固相萃取-高效液相色譜法同時檢測飲用水中MC-LR、滅草松和2,4-D

亢衛(wèi)華，楊 迪，王 昕，李建風(fēng)，王元琦，王海雁*，劉永文*

(1.大同市供水排水集團有限責(zé)任公司，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西大同 037009)

微囊藻毒素-LR(MC-LR)是微囊藻毒素中毒性分布最強的一類物質(zhì)，它是水體被氮、磷等植物營養(yǎng)元素污染造成水體富氧化而產(chǎn)生的，化學(xué)名稱為D-丙氨酸-L-亮氨酸-赤-p-甲基-D-異天冬氨酸-L-精氨酸-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸，分子式為C49H74N10O12，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[1]，對人體的肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟等都具有明顯的毒性，被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)定為2B 類致癌物[2-3]。滅草松，又稱苯達松，是一種具有低毒性的苯噻二嗪類化合物，分子式為C10H12N2O3S，化學(xué)名稱為3-異丙基(1H)-苯丙-2,1,3-噻二嗪-4-酮-2,2-二氧化物，滅草松在酸性和堿性條件下穩(wěn)定，光照條件下不穩(wěn)定，對人體有致癌、致畸的危害。2,4-D 是一種苯氧基極性化合物，化學(xué)名稱為2,4-二氯苯氧乙酸，分子式為C8H6C12O3，低毒性但抗生物降解能力強，對植物有較高的選擇性，對大部分闊葉類雜草防治效果理想，2,4-D 易溶于水和其他溶劑，可快速滲透植物的葉和根，目前仍是一種廣泛使用的除草劑[4]。滅草松、2,4-D 均為農(nóng)藥類化合物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用，其用量大、用途廣，對人體有毒性[5]。以上三種化合物的分子結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 微囊藻毒素-LR、滅草松、2,4-二氯苯氧乙酸分子結(jié)構(gòu)式

在《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749-2006) 中規(guī)定MC-LR、滅草松、2,4-D 的含量指標(biāo)分別為0.001、0.3、0.03 mg/L，與世界衛(wèi)生組織規(guī)定相同[6-7]。

三種物質(zhì)常用的檢測方法有高效液相色譜法[8]、毛細管電泳法、毛細管電色譜法[9]、氣相色譜法[10]、熒光光譜法[11]、液質(zhì)聯(lián)用法[12-13]。本研究使用SPE/HPLC配套ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)色譜柱，先采用固相萃取法對樣品進行前處理，再用具有陣列檢測器(DAD)的高效液相色譜儀分析檢測，快速實現(xiàn)以上三種微量有機物的同時測定。相比于傳統(tǒng)的液液萃取法固相萃取(SPE)可以提高分析物的回收率，減少樣品預(yù)處理過程，具有省時省力、重現(xiàn)性好、污染程度小[14]等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器設(shè)備：1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司生產(chǎn)；SPE-DEX4790 型固相萃取儀，美國Horizon TechnoLogy 公司生產(chǎn)；AtLantic C18 Disk 固相萃取膜(47 mm),北京豫維科技有限公司生產(chǎn)；色譜柱采用ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm,5 μm)，美國安捷倫公司生產(chǎn)。

標(biāo)準(zhǔn)品：MC-LR 溶液標(biāo)準(zhǔn)樣品(SB05-287-2012)，20 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所提供；滅草松溶液標(biāo)準(zhǔn)樣品(SB05-107-2008-2)，1 000 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所提供；2,4-D 標(biāo)準(zhǔn)樣品(GSB05-2654-2010),100 mg/L，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所提供。

實驗試劑：配制標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分析所用到的甲醇、乙腈、三氟乙酸除另有規(guī)定外均為色譜純。

1.2 實驗方法

采用固相萃取技術(shù)富集水中的MC-LR、滅草松和2,4-D，用甲醇洗脫，將洗脫液濃縮收集后，再用具有二極管陣列檢測器(DAD)的高相液相色譜儀進行分離檢測。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)中間液配制：如表1 所示，將MC-LR、滅草松和2,4-D 標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋，配制成濃度分別為1.00、2.00和2.00 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)系列濃度 /(mg·L-1)

標(biāo)準(zhǔn)使用液配制：分別取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液50.00、100.00、200.00、300.00 和400.00 μL用甲醇定容至1.00 mL。

1.2.2 實際試樣制備

按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》GB/T5750.8-2006 水樣采集方法，用2.5 L 具塞棕色玻璃試劑瓶采集生活飲用水水樣，低溫避光保存。

樣品前處理：每份采集水樣取1 L，加入7 mL 甲醇，5 g 氯化鈉來提高方法回收率。同時在待測水樣中加0.1 g 硫代硫酸鈉(Na2S2O3)，用以消除水樣中氯類消毒劑的影響。

將做好前處理的水樣使用固相萃取儀進行固相萃?。荷蠘? L，C18萃取膜依次用乙酸乙酯、丙酮、甲醇和純水活化，干燥5 min，用甲醇進行3 次洗脫，收集好洗脫液（約20 mL）后，設(shè)定溫度45 ℃進行氮吹濃縮，待測水樣經(jīng)過固相萃取濃縮至5.00 mL。處理好的試樣直接進樣。

1.2.3 空白試樣制備

制備空白試樣作為對照組，消除不確定性因素的干擾，以提高結(jié)果的可信度，對照組試樣的制備過程與實際試樣組制備過程保持一致。實際試樣制備中使用到的試劑取超純水代替。

1.2.4 色譜條件優(yōu)化

色譜柱選擇：使用較為經(jīng)濟耐用的ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱。

流動相：流動相組成為超純水62%，乙腈(0.10%三氟乙酸)38%。使用甲酸、磷酸、三氟乙酸分別作為添加劑進行樣品分析，結(jié)果顯示采用三氟乙酸作為添加劑能更好地改善三種化合物的峰形，克服峰展寬和拖尾問題，提高色譜分離效果。

流速的選擇：在柱溫35℃流速為0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2 mL/min 下分別察看分離效果，結(jié)果顯示流速設(shè)定為0.7 mL/min 時三種化合物的分離度較其他流速下更好，且可在15 min 內(nèi)全部出峰。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的優(yōu)化

化合物自身性質(zhì)與色譜體系中所使用到的流動相種類等都會影響化合物吸收峰的波長、強度以及色譜峰形狀等。在設(shè)定的流動相和流速下收集以上三種化合物210～400 nm的吸收光譜見圖2。MC-LR在238 nm 有強吸收峰，約1.0 mAU；滅草松在215 nm 有強吸收峰，在238 nm有較強吸收峰約1.5 mAU；2,4-D在210 nm 有強吸收，在238 nm 有較強吸收峰，強度約1.0 mAU。雖然滅草松和2,4-D在深紫外附近有強吸收，但該區(qū)域基線噪音約為238 nm 附近的10 倍。故按照檢測波長213 nm,215 nm,230 nm,238 nm 分別進樣，得到圖3。由圖3 可知，在213 nm 和215 nm處滅草松和2,4-D 的峰面積很大，但基線波動也很大，在這個噪聲下MC-LR 幾乎被掩蓋了。230 nm 和238 nm 相對比，238 nm 的峰形更為對稱，故最終選擇238 nm作為本實驗方法的檢測波長。

圖2 三種化合物紫外吸收光譜圖

圖3 同濃度下不同波長時三種化合物峰和基線對比圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

配制濃度為1.00 mg/L的三種物質(zhì)的單標(biāo)和混合標(biāo)準(zhǔn)中間液分別進樣，確定每種組分的保留時間和分離度。取處理好的樣品1.0 L 注入到HPLC 系統(tǒng)中，在實驗選定的色譜條件下進行分析，基線無干擾，各待測物分離度和峰形都很好，三種化合物都能夠?qū)崿F(xiàn)理想的分離效果。

根據(jù)表1中的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，每個濃度平行測定3 次，取平均值。保留時間為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4 所示。圖中微囊藻毒素-LR保留時間為7.707 min、滅草松保留時間為11.910 min、2,4-D 保留時間為12.999 min。相關(guān)分離度為8.712和2.061。

圖4 三種化合物的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

用三種化合物的第一組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差計算方法檢出限(MDL)，濃縮倍數(shù)200 倍。最低檢出限限（方法最低檢測質(zhì)量濃度）等于4 倍MDL。表2 為三種農(nóng)殘的直線回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限。

表3 校準(zhǔn)曲線表

2.3 方法的精密度與加標(biāo)回收率

回收率: 未檢出的實際水樣中，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，計算回收率。MC-LR、滅草松和2,4-D 三種物質(zhì)加標(biāo)回收率測得值在85%～104%之間。采用本方法，MC-LR、滅草松和2,4-D 最低本底值質(zhì)量濃度分別小于0.50 μg/L、0.50 μg/L和0.60 μg/L。

精密度:為了進一步驗證方法的準(zhǔn)確性，在未檢出的實際水樣中，分別按照標(biāo)準(zhǔn)曲線上第二個和第四個點的濃度加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)檢測7 次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，取平均值，得到精密度。通過對高低濃度的數(shù)據(jù)分析，精密度均在2.6%～ 7.7%之間，滿足國標(biāo)GBT14848-2017 地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[15]和GB3838-2002地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[16]。

2.4 實際水樣的測定

應(yīng)用本方法對大同市自來水公司各水廠出廠水和管網(wǎng)水，共9個水樣進行了MC-LR、滅草松和2,4-D的同時測定，由于響應(yīng)值小，色譜圖上未出峰，所以按照小于檢出限報出，即測定水樣中MC-LR、滅草松和2,4-D的含量分別在0.123、0.118和0.151 μg/L以下。說明近幾年大同市通過源頭治理，水生態(tài)環(huán)境得到良好改善。

3 結(jié)論

大同市飲用水結(jié)構(gòu)為重地下水（67.7%）、輕地表水（引黃工程33.3%），地下水開發(fā)利用程度較高。檢測水樣來自二、六、七、八水廠和口泉供水處、黃河水廠、御東加壓站以及兩個管網(wǎng)點，共9 份出廠水和管網(wǎng)水樣。

建立了MC-LR、滅草松和2,4-D 的固相萃取-液相色譜檢測方法，固相萃取能更有效地將分析物與干擾組分分離，在實驗設(shè)定的色譜參數(shù)下可在15 min內(nèi)同時檢測飲用水中的上述三種化合物，各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，回收率在85%～104%之間，方法的精密度與加標(biāo)回收率都能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)GB5749-2006 生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[17]的要求。本方法改進了流動相，使得色譜峰形更好；使用了更為經(jīng)濟耐用的色譜柱，提高了檢驗效率，適用于生活飲用水中痕量MC-LR、滅草松和2,4-D的富集批量檢出。