雷公藤內(nèi)酯醇長循環(huán)納米脂質(zhì)體的急性毒性和長期毒性研究

闕慧卿 李 唯 錢麗萍 劉洪旭 郭舜民 林 綏

福建省醫(yī)學科學研究院藥物所 福建省醫(yī)學測試重點實驗室，福建福州 350001

雷公藤（tripterygium wilfordii Hook. f.），系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，主產(chǎn)于我國長江以南地區(qū)[1]，為福建省道地藥材。雷公藤內(nèi)酯醇（triptolide，TP）具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種藥理作用[2]，為雷公藤的高活性成分之一，在近60種腫瘤細胞株中均可發(fā)揮良好的抗腫瘤活性[3]，具有良好的開發(fā)前景，但高活性的TP治療窗狹窄，在發(fā)揮治療作用的同時，對機體的多個器官也產(chǎn)生嚴重的毒性反應(yīng)，包括肝毒性、腎毒性、生殖毒性、免疫系統(tǒng)毒性等[4-6]。

針對TP抗腫瘤活性強、毒性大這個矛盾，近年來，許多科研工作者通過結(jié)構(gòu)改造[7]、配伍[8]、改變劑型[9]等方式開展TP的減毒增效探索，目前應(yīng)用最廣泛且較為成功的研究為納米脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)[10]。裝載到脂質(zhì)體中的藥物因免受酶降解、化學失活等影響而受到保護，半衰期延長，使用效率提高，另外毒性藥物在脂質(zhì)體內(nèi)腔，其暴露于健康組織的程度減小，與游離形式相比毒副作用減小[11]。前期研究將TP經(jīng)多肽SP94修飾后包載成長循環(huán)納米脂質(zhì)體，以增強TP的靶向性，加大其在腫瘤部位的積累，降低毒副作用，增強療效。本研究通過急性毒性和長期毒性實驗考察多肽修飾的雷公藤內(nèi)酯醇長循環(huán)納米脂質(zhì)體（peptide-triptolide nanoliposomes，PTN）的減毒效果，為PTN的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級ICR小鼠80只，18～22 g，雌雄各半[北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008]；SPF級SD大鼠32只，150～180 g，雌雄各半[杭州醫(yī)學院實驗動物中心，許可證號：SCXK（浙）2019-0002]。

1.2 實驗試劑

TP對照品（純度為98.2%，由福建省醫(yī)學科學研究院提供批號：20190324）；PTN（由福建省醫(yī)學科學研究院藥物所配制，批號：20201102，TP濃度為1.03 mg/ml）；0.9%氯化鈉注射液（由福州海王福藥制藥有限公司提供，批號：H35020289）。

1.3 實驗儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，型號：RE-2000B）；水純化系統(tǒng)（上?？道追治鰞x器有限公司，型號：SARMT-N）；電子臺秤[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號：ICS685s-3SM/f]分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號：ML204T/02]；全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號：BS-350S）；臺式離心機（上海安亭科學儀器廠，型號：TDL-80-2B）。

2 實驗方法

2.1 急性毒性實驗

2.1.1 預實驗 根據(jù)TP的LD0（0%病死率）和LD100（100%病死率），將12只小鼠，隨機分為六組，分別設(shè)置為正常組、5個受試物組，每組2只，按等容量不等濃度的方法，正常組尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml/只，受試物組注射同體積不同濃度PTN溶液，給藥劑量分別為1.80 mg/kg、1.39 mg/kg、1.07 mg/kg、0.82 mg/kg、0.63 mg/kg和0.49 mg/kg（以TP含量計），結(jié)果1.80 mg/kg、1.39 mg/kg兩個劑量小鼠全部死亡，而0.63 mg/kg、0.49 mg/kg兩劑量無死亡，因此，初步判斷PTN的“最小致死量”為0.63 mg/kg，“最大耐受量”為1.39 mg/kg。

2.1.2 劑量與分組 根據(jù)預實驗結(jié)果與等比數(shù)列原則，在“最低致死量”和“最高不致死量”之間設(shè)計5個梯度劑量（分別為0.63 mg/kg、0.77 mg/kg、0.94 mg/kg、1.14 mg/kg、1.39 mg/kg）進行實驗。將健康ICR小鼠80只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，按完全隨機分組法隨機分為8組，每組各10只，分別為正常組（生理鹽水組）、陰性對照組（不含TP的脂質(zhì)體組）、陽性對照組（對照藥TP組）、PTN給藥組。

2.1.3 給藥、觀察及檢測指標 按等容量不等濃度

法，通過尾靜脈注射一次性給予0.2 ml相應(yīng)藥液，給藥期間自由飲食、飲水，給藥后4 h進行嚴密觀察，此后每天定時觀察1次，連續(xù)14天，觀察并記錄動物的毒性反應(yīng)和死亡情況，包括小鼠的活動、形態(tài)、毛色、死亡時間、死亡只數(shù)等。將死亡及觀察期結(jié)束后仍存活的小鼠進行大體解剖，對主要臟器進行肉眼觀察，如發(fā)現(xiàn)肉眼可見的病變進行病理組織學檢查。應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，用bliss法計算LD50，及95%可信區(qū)間。

2.2 長期毒性實驗

2.2.1 劑量設(shè)計 按照大小鼠等效劑量系數(shù)換算大鼠的LD50，參考文獻[12]采用半數(shù)致死量法設(shè)計PTN高、中、低三個劑量組分別為陽性對照藥高、中、低劑量組給予與PTN劑量組相當?shù)腡P溶液；正常組給予生理鹽水，陰性對照組給予空白脂質(zhì)體作為對照。

2.2.2 分組 將32只SD大鼠，雌雄分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按完全隨機分組法隨機分為8組，每組各4只（雌鼠2只，雄鼠2只），稱重，分別標記為PTN供試品高、中、低劑量組；陽性對照藥高、中、低劑量組；正常組和陰性對照組。

2.2.3 給藥、觀察及檢測指標 按照等容量不等濃度原則，各組動物均尾靜脈注射0.5 ml相應(yīng)溶液，每兩天1次，連續(xù)給藥28 d，期間自由飲食、飲水。給藥期各組大鼠于第1次給藥前及給藥后每周固定時間稱量體重1次，根據(jù)大鼠體重變化調(diào)整給藥量；每周稱量各組大鼠的總攝食量，并觀察動物的一般狀況、活動、形態(tài)等。給藥期結(jié)束后，禁食不禁水12 h，將各組大鼠進行稱重、麻醉，心臟采血后，解剖檢查。肉眼觀察臟器形態(tài)，當觀察到異常時進行病理學檢查；取相應(yīng)臟器稱重、計算臟器系數(shù)；測定血清生化學指標。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，單因素多樣本均數(shù)的比較采用ANOVA方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 急性毒性實驗

3.1.1 一般觀察 給藥后，實驗組小鼠活動減少，其中高劑量組出現(xiàn)呼吸加重、弓背豎毛、掉毛、排泄物增多的現(xiàn)象，72 h后存活小鼠的呼吸和運動恢復正常，攝食量增加，皮毛恢復光澤。

3.1.2 毒性觀察 給藥后，小鼠陸續(xù)出現(xiàn)死亡，死亡數(shù)量見表1，72 h后剩余小鼠全部存活。根據(jù)表1數(shù)據(jù) 采 用bilss法 計 算PTN的LD50為1.158 mg/kg，95%%的可信區(qū)間為0.876～1.161 mg/kg。

表1 LD50及95%可信區(qū)間

3.2 長期毒性實驗

3.2.1 劑量確定 按照等效劑量系數(shù)法，由小鼠尾靜脈注射的LD50換算大鼠的劑量：大鼠LD50=小鼠LD50×0.2 kg×折算系數(shù)/0.02 kg，得大鼠靜脈注射給藥PTN的LD50為1.6212 mg/kg，設(shè)計大鼠長期毒性實驗的高、中、低劑量組給藥劑量分別為0.160 mg/kg、0.030 mg/kg、0.016 mg/kg。

3.2.2 一般情況觀察 給藥期間，PTN給藥組和陽性對照組大鼠活動減少，弓背豎毛、皮毛晦暗、粗糙等異常癥狀，脂質(zhì)體組大鼠的糞便相比于陽性對照組和正常組更加軟潤，顆粒較大。

3.2.3 對攝食量的影響 給藥期間，各組大鼠攝食量呈增長趨勢，21天后開始出現(xiàn)不同程度的減少，其中PTN高、中劑量組以及TP各給藥組攝食量明顯減少，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），PTN低劑量組攝食量與正常組和陰性對照組接近。

3.2.4 對大鼠體重的影響 由表2可知，實驗期間，實驗組與正常組大鼠體重變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）；給藥第四周，陰性對照組大鼠體重繼續(xù)增加，其余各組體重均出現(xiàn)負增長。陰性對照組大鼠體重增長大于實驗組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。PTN各給藥組大鼠體重下降，下降幅度小于TP各組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。推測是因為各實驗組給予的藥物都含有TP，TP具有的胃腸道毒性[13],讓胃腸黏膜產(chǎn)生潰瘍、出血及輕度壞死等損傷，從而導致給藥組和陽性對照組的消化能力下降，也可能是因為TP對SD大鼠其他系統(tǒng)的損害如肝毒性[14]、心毒性[15]、腎毒性等[16]的影響，導致大鼠體重減輕；而PTN組藥物經(jīng)過PEG、磷脂、膽固醇等基質(zhì)包封，吸收、分布、代謝等行為了發(fā)生變化，毒性降低；陰性對照組給予的藥物不含TP，但含有磷脂、膽固醇等脂質(zhì)成分，所以體重相比于正常組有所增長。

表2 PTN長期毒性實驗大鼠體重比較（g，x ± s，n=4）

3.2.5 系統(tǒng)解剖與臟器指數(shù)檢查 用藥28 d后，分別解剖，各劑量組大鼠心、肝、脾、肺、腎等主要器官的外觀、顏色和臟器大小與正常組比較，形態(tài)正常，肉眼未見明顯的滲出、增生、水腫和萎縮等毒性病理改變。由表3可知，對比正常組與陰性對照組，PTN各給藥組大鼠尾靜脈注射給藥4周后，臟器系數(shù)與正常組、陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）；TP高、中、低劑量組心臟重量小于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），另外TP低劑量組心臟重量小于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），因此判定PTN給藥系統(tǒng)可以減輕TP的心臟毒性。

表3 PTN長期毒性大鼠臟器指數(shù)表（x ± s，n=4）

3.2.6 對大鼠血液生化指標的影響 由表4可得，實驗組ALT、AST、AST/ALT、ALP值均升高。其中PTN高劑量組ALT值大于正常組、陰性對照組和TP低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；PTN中劑量組ALT值大于正常組、陰性對照組和TP低劑量組，小于TP中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；PTN低劑量組ALT值大于正常組、陰性對照組，小于TP高、中劑量組，差異具有極顯著意義，小于TP低劑量組，差異具有顯著意義。PTN高劑量組AST值大于正常組、陰性對照組和TP高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；PTN中劑量組AST值大于正常組、陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），小于TP高、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；PTN低劑量組AST值小于TP高、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）。PTN高劑量組ALP值大于正常組、陰性對照組，小于TP中、低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）；PTN低劑量組ALP值小于TP高、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01）。

表4 大鼠血清ALT、AST、AST/ALT和ALP值比較（x ± s，n=4）

由表5可知，實驗組大鼠TSP值與正常組、陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義；PTN高、中、低劑量組大鼠ALB值大于TP高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），TP高劑量組ALB值低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；TP高、中劑量組ALB/GLO值小于正常組、陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），PTN高、中、低劑量組ALB/GLO值大于TP高、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），與正常組、陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。

表5 大鼠血清TSP、ALB、GLO和ALB/GLO值比較（x ± s，n=4）

由表6可得，PTN和TP高、中劑量組BUN值大于正常組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），低劑量組與正常組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。另外，檢測TC、TG主要考察長期用藥對血脂是否有影響，結(jié)果由表6可知，PTN高劑量組TG值大于TP的中、低劑量組，PTN中劑量組TC值大于TP,高劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），但與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），陰性對照組與正常組TG、TC值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。

表6 大鼠血清BUN、TG和TC值（x ± s，n=4）

4 結(jié)論

根據(jù)文獻[17]報道TP經(jīng)小鼠靜脈注射的LD50為0.8 mg/kg，本研究通過急性毒性實驗得PTN的LD50為1.158 mg/kg，約為TP的1.45倍，PTN系統(tǒng)相比于TP，急性毒性降低。長期毒性實驗顯示大鼠尾靜脈注射含膽固醇、磷脂類基質(zhì)的PTN藥物，可減緩藥效物質(zhì)TP引起的體重下降，而不引起血脂異常；對比正常組與陰性對照組，各給藥組血清生化指標ALT、AST、ALP、BUN值均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），其中PTN各給藥組與TP高劑量組相比，ALB、A/G比值極顯著升高（P＜ 0.01），ALT、AST、AST/ALT、BUN極顯著下降，且PTN給藥組血生化值更接近于正常組。上述結(jié)果表明PTN存在一定的肝腎毒性，但毒性明顯小于TP，PTN給藥系統(tǒng)能夠有效降低TP的毒性。

5 討論

脂質(zhì)體具有親水和親油特性，對親脂性、兩性和水溶性物質(zhì)都具有很好的包裹作用。脂質(zhì)體進入人體主要被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而激活機體的自身免疫功能，并改變被包封藥物的動力學性質(zhì)和體內(nèi)分布，使藥物主要在肝、脾、肺和骨髓等器官累積，從而減少藥物的治療劑量和降低毒性，脂質(zhì)體在許多疾病尤其是癌癥的治療中顯示出明顯的優(yōu)越性[18]。TP抗腫瘤療效好，抗瘤譜廣，但溶解性差、生物利用度低，與療效相伴的毒副反應(yīng)是其開發(fā)利用的最大瓶頸，結(jié)合脂質(zhì)體的性質(zhì)將TP制成備成脂質(zhì)體制劑具有實用意義。半數(shù)致死量LD50是藥物的重要特征參數(shù)，準確測定LD50是合理用藥、安全用藥的重要前提[19]。本實驗采用單次最大給藥法尾靜脈注射給藥，觀察給藥后各組動物的一般情況，記錄72 h動物的死亡數(shù)量，應(yīng)用bliss法計算PTN的LD50。依據(jù)急性毒性實驗結(jié)果設(shè)計長期毒性給藥劑量，考察PTN的減毒作用。

實驗后期，PTN給藥組與TP給藥組的大鼠體重變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）；實驗結(jié)束后12 h，PTN給藥組生化值與正常組差異無統(tǒng)計學意義，與TP組生化值差異具有顯著性，但觀察主要臟器未發(fā)現(xiàn)明顯病變，因此不作病理切片檢查。