不同煎煮時間下六味地黃方粉末飲片與傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜和多成分含量比較 Δ

吳磊 ，劉玉平 ，陸超 ，束雅春 （.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南京 009；.中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京 98）

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷進步和發(fā)展，中藥飲片也出現(xiàn)了多種有別于傳統(tǒng)飲片的用藥形式，諸如配方顆粒[1]、精制飲片[2]、粉末飲片[3]等，這些新出現(xiàn)的飲片用藥形式具有一定積極的臨床意義，是對中藥傳統(tǒng)飲片的有益補充。中藥粉末飲片因具有節(jié)省藥材資源、配伍靈活、防止處方外泄等特點被廣泛應(yīng)用?！吨袊幍洹芬约案魇〖壷兴庯嬈谥埔?guī)范中收載的中藥粉末飲片日益增多[4]，部分省份的炮制規(guī)范中甚至還收載了中藥超微粉末飲片、中藥破壁粉末飲片等新規(guī)格[4]。然而，我國并未對中藥粉末飲片的適用范圍、適宜粒徑、制備工藝、質(zhì)量控制等內(nèi)容作出詳細的規(guī)定，也未制定統(tǒng)一的標準，難以保障中藥粉末飲片的質(zhì)量[5]。臨床以粉末飲片替代傳統(tǒng)飲片使用時，該如何調(diào)整劑量、如何選擇適宜粒徑和穩(wěn)定煎煮工藝從而保證其生物等效性和安全性，是迫切需要研究的問題，也是創(chuàng)新中藥飲片用藥形式的關(guān)鍵科學(xué)問題[6]。

六味地黃方為中醫(yī)經(jīng)典的“滋補腎陰”方，由熟地黃、酒萸肉、山藥、牡丹皮、澤瀉和茯苓組成，具有滋陰補腎、抗衰老的作用[7]。在臨床使用中，六味地黃方有多種劑型，傳統(tǒng)的有飲片煎煮的六味地黃湯和全方打粉或部分飲片煎煮制成的水丸和濃縮丸。不同劑型的用藥形式差異較大，這是否會影響該方的安全性和有效性尚不明確。鑒于此，本研究基于“成分反映活性，活性指向功效”的中藥質(zhì)量控制研究思路，比較不同煎煮時間下六味地黃方粉末飲片和傳統(tǒng)飲片（后文簡稱為“粉末飲片”“傳統(tǒng)飲片”）提取液的指紋圖譜以及8個指標成分的變化規(guī)律，為合理制定其現(xiàn)代煎煮工藝提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、AR2140型萬分之一天平（上海奧豪斯儀器有限公司）、YF-103B型高速中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）、XH-C型旋渦混合器（金壇區(qū)西城新瑞儀器廠）。

1.2 主要藥品與試劑

熟地黃（產(chǎn)地河南，批號220102）、酒萸肉（產(chǎn)地河南，批號220101）、山藥（產(chǎn)地河南，批號211102）、牡丹皮（產(chǎn)地安徽，批號211202）均購于馬鞍山井泉中藥飲片有限公司，茯苓（產(chǎn)地云南，批號20211201-02）、澤瀉（產(chǎn)地四川，批號20211201-01）均購于貴州同德藥業(yè)股份有限公司，以上飲片由江蘇省中醫(yī)院主任中藥師周繼發(fā)鑒定均為真品。對照品5-羥甲基糠醛（批號210511，純度98%）、苯甲酰芍藥苷（批號201207，純度98%）、馬錢苷（批號210513，純度98%）、獐芽菜苷（批號211211，純度98%）、丹皮酚（批號201110，純度98%）、莫諾苷（批號210822，純度98%）、二氫槲皮素（批號210310，純度98%）、兒茶素（批號210416，純度98%）均購于南京聚康醫(yī)藥化工有限公司；磷酸為分析純，甲醇為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Supersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～5 min，5%A→7%A；5～15 min，7%A→10%A；15～25 min，10%A→20%A；25～50 min，20%A→23%A；50～80 min，23%A→32%A；80～120 min，32%A→54%A）；檢測波長為230 nm；柱溫為35 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別取5-羥甲基糠醛、兒茶素、莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、二氫槲皮素、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷對照品各適量，置于同一25 mL容量瓶中，加甲醇制成各對照品質(zhì)量濃度分別為200.000、11.750、247.000、29.380、93.600、25.080、96.100、25.000 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 不同煎煮時間傳統(tǒng)飲片供試品溶液的制備 稱取六味地黃方1日劑量（熟地黃20 g、酒萸肉10 g、牡丹皮10 g、山藥10 g、茯苓7.5 g、澤瀉7.5 g），置于陶瓷藥罐中，加入8倍量水（mL/g，下同），浸泡60 min后取樣（S1）；用電磁爐武火加熱煎煮，沸騰后（即煮沸0 min）立即取樣（S2）；調(diào)節(jié)電陶爐功率保持微沸，于頭煎煮沸5、10、15、20、25、30、40、50、60 min時取樣2 mL，分別記為S3～S11；于二煎（頭煎后的濾渣繼續(xù)加7倍量水煎煮）5、10、20、30、40 min時分別取樣2 mL，分別記為S12～S16。每次取樣后，于陶瓷藥罐中加水補足減失的體積。將取樣液在蒸發(fā)皿中水浴蒸干，再用甲醇溶解，定容至2 mL，以0.45 μm微孔濾膜濾過，收集濾液，即得傳統(tǒng)飲片供試品溶液。

2.3.2 不同煎煮時間粉末飲片供試品溶液的制備 稱取六味地黃方1日劑量（同“2.3.1”項下），用高速中藥粉碎機粉碎成最粗粉（粉末飲片并未對粉碎的粒徑進行規(guī)定，但前期本課題組研究發(fā)現(xiàn)六味地黃方中粉及以下粒徑粉末在煎煮過程中會形成黏稠的膠狀物，難以過濾），置于陶瓷藥罐中煎煮，按照“2.3.1”項下的方法取樣（樣品依次記為T1～T16）并制備成粉末飲片供試品溶液。

2.4 不同煎煮時間傳統(tǒng)飲片和粉末飲片的化學(xué)特征指紋圖譜分析

2.4.1 精密度試驗 精密量取同一供試品溶液（樣品S9）10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。以獐芽菜苷為參照峰計算得各共有峰相對保留時間的RSD＜1.2%（n＝6），相對峰面積的RSD＜1.5%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 精密量取同一供試品溶液（樣品S9）10 μL，分別在室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以獐芽菜苷為參照峰計算得各共有峰相對保留時間的RSD＜0.2%（n＝6），相對峰面積的RSD＜1.4%（n＝6），表明供試品溶液于室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一樣品（樣品S9）6份，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以獐芽菜苷為參照峰計算得各共有峰相對保留時間的RSD＜0.6%（n＝6），相對峰面積的RSD＜1.6%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 特征圖譜的建立及分析 分別取不同煎煮時間的粉末飲片和傳統(tǒng)飲片供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012年版）》中，分別以S1、T1的圖譜為參照圖譜，設(shè)置時間窗寬度為0.1 min，采用多點校正法進行色譜峰的自動匹配，分別生成不同煎煮時間傳統(tǒng)飲片和粉末飲片樣品的指紋圖譜（圖1、圖2）；采用中位數(shù)法分別生成傳統(tǒng)飲片和粉末飲片的對照指紋圖譜R，并以對照指紋圖譜R為參照進行相似度評價。結(jié)果顯示，在16批傳統(tǒng)飲片的圖譜中共得到5個共有峰，在16批粉末飲片的圖譜中共得到6個共有峰，2種飲片的色譜圖與各自對照指紋圖譜R的相似度均在0.98以上。

圖1 不同煎煮時間傳統(tǒng)飲片的指紋圖譜及對照指紋圖譜R

圖2 不同煎煮時間粉末飲片的指紋圖譜及對照指紋圖譜R

2.4.5 共有峰標定 通過將2種飲片的對照指紋圖譜R與混合對照品溶液的色譜圖（取“2.2”項下對照品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣測定所得）進行比對，指認共有峰。結(jié)果顯示，在傳統(tǒng)飲片指紋圖譜中，共指認出5個色譜峰，分別為5-羥基糠醛（1號峰）、莫諾苷（3號峰）、獐芽菜苷（5號峰）、二氫槲皮素（6號峰）、丹皮酚（7號峰）；在粉末飲片指紋圖譜中，共指認出6個色譜峰，分別為5-羥基糠醛（1號峰）、莫諾苷（3號峰）、獐芽菜苷（5號峰）、二氫槲皮素（6號峰）、丹皮酚（7號峰）、苯甲酰芍藥苷（8號峰）。結(jié)果見圖3。

圖3 混合對照品溶液和傳統(tǒng)飲片、粉末飲片的對照指紋圖譜R

2.5 不同煎煮時間傳統(tǒng)飲片和粉末飲片中8個指標成分的含量測定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液和“2.3”項下的2種供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，各待測成分峰與其相鄰峰間的分離度均大于 1.5，理論板數(shù)以5-羥基糠醛計大于3 000，表明本方法的系統(tǒng)適用性較好。

2.5.2 線性關(guān)系及定量限、檢測限考察 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、1.6、2.0 mL，置于2 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進行分析，以各待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。同時，精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋后按“2.1”項下色譜條件進行分析，以信噪比3∶1和10∶1時的質(zhì)量濃度分別作為檢測限和定量限。結(jié)果表明，8個待測成分均在其考察質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好（r≥0.999 0）。結(jié)果見表1。

表1 8種待測成分的線性關(guān)系及定量限、檢測限考察結(jié)果

2.5.3 精密度試驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，5-羥基糠醛、兒茶素、莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、二氫槲皮素、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD分別為2.88%、1.16%、0.73%、1.07%、1.00%、1.25%、1.27%、1.23%（n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（樣品S9），分別在室溫下放置0、4、8、12、16、24 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，5-羥基糠醛、兒茶素、莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、二氫槲皮素、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD分別為0.84%、1.35%、0.62%、1.16%、0.56%、1.04%、0.61%、0.79%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗 精密吸取同一供試品溶液（樣品S9），共6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并采用外標法計算各成分的含量。結(jié)果顯示，5-羥基糠醛、兒茶素、莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、二氫槲皮素、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷含量的RSD分別為0.70%、1.34%、0.55%、1.40%、0.51%、0.62%、0.25%、1.11%（n＝6），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收試驗 精密量取已知含量的樣品（樣品S9）1 mL，共6份，按與已知成分含量1∶1的比例加入混合對照品溶液，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用外標法計算各成分的含量并計算其加樣回收率。結(jié)果顯示，5-羥基糠醛、兒茶素、莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、二氫槲皮素、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷的平均加樣回收率分別 為 99.76%（RSD＝0.83%，n＝6）、93.03%（RSD＝0.65%，n＝6）、94.82%（RSD＝0.90%，n＝6）、95.70%（RSD＝0.92%，n＝6）、95.73%（RSD＝0.65%，n＝6）、95.30%（RSD＝0.83%，n＝6）、107.35%（RSD＝0.58%，n＝6）、106.13%（RSD＝1.45%，n＝6），表明該方法的準確度較好。

2.5.7 樣品含量測定 取不同煎煮時間的傳統(tǒng)飲片與粉末飲片樣品，分別按“2.3.1”和“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用外標法計算樣品含量，繪制含量-時間變化折線圖（圖4）。結(jié)果顯示，在頭煎過程中，前5 min內(nèi)粉末飲片中幾乎所有活性成分的煎出速率均較傳統(tǒng)飲片快；40 min后，除5-羥基糠醛和丹皮酚外，其余指標成分的含量均低于傳統(tǒng)飲片。二煎過程中，除丹皮酚和馬錢苷外，其余指標成分的含量均是粉末飲片高于傳統(tǒng)飲片；傳統(tǒng)飲片中兒茶素在頭煎中被完全煎出，而粉末飲片在二煎中依然可以檢測到。粉末飲片中8個指標成分的煎出總量與傳統(tǒng)飲片相當。

圖4 8個指標成分的含量-時間變化折線圖

3 討論

3.1 指標成分的選擇

六味地黃方為“滋補腎陰”的經(jīng)典名方，由熟地黃、酒萸肉、山藥、牡丹皮、澤瀉和茯苓組成。5-羥基糠醛為熟地黃和山茱萸的活性成分，對肝損傷及血管內(nèi)皮細胞具有保護作用[8]；兒茶素、二氫槲皮素、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷為牡丹皮的質(zhì)量標志物，其可抑制腎臟系膜細胞增殖，對糖尿病腎病模型大鼠的腎臟具有保護作用[9]；莫諾苷、馬錢苷和獐芽菜苷為山茱萸的主要活性成分，可通過調(diào)節(jié)代謝紊亂、改善氧化應(yīng)激、降低炎癥反應(yīng)等改善糖尿病腎病[10]。本研究基于“成分反映活性，活性指向功效”的中藥質(zhì)量控制研究思路，選擇5-羥基糠醛、兒茶素、莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、二氫槲皮素、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷作為考察指標，可全面反映粉末飲片與傳統(tǒng)飲片在煎煮過程中的差異。此外，據(jù)相關(guān)文獻報道，茯苓飲片中茯苓酸對腎損傷也具有干預(yù)作用[11]。本研究前期擬將茯苓酸作為考察指標，但在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，供試品溶液中無法檢出該成分。查閱文獻后發(fā)現(xiàn)，茯苓酸的穩(wěn)定性差，水煎后其結(jié)構(gòu)易被破壞[12]，故本研究最終未將其納為考察指標。

3.2 煎煮過程中粉末飲片與傳統(tǒng)飲片中各指標成分的含量變化情況

從各指標成分的含量-時間變化折線圖中可知，頭煎5 min內(nèi)，粉末飲片中幾乎所有活性成分的煎出速率均較傳統(tǒng)飲片快；頭煎40～60 min內(nèi)，除5-羥基糠醛和丹皮酚外，其余活性成分的含量均低于傳統(tǒng)飲片。粉末飲片的表面積較傳統(tǒng)飲片有所增加，理論上前者在水中化學(xué)成分的溶出應(yīng)一直高于后者[13—14]，但本研究實際結(jié)果與該理論不符。分析其中原因，筆者認為可能是因為飲片在粉碎后導(dǎo)致部分細胞破裂，煎煮過程中產(chǎn)生了大量的不溶物及較多的樹脂和黏液質(zhì)，使得水煎液的黏度增加；且增加的樹脂和黏液質(zhì)覆蓋在飲片表面，影響了藥材組織內(nèi)部與水的接觸，使得粉末飲片中的化學(xué)成分難以溶出。在二煎過程中，除丹皮酚和馬錢苷外，其余成分的含量均是粉末飲片高于傳統(tǒng)飲片，這是因為隨著滲出的樹脂和黏液質(zhì)被頭煎藥液帶走，沒有阻礙粉末飲片中化學(xué)成分的溶出，故二煎時大部分活性成分的含量均是粉末飲片高于傳統(tǒng)飲片。丹皮酚易揮發(fā)，粉碎后會導(dǎo)致該成分有所損失；馬錢苷極易溶于水，在粉末飲片中的溶出并無優(yōu)勢[15]。因此，二煎時粉末飲片中上述2個成分的含量均低于傳統(tǒng)飲片。兒茶素在中性和堿性條件下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，但其在粉末飲片二煎液中依然可以檢測到。分析其原因，筆者認為可能是打粉煎煮后，某些伴生物質(zhì)影響了湯液的pH，或者引起了兒茶素結(jié)構(gòu)的改變，提高了其穩(wěn)定性[16]。因此，對于處方中含黏液質(zhì)較多且有效成分不穩(wěn)定的飲片，在不影響療效的情況下可以考慮采用單煎法。

綜上所述，本研究通過比較六味地黃方粉末飲片與傳統(tǒng)飲片提取過程中多成分的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)六味地黃方粉末飲片化學(xué)成分整體上與傳統(tǒng)飲片相比無明顯優(yōu)勢，無法節(jié)省煎煮時間和藥材用量。