(zhì)量控制提供參考。