多指標綜合評分法結(jié)合正交實驗優(yōu)選黃芪-葛根藥對提取工藝Δ

王單單 ，寧萌 ，吳作敏 ，王瑞 ，金少舉 ，于曉濤 （.漯河市中心醫(yī)院藥學部，河南 漯河 46300；.漯河醫(yī)學高等?？茖W校藥理學教研室，河南 漯河 4600）

黃芪可補氣升陽、生津養(yǎng)血，其主要活性成分為皂苷類、黃酮類及多糖類化合物。研究表明，黃芪指標性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷可改善胰島素抵抗[1]；毛蕊異黃酮對糖脂代謝紊亂有一定的調(diào)節(jié)作用[2]；芒柄花黃素具有減輕氧化應(yīng)激、改善胰島素抵抗的作用[3]。葛根可生津止渴、升陽止瀉，其活性成分包括異黃酮類、三萜類及皂苷類化合物。藥理研究表明，葛根的主要活性成分葛根素可通過多種途徑降低血糖從而發(fā)揮抗糖尿病的作用[4]；葛根中的大豆苷、大豆苷元也具有改善糖尿病并發(fā)癥的作用[5—7]。黃芪、葛根配伍源于《證治匯補》中的黃芪葛根湯[8]，方中黃芪一兩、葛根五錢，葛根助黃芪以升元氣，黃芪助葛根以生津液，兩者配伍相互輔佐，可補氣健脾、生津止渴，常用于治療氣陰兩虛型糖尿病[9—11]。

前期文獻報道中關(guān)于黃芪、葛根單味藥的提取工藝研究較多[12—13]，但關(guān)于其藥對提取工藝的研究較少。為最大程度地保留黃芪-葛根藥對中多種有效物質(zhì)，從而發(fā)揮藥對的最佳作用，本研究擬通過高效液相色譜（HPLC）法同時測定黃芪-葛根藥對提取液中葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素的含量；在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以上述各成分的含量和出膏率作為評價指標，采用多指標綜合評分法結(jié)合正交實驗優(yōu)選黃芪-葛根藥對的提取工藝，以期為黃芪-葛根藥對治療糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究的主要儀器有LC-20A型HPLC儀、AUW120D型十萬分之一電子天平（日本Shimadzu公司），KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司），5810R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司），JY2002型多功能電子天平（上海衡平儀器儀表廠），DHG-9030型鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），Reference Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 主要藥品與試劑

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號DST200619-013）、葛根素對照品（批號DST191001-002）均購于成都德思特生物有限公司（純度均大于98%）；毛蕊異黃酮對照品（批號MUST-18120901）、芒柄花黃素對照品（批號MUST-19033005）、大豆苷對照品（批號 MUST-19092708）、大豆苷元對照品（批號MUST-19101107）均購于成都曼思特生物有限公司（純度均大于98%）；黃芪、葛根飲片均購于安徽美譽中藥飲片有限公司，由漯河市中心醫(yī)院藥學部于曉濤副主任中藥師鑒定分別為膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根炮制品和豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根炮制品，且均符合2020年版《中國藥典》（一部）標準；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對照品溶液的配制 精密稱取適量葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素對照品，置同一5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混合均勻，配制成上述成分質(zhì)量濃度依次為0.4、0.2、0.1、0.2、0.1、0.1 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.1.2 黃芪-葛根藥對提取液的配制 稱取黃芪10 g、葛根5 g，加120 mL水回流提取1 h并定容至150 mL，即得黃芪-葛根藥對提取液。

2.1.3 供試品溶液的配制 精密吸取“2.1.2”項下黃芪-葛根藥對提取液1 mL，置1.5 mL離心管中，以14 000 r/min離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.2 色譜條件

以Shimadzu Shimpack GIST C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱；流動相為0.1%磷酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～60 min，20%B→35%B；60～90 min，35%B→55%B；90～102 min，55%B→70%B；102～110 min，70%B→20%B；110～120 min，20%B）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為278 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1）。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于5 000。

圖1 混合對照品溶液和黃芪-葛根藥對供試品溶液的HPLC圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密移取“2.1.1”項下混合對照品溶液1 mL，用甲醇逐級稀釋，制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，再按“2.2”項下色譜條件依次進樣分析，記錄峰面積。以各對照品的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 葛根素等6個待測成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3.3 精密度試驗 取“2.1.1”項下混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素峰面積的RSD分別為1.07%、0.59%、0.62%、0.66%、0.6%、1.17%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素峰面積的 RSD 分別為 0.69%、0.32%、1.24%、0.88%、1.54%、0.66%（n＝6），表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗 按“2.1.2”“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件依次進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算各成分含量。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素含量的RSD分別為0.46%、0.21%、0.67%、2.78%、0.95%、0.22%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取已知成分含量的黃芪-葛根藥對提取液6份，每份1 mL，分別精密加入一定量的混合對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素的加樣回收率分別為102.68%、99.51%、100.73%、99.14%、100.09%、99.07%，RSD分別為0.67%、2.22%、0.47%、2.15%、1.66%、1.73%（n＝6），表明該方法準確度良好。

2.4 出膏率測定

精密量取黃芪-葛根藥對提取液30 mL置于干燥至恒質(zhì)量（M1）的蒸發(fā)皿中，95 ℃水浴蒸干后置于105 ℃烘箱中干燥4 h，取出后置于干燥器中冷卻，稱定質(zhì)量（M2），M2與M1質(zhì)量之差即為干膏粉質(zhì)量，再計算出膏率：出膏率＝干膏粉質(zhì)量/飲片質(zhì)量×100%[14]。

2.5 數(shù)據(jù)處理

利用多指標綜合評分法，將提取液中葛根素（a）、大豆苷（b）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（c）、大豆苷元（d）、毛蕊異黃酮（e）、芒柄花黃素（f）的含量及出膏率（g）作為評價指標予以量化。采用層次分析法進行分析[15—16]，根據(jù)黃芪-葛根藥對的配伍理念，評價各指標成分及出膏率在藥對配伍中的相對重要性并對各指標進行優(yōu)選排序。結(jié)果顯示，7個評價指標可分成5個層次，即葛根素＞大豆苷元＝毛蕊異黃酮葡萄糖苷＞毛蕊異黃酮＝芒柄花黃素＞大豆苷＞出膏率，形成兩兩比較的優(yōu)先判斷矩陣，其評分見表2。

表2 葛根素等7個評價指標兩兩比較的優(yōu)先判斷矩陣評分（分）

根據(jù)上述優(yōu)先判斷矩陣評分結(jié)果，葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素的含量及出膏率7個評價指標經(jīng)過層次分析法得到的權(quán)重系數(shù)分別為0.304 7、0.065 2、0.185 8、0.185 8、0.107 8、0.107 8、0.042 7，通過一致性檢驗，計算出隨機一致性比率（consistent ratio，CR）為0.01＜0.1，表明上述7個指標的優(yōu)先判斷矩陣滿足一致性要求，以上所得各指標的權(quán)重系數(shù)有效。將上述各權(quán)重系數(shù)代入下式計算綜合評分（y）：y＝（葛根素含量/葛根素含量最大值×0.304 7+大豆苷含量/大豆苷含量最大值×0.065 2+毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量/毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量最大值×0.185 8+大豆苷元含量/大豆苷元含量最大值×0.185 8+毛蕊異黃酮含量/毛蕊異黃酮含量最大值×0.107 8+芒柄花黃素含量/芒柄花黃素含量最大值×0.107 8+出膏率/出膏率最大值×0.042 7）×100，綜合評分越高表示提取條件越好。

2.6 黃芪-葛根藥對提取工藝的單因素考察

本研究選取料液比、提取次數(shù)和提取時間作為考察因素，通過多指標綜合評分法對黃芪-葛根藥對提取工藝的單因素進行考察。

2.6.1 料液比考察 稱取黃芪10 g、葛根5 g，共4份，加水[料液比分別設(shè)為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g/mL）]回流提取2次，每次1 h，合并2次提取液，定容至400 mL。按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定并代入回歸方程計算各指標成分的含量；再按“2.4”項下方法測定出膏率，然后按“2.5”項下公式計算各組的綜合評分。由圖2A可知，隨著料液比的增加，綜合評分呈上升趨勢，但當料液比為1∶10、1∶12（g/mL）時，綜合評分相差不大，故選擇料液比1∶6、1∶8、1∶10（g/mL）進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.6.2 提取次數(shù)考察 稱取黃芪10 g、葛根5 g，共4份，分別加入6倍量水回流提取，每次1 h，分別提取1、2、3、4次，合并各次提取液，并定容至400 mL。按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定并代入回歸方程計算各指標成分的含量；再按“2.4”項下方法測定出膏率，然后按“2.5”項下公式計算各組的綜合評分。由圖2B可知，綜合評分隨提取次數(shù)增加而上升，但當提取3次后繼續(xù)增加提取次數(shù)，綜合評分無明顯變化?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)實際情況，本研究選擇提取次數(shù)1、2、3次進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

2.6.3 提取時間考察 稱取黃芪10 g、葛根5 g，共4份，分別加入6倍量水回流提取2次，提取時間分別為0.5、1、1.5、2 h，合并2次提取液，定容至400 mL。按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定并代入回歸方程計算各指標成分的含量；再按“2.4”項下方法測定出膏率，然后按“2.5”項下公式計算各組的綜合評分。由圖2C可知，隨著提取時間的延長，綜合評分呈先上升后平穩(wěn)的趨勢，當提取時間為1.5 h時，綜合評分基本達到峰值，故選擇提取時間0.5、1、1.5 h進行后續(xù)工藝優(yōu)化。

圖2 黃芪-葛根藥對提取工藝優(yōu)選的單因素考察結(jié)果

2.7 正交實驗篩選黃芪-葛根藥對提取工藝

基于單因素的考察結(jié)果，以料液比（A）、提取時間（B）、提取次數(shù)（C）為考察因素，每個因素設(shè)置3個水平（表3），以提取液中葛根素（a）、大豆苷（b）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（c）、大豆苷元（d）、毛蕊異黃酮（e）、芒柄花黃素（f）的含量及出膏率（g）為評價指標，稱取黃芪10 g、葛根5 g，共9份，按照L9（34）正交表設(shè)計實驗，按“2.2”項下色譜條件測定黃芪-葛根藥對提取液中各成分的含量，按“2.4”項下方法測定出膏率。正交實驗結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

表3 黃芪-葛根藥對提取工藝優(yōu)選的正交實驗的因素水平

表4 黃芪-葛根藥對提取工藝優(yōu)選的正交實驗結(jié)果

表5 正交實驗結(jié)果的方差分析結(jié)果

由表4可知，各因素對黃芪-葛根藥對提取工藝的影響順序為C＞A＞B，且A3＞A2＞A1、B3＞B2＞B1、C3＞C2＞C1；由表5可知，因素C對黃芪-葛根藥對提取工藝的結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），而因素A、B均無顯著影響（P＞0.05）。結(jié)合考慮綜合評分和生產(chǎn)實際因素，最終確定黃芪-葛根藥對的最佳提取工藝為A2B2C3，即加8倍量水加熱回流提取3次，每次1 h。

2.8 工藝驗證實驗

為進一步確定黃芪-葛根藥對提取工藝的可靠性與穩(wěn)定性，稱取黃芪10 g、葛根5 g，共3份，按上述優(yōu)選工藝平行提取3份黃芪-葛根藥對提取液進行驗證試驗，結(jié)果見表6。由表6可知，3組試驗各評價指標的RSD均小于3.00%，說明該工藝合理、穩(wěn)定、重現(xiàn)性較好。

表6 黃芪-葛根藥對最優(yōu)提取工藝驗證實驗結(jié)果

3 討論

黃芪-葛根藥對來源于《證治匯補》中的黃芪葛根湯[8]，方中黃芪、葛根皆可升陽，但黃芪以補氣為主，葛根側(cè)重生津，兩者相伍可補氣健脾、生津止渴。本研究按照黃芪-葛根藥對2∶1的質(zhì)量比進行實驗，選擇葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素的含量及出膏率為評價指標，優(yōu)選了該藥對的提取工藝。

葛根素化學結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，顯酸性，易電離[17]，故本研究在建立HPLC法時，對流動相考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相的分離效果好。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的最大吸收波長為260 nm，葛根素和大豆苷元的最大吸收波長為250 nm，但無論是250 nm還是260 nm波長處的干擾峰均較多，經(jīng)全波長（190～800 nm）掃描，發(fā)現(xiàn)在278 nm波長處樣品中各待測成分的峰形較好、響應(yīng)值較高，故選擇278 nm為檢測波長。

本研究通過單因素實驗考察料液比、提取次數(shù)、提取時間對黃芪-葛根藥對中指標成分含量及出膏率的影響，并結(jié)合單因素考察結(jié)果設(shè)計正交實驗對黃芪-葛根藥對水回流提取工藝進行優(yōu)化，優(yōu)選出料液比1∶8（g/mL）、加熱回流3次、每次1 h為最佳提取工藝，且驗證實驗結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定、可行。

黃芪可通過多種途徑發(fā)揮抗糖尿病的作用，其指標性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷可通過調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂改善胰島素抵抗[1]；毛蕊異黃酮可通過抗炎、恢復(fù)胰島素信號轉(zhuǎn)導以及增加胰島β細胞功能等途徑減輕胰島素抵抗，維持糖脂代謝穩(wěn)態(tài)[2]；芒柄花黃素可通過改善胰島素抵抗、減輕氧化應(yīng)激等作用，降低2型糖尿病模型大鼠的血糖水平，并減輕其糖尿病腎病癥狀[3]。葛根為治療糖尿病最常用的藥物之一?，F(xiàn)代藥理學研究表明，葛根素可通過促進胰島β細胞的新生并抑制其凋亡、促進葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種途徑降低血糖和改善糖尿病并發(fā)癥，從而發(fā)揮抗糖尿病的作用[4]；大豆苷有助于維持糖尿病模型小鼠的葡萄糖穩(wěn)態(tài)[5]；大豆苷元可減輕糖尿病模型大鼠的心肌損傷[6]，并能改善糖尿病視網(wǎng)膜病變[7]。由此可知，黃芪、葛根中的有效成分葛根素、大豆苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、大豆苷元、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素均有助于改善糖尿病及其并發(fā)癥[1—7]。本研究通過優(yōu)選黃芪-葛根藥對的提取工藝，提高了該藥對中上述6種指標成分的含量，有助于促進該藥對發(fā)揮抗糖尿病的藥效作用。本研究結(jié)果還有利于后期對含該藥對復(fù)方的拆方研究，使之更好地應(yīng)用于臨床糖尿病的治療。