八味沉香散含藥血清對(duì)H9c2細(xì)胞氧糖剝奪損傷的保護(hù)機(jī)制研究 Δ

宮佰會(huì)，岳棟芳，李彩霞，官敏，李永芳 （青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001）

心肌缺血是心血管系統(tǒng)的常見(jiàn)病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康，臨床迫切需要安全有效的藥物防治心肌缺血。八味沉香散是中國(guó)傳統(tǒng)藏藥復(fù)方之一，其源于藏族醫(yī)藥經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》。該復(fù)方由沉香200 g、肉豆蔻100 g、廣棗100 g、石灰華100 g、乳香100 g、木香100 g、訶子（煨）100 g、木棉花100 g組成，氣芳香，味咸、澀、微苦，具有清心熱、養(yǎng)心、安神、開(kāi)竅之功效，主要用于熱病攻心、神昏譫語(yǔ)，臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛等[1]。作者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，八味沉香散能夠降低由于冠狀動(dòng)脈結(jié)扎引起的心肌缺血再灌注損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)[2—4]。不同方式的八味沉香散提取液對(duì)異丙腎上腺素、垂體后葉素導(dǎo)致的大鼠心肌收縮功能和舒張功能的下降[4—6]、心電圖 J點(diǎn)位移的程度[2，7]等均有顯著的改善作用，可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)并促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)等[8]。血清藥物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，給予八味沉香散后大鼠血清中共鑒定出16種非揮發(fā)性成分、24種揮發(fā)性成分，其中30種為原型化合物的入血成分[9]。本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法，進(jìn)一步研究在氧糖剝奪損傷細(xì)胞模型中，八味沉香散含藥血清改善心肌缺血損傷的可能機(jī)制，以期為八味沉香散的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，促進(jìn)其現(xiàn)代化研究。

1 材料

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物

本研究所用細(xì)胞為大鼠H9c2細(xì)胞（貨號(hào)CL-0089），購(gòu)自武漢普諾塞生命科技有限公司。SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（青）2020-0001]，飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系實(shí)驗(yàn)中心（正常光照、自由飲食）。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求，并通過(guò)青海大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)2021-01）。

1.2 主要儀器

本研究所用主要儀器有SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），51119770DP型酶標(biāo)儀、Pico21型臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），DMi8型熒光顯微鏡、DMi1型倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司），Amersham Imager 600型顯影儀（美國(guó)通用電氣公司），CytoFLEX S型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.3 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品為八味沉香散，購(gòu)自西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司（批號(hào)20210601），由西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司進(jìn)行分析與鑒定，符合2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中的要求。用蒸餾水將八味沉香散配制成0.5、0.7、0.8 g/mL的混懸液，備用。

本研究所用主要試劑為胎牛血清（上海依科賽生物制品有限公司，批號(hào)FSP500），DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)分別為WH0521A291、WH0021D231），RIPA裂解液、青霉素鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖液（PBS）（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為R0010、P1400、20201219），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20201225），肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二 醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒和線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ（respiratory chain complexⅠ，ComplexⅠ）試劑盒（上?？婆d商貿(mào)有限公司，批號(hào)分別為 F3651-A、F3262-A、F8503-A、F8502-A、F3642-A、F40416-A），BCA蛋白定量試劑盒、Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為P0009、C1062L、C2003S），2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧（reactive oxygen species，ROS）熒光探針（德國(guó)Sigma公司，批號(hào)4091990），兔源凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphomaz，Bcl-2）相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、胱天蛋白酶3（Caspase-3）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cytc）抗體（美國(guó)CST公司，批號(hào)分別為2772T、14220T、11940S），兔源核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體、Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelch ECH association protein 1，Keap1）抗體、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）抗體、硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）抗體、抗凋亡蛋白Bcl-2抗體（美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為ab92946、ab139729、ab68477、ab109385、ab196495），NADH 氧化還 原酶輔酶 10（NADH oxidoreductase coenzyme 10，Ndufa10）抗體（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)336BEA22），內(nèi)參兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)236601-1-AP），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗IgG二抗、SuperECL Plus超敏發(fā)光液、CCK-8試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為E-AB-1004、E-IR-R308、E-CK-A362）。

2 方法

2.1 八味沉香散含藥血清的制備

將50只大鼠隨機(jī)分為空白血清組（20只）和八味沉香散低、中、高劑量組（每組10只），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。根據(jù)藥品說(shuō)明書(shū)劑量和動(dòng)物體表面積劑量換算公式換算，八味沉香散灌胃劑量為：低劑量2.5 g/kg，中劑量8 g/kg，高劑量12 g/kg（以每日人用劑量進(jìn)行換算作為低劑量，以該劑量約3倍、5倍作為中、高劑量），空白血清組大鼠灌胃等量生理鹽水，每日3次，共10 d。在末次給藥30 min后腹主動(dòng)脈取血，于4 ℃冰箱中靜置2 h，以3 000 r/min離心15 min，吸取血清，0.45 μm過(guò)濾器過(guò)濾、分裝、封口、標(biāo)記日期和編號(hào)，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取H9c2細(xì)胞株，觀察細(xì)胞形態(tài)是否異常，若無(wú)異常，于常氧培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中適應(yīng)環(huán)境，棄上清，PBS洗3遍，消化細(xì)胞，培養(yǎng)基終止消化并吹打均勻，更換新的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)80%左右開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞分組、造模與給藥

待H9c2細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)消化、計(jì)數(shù)并進(jìn)行培養(yǎng)，置于常氧培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為空白組、模型組和八味沉香散低、中、高劑量組（含藥血清劑量依次為2.5、8、12 g/kg，劑量依據(jù)同“2.1”項(xiàng)下）?？瞻捉M和模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20%的空白血清，八味沉香散低、中、高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20%相應(yīng)劑量的八味沉香散含藥血清?？瞻捉M置于常氧培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)。模型組和八味沉香散低、中、高劑量組置于三氣培養(yǎng)箱（2%O2）培養(yǎng)，待培養(yǎng)箱內(nèi)氣體濃度達(dá)到缺氧條件時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，缺氧時(shí)間為8 h（此時(shí)若LDH釋放量與空白組比較有顯著性差異表示氧糖剝奪損傷模型建立成功）[10]。

2.4 細(xì)胞存活率檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)。H9c2細(xì)胞接種于96孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組與給藥。缺氧結(jié)束后，各組細(xì)胞加入CCK-8溶液（總體積的10%）并孵育（37 ℃）1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A）值，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法計(jì)算細(xì)胞存活率（n＝6）。

2.5 細(xì)胞生化指標(biāo)檢測(cè)

按“2.3”項(xiàng)下方法對(duì)H9c2細(xì)胞分組與給藥，缺氧結(jié)束后，每孔吸出細(xì)胞上清液作為待測(cè)樣品（n＝6）。按LDH、CK、CAT、MDA、SOD、GSH-Px和ComplexⅠ試劑盒要求加入相應(yīng)試劑檢測(cè)其A值，再根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)生化指標(biāo)的水平。

2.6 細(xì)胞形態(tài)觀察

選取八味沉香散中劑量（最佳藥物濃度血清，下同）作為藥物組濃度[11]，按“2.3”項(xiàng)下所述方法對(duì)H9c2細(xì)胞處理后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)（如細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、死亡細(xì)胞數(shù)量）并拍照。

2.7 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)

選取八味沉香散中劑量作為藥物組濃度，按“2.3”項(xiàng)下方法對(duì)H9c2細(xì)胞分組與給藥（n＝3）。按照 DCFHDA ROS試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)：收集各組細(xì)胞并用PBS洗滌2次，結(jié)合緩沖液重懸后，加入DCFH-DA探針和適量ROS供氫體，37 ℃孵育30 min后，分別用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行觀察和檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞氧糖剝奪損傷后的ROS含量（綠色熒光強(qiáng)度越大，表示ROS含量越高）。

2.8 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

選取八味沉香散中劑量作為藥物組濃度，按“2.3”項(xiàng)下方法對(duì)H9c2細(xì)胞分組與給藥（n＝3）。按照J(rèn)C-1試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體膜電位：收集各組細(xì)胞并用PBS洗滌2次，結(jié)合緩沖液重懸后，加入JC-1工作液，37 ℃孵育20 min后，分別用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)H9c2細(xì)胞氧糖剝奪損傷后線粒體膜電位情況（紅色熒光代表完整細(xì)胞膜，綠色熒光代表細(xì)胞膜破損）。

2.9 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

選取八味沉香散中劑量作為藥物組濃度，按“2.3”項(xiàng)下方法對(duì)H9c2細(xì)胞分組與給藥（n＝3）。按照 AnnexinⅤ-FITC /PI 試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察并通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡率：收集各組細(xì)胞并用PBS洗滌2次，結(jié)合緩沖液重懸后，加入Annexin Ⅴ-FITC、碘化丙啶染色，37 ℃孵育20 min后，分別用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡率（綠色熒光代表細(xì)胞早期凋亡，紅色熒光代表細(xì)胞晚期凋亡）。

2.10 細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)

選取八味沉香散中劑量作為藥物組濃度，按“2.3”項(xiàng)下方法對(duì)H9c2細(xì)胞分組與給藥（n＝3）。提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行定量。各組蛋白上樣量10 μL，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉，然后加入一抗（Keap1、Nrf2、Ndufa10、HO-1、Trx、Bcl-2、Cytc、Bax、β-actin和Caspase-3，稀釋度均為1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（稀釋度為1∶2 000）室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，暗室中曝光顯影、定影，用Image J軟件檢測(cè)各組蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料滿足正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 含藥血清對(duì)氧糖剝奪損傷模型細(xì)胞存活率的影響

與空白組（100%）比較，模型組細(xì)胞存活率[（80.85±4.73）%]顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，八味沉香散低、中、高劑量組細(xì)胞存活率[依次為（93.08±2.34）%、（106.02±6.22）%、（89.20±8.01）%]均顯著升高（P＜0.01，n＝6）。

3.2 含藥血清對(duì)氧糖剝奪損傷模型細(xì)胞生化指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞上清液中LDH、CK、MDA水平均顯著升高，CAT、GSH-Px、SOD、ComplexⅠ水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，八味沉香散低、中、高劑量組細(xì)胞上清液中LDH、CK、MDA水平均顯著降低（P＜0.01），CAT（低劑量組除外）、GSH-Px（低、高劑量組除外）、SOD、ComplexⅠ（低劑量組除外）水平均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞上清液中生化指標(biāo)比較（±s，n=6）

表1 各組細(xì)胞上清液中生化指標(biāo)比較（±s，n=6）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01

組別空白組模型組八味沉香散低劑量組八味沉香散中劑量組八味沉香散高劑量組LDH/（U/L）199.17±10.55 275.91±5.61a 213.18±6.42b CK/（ng/mL）1.19±0.02 1.66±0.12a 1.30±0.01b MDA/（nmol/mL）10.46±0.40 16.54±0.86a 14.11±0.62b GSH-Px/（pg/mL）292.64±14.14 237.28±4.93a 219.50±18.04 ComplexⅠ/（pg/mL）76.23±6.76 61.67±2.96a 64.92±4.10 CAT/（pg/mL）243.43±4.58 195.03±3.38a 195.56±1.31 SOD/（pg/mL）1 709.57±44.67 1 065.73±63.53a 1 590.07±56.14b 93.26±5.96b 1.21±0.02b 13.51±0.40b 297.92±15.38b 70.17±5.70b 242.12±5.00b 1 639.43±41.41b 204.66±3.88b 1.21±0.03b 11.81±1.39b 254.78±32.1976.43±6.00b 222.59±5.42b 1 631.83±67.93b

3.3 含藥血清對(duì)氧糖剝奪損傷模型細(xì)胞形態(tài)的影響

顯微鏡觀察結(jié)果顯示，空白組細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整、邊緣清晰，死細(xì)胞數(shù)量較少；模型組細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒物增多，大多數(shù)心肌細(xì)胞形狀變得短粗，細(xì)胞壁破損明顯、結(jié)構(gòu)不完整，死細(xì)胞數(shù)量顯著增加，損傷加重。八味沉香散中劑量組細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整、邊緣清晰，形狀較少改變，死細(xì)胞數(shù)量較少。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組H9c2細(xì)胞形態(tài)的顯微圖

3.4 含藥血清對(duì)氧糖剝奪損傷模型細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

與空白組[（33.80±2.82）%]比較，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS含量[（68.63±8.66）%]顯著升高；與模型組比較，八味沉香散中劑量組細(xì)胞內(nèi)ROS含量[（35.40±11.44）%]顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組細(xì)胞內(nèi)ROS流式圖

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光顯微圖（×40）

3.5 含藥血清對(duì)氧糖剝奪損傷模型細(xì)胞線粒體膜電位的影響

與空白組[（85.02±0.72）%]比較，模型組細(xì)胞線粒體膜電位[（74.70±1.43）%]顯著降低；與模型組比較，八味沉香散中劑量組細(xì)胞線粒體膜電位[（87.36±0.59）%]顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 各組細(xì)胞線粒體膜電位熒光顯微圖（×40）

圖5 各組細(xì)胞線粒體膜電位流式圖

3.6 含藥血清對(duì)氧糖剝奪損傷模型細(xì)胞凋亡的影響

與空白組[（17.50±2.35）%]比較，模型組細(xì)胞凋亡率[（44.52±3.75）%]顯著升高；與模型組比較，八味沉香散中劑量組細(xì)胞凋亡率[（32.50±5.09）%]顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 各組細(xì)胞凋亡熒光顯微圖（×40）

圖7 各組細(xì)胞凋亡流式圖

3.7 含藥血清對(duì)氧糖剝奪損傷模型細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞中Keap1、Nrf2、Ndufa10、HO-1和Trx的蛋白表達(dá)水平均顯著升高；與模型組比較，八味沉香散中劑量組細(xì)胞中Keap1、Nrf2、HO-1、Trx的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖8。

圖8 各組細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表2 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n=3）

表2 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n=3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白組模型組八味沉香散中劑量組Trx 0.55±0.12 1.16±0.14a 0.75±0.19b Keap1 0.71±0.07 1.04±0.09a 0.65±0.03b Nrf2 0.84±0.03 0.96±0.03a 0.55±0.03b HO-1 0.05±0.01 1.18±0.23a 0.82±0.03b Ndufa10 0.72±0.07 1.02±0.08a 0.74±0.11b

3.8 含藥血清對(duì)氧糖剝奪損傷模型細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞中促凋亡蛋白Cytc、Bax和Caspase-3的表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，八味沉香散中劑量組細(xì)胞中Cytc、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3、圖9。

圖9 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n=3）

表3 各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果（±s，n=3）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別空白組模型組八味沉香散中劑量組Bcl-2 0.79±0.06 0.58±0.03a 0.72±0.02b Bax 0.69±0.11 1.05±0.10a 0.78±0.06b Caspase-3 0.68±0.07 1.17±0.13a 0.80±0.07b Cytc 0.67±0.12 1.22±0.07a 0.87±0.03b

4 討論

心肌缺血發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是心肌缺血病理生理學(xué)中密切相關(guān)的兩部分，自由基損傷和氧化應(yīng)激是缺血再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)并參與了損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)的每個(gè)步驟[12]。抑制細(xì)胞凋亡是心肌缺血治療中的保護(hù)策略之一[13]。H9c2細(xì)胞被廣泛用于心血管系統(tǒng)疾病藥物作用的研究。氧糖剝奪損傷模型能最大程度模擬心肌缺血病理生理情況下的細(xì)胞狀態(tài)，是心肌缺血研究的經(jīng)典細(xì)胞模型?；诖耍疚慕9c2細(xì)胞的氧糖剝奪損傷模型，探討八味沉香散含藥血清對(duì)心肌缺血的保護(hù)機(jī)制。

“血清藥理學(xué)”通過(guò)灌胃等方式讓動(dòng)物服藥并在一段時(shí)間后采集血液、分離血清，將血清作為藥源進(jìn)行觀察。該方法在給藥后，使藥物在體內(nèi)產(chǎn)生藥物效應(yīng)，其原有成分可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性成分或代謝后失活，或沒(méi)有被體內(nèi)吸收，或通過(guò)第二信使而間接起作用[14]。這是目前研究復(fù)方中藥、民族藥體外藥理學(xué)常用的方法之一，且在一定程度上能反映出藥物的有效作用和分子機(jī)制。因此本研究采用血清藥理學(xué)方法探討藥物在細(xì)胞層面的抗氧化應(yīng)激、抗凋亡機(jī)制。

本課題組前期通過(guò)超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)八味沉香散灌胃大鼠后的血清進(jìn)行鑒定，入血成分中有7種成分具有抗氧化作用，其中秦皮乙素能有效清除自由基[15]，綠原酸能夠螯合金屬離子和清除自由基[16]，沒(méi)食子酸甲酯和沒(méi)食子酸乙酯均具有抗氧化損傷活性[17—18]，山柰酚具有較強(qiáng)的抗氧化活性[19]，槲皮素對(duì)因氧化應(yīng)激導(dǎo)致的疾病有很好的預(yù)防和治療作用[20]，甲基丁香酚可抑制缺氧/復(fù)氧損傷后人腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放[21]。由此推測(cè)這些化合物可能是八味沉香散通過(guò)抗氧化應(yīng)激作用發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞作用的有效成分。

相關(guān)文獻(xiàn)研究表明，八味沉香散含藥血清在不影響細(xì)胞存活率的前提下可提高氧糖剝奪損傷的H9c2細(xì)胞存活率，這可能與其降低細(xì)胞氧化損傷和抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞受到缺氧損傷時(shí)，細(xì)胞膜受損，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的LDH和CK釋放，因此LDH和CK的釋放量與細(xì)胞受損程度相關(guān)，可作為藥物細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H9c2細(xì)胞氧糖剝奪損傷后，給予八味沉香散含藥血清可抑制LDH和CK的釋放，保護(hù)細(xì)胞膜完整性。氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞缺血損傷的主要病理機(jī)制之一。心肌缺血后持續(xù)的氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞代謝副產(chǎn)物——ROS堆積，而此時(shí)在正常生理狀態(tài)下機(jī)體維持氧化-抗氧化系統(tǒng)平衡的內(nèi)源性抗氧化劑SOD和GSH等不足以清除ROS[22]。這種失衡導(dǎo)致細(xì)胞中調(diào)控ROS的相應(yīng)蛋白、相關(guān)氧清除劑和ROS相關(guān)因子發(fā)生了改變，進(jìn)而氧化細(xì)胞大分子如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，加劇機(jī)體損傷。由此本研究進(jìn)行了氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，結(jié)果顯示，氧糖剝奪損傷后，ROS大量生成，抗氧化物質(zhì)CAT、ComplexⅠ、SOD、GSH-Px等被大量消耗，持續(xù)生成的ROS自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)生成MDA，加劇細(xì)胞膜損傷，調(diào)控氧化應(yīng)激的相關(guān)蛋白（Keap1、Nrf2、Ndufa10、HO-1和Trx）表達(dá)升高；而給予八味沉香散含藥血清可降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量，提高以ROS為底物的抗氧化物質(zhì)CAT、ComplexⅠ、SOD、GSH-Px水平，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平，降低氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白（Keap1、Nrf2、Ndufa10、HO-1、Trx）表達(dá)，初步驗(yàn)證了八味沉香散含藥血清降低細(xì)胞氧化損傷的作用。

ROS簇的形成和積累沒(méi)有得到有效清除并攻擊線粒體造成線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，致使線粒體膜電位下降，并促使細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子等凋亡蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[23]；而顯微鏡下可觀察到細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為死細(xì)胞數(shù)量變多，細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞壁邊界不顯著等[24]。因此本研究進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞凋亡指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，給予八味沉香散含藥血清后能夠提高氧糖剝奪損傷的H9c2細(xì)胞的線粒體膜電位，并改善細(xì)胞壁邊界形態(tài)和減少死細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)減少Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡的數(shù)量，升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax、Cytc、Caspase-3的表達(dá)，提示八味沉香散含藥血清具有良好的抗凋亡作用，進(jìn)一步表明八味沉香散含藥血清對(duì)H9c2細(xì)胞氧糖剝奪損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，八味沉香散對(duì)H9c2細(xì)胞氧糖剝奪損傷具有保護(hù)作用，這一作用是通過(guò)平衡氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制凋亡的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)仍存在不足之處，如缺乏對(duì)藥物量效關(guān)系的探究。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，本課題組將結(jié)合經(jīng)典動(dòng)物模型對(duì)八味沉香散量效關(guān)系進(jìn)行探索，進(jìn)一步探討八味沉香散對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用。