藍(lán)藻膦酸酯代謝及其生態(tài)意義研究進(jìn)展*

彭思慧，黃淑敏**，曾 瑩，林立洲，鄭凌凌，章 穎，宋立榮，束文圣，李春連，趙 亮,

(1:華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631) (2:中國科學(xué)院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430072) (3:廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510070) (4:浙江省越崎中學(xué)，紹興 312050)

對(duì)藍(lán)藻水華形成與優(yōu)勢(shì)維持機(jī)理的解析，是高效水華防控與減災(zāi)的必要前提[1-2]。在水生生態(tài)系統(tǒng)中，磷的循環(huán)是典型的沉積型循環(huán)，使磷元素成為水體最常見的生長限制因子[3]。因此，磷的高效獲取與利用，是維持水華和水體藍(lán)藻巨大生物量的重要過程，也是學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)問題。+5價(jià)的正磷酸鹽是最易被浮游植物吸收利用的無機(jī)磷，故其亦成為水環(huán)境中最稀缺的磷形態(tài)[4]。當(dāng)無機(jī)磷耗盡時(shí)，藍(lán)藻轉(zhuǎn)而利用溶解性有機(jī)磷(dissolved organic phosphorus, DOP)[5]。水體中的DOP主要由兩類物質(zhì)組成，即含磷酯鍵(C-O-P)的磷酸酯類化合物(phosphoester，圖1A、B)與含有碳-磷鍵(C-P)的膦酸酯類化合物(phosphonate，圖1C～E)；其中磷酸酯類化合物可被生物高效利用供磷，而膦酸酯類化合物因其含化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的C-P鍵，可抵抗各種水解、酶解與光分解等，常被歸為生物不可利用磷[5-9]。

圖1 幾種常見的磷酸酯(A：核酸；B：磷脂)與膦酸酯(C：甲基膦酸；D：2-氨基乙基膦酸；E：草甘膦)(圖中紅色虛線圈表示C-O-P鍵；綠色實(shí)線圈表示C-P鍵)Fig.1 Formulas of several common phosphate esters (A: nucleic acid; B: phospholipids) and phosphonates (C: methyl phosphonic acid; D: 2-amino ethylphosphonic acid; E: glyphosate) (The red dotted circle shows the C-O-P bond; the solid green coil shows the C-P bond)

在近些年的研究中，越來越多的微生物(包括數(shù)十株藍(lán)藻)被證實(shí)可以分解膦酸酯，顯示了膦酸酯作為生物替代性磷源的可能性，深化了對(duì)水體磷循環(huán)的認(rèn)識(shí)[7-15]。同時(shí)，膦酸酯在水環(huán)境中具有廣泛來源，包括人工合成(如草甘膦、敵百蟲等)與生物合成(如甲基膦酸)等，使其成為水體有機(jī)磷庫的重要組成[7-9,15-17]。隨著研究的深入，膦酸酯的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)日益凸顯，其可作為環(huán)境污染物與磷源影響水體浮游生物競(jìng)爭(zhēng)格局[18-24]，而生物源的甲基膦酸亦可作為好氧甲烷生物發(fā)生的關(guān)鍵底物[14-15,25-26]。此外，經(jīng)過長期的水質(zhì)管理，部分富營養(yǎng)化水體已呈現(xiàn)常態(tài)化無機(jī)磷限制，但仍可見藍(lán)藻水華周期性暴發(fā)[27]。作為廣泛存在的生物可替代性磷源，膦酸酯在上述過程中發(fā)揮的作用值得深入探究。

本文從膦酸酯生物合成與分解機(jī)制出發(fā)，回顧了藍(lán)藻膦酸酯代謝研究歷史，對(duì)目前已有的藍(lán)藻膦酸酯利用與合成研究進(jìn)行梳理，并重點(diǎn)綜述了藍(lán)藻膦酸酯代謝過程生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)與生態(tài)意義的研究進(jìn)展；最后對(duì)本領(lǐng)域未來發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了評(píng)述，以期為藍(lán)藻水華形成與優(yōu)勢(shì)維持機(jī)理的研究探索新思路，為針對(duì)性控磷政策的制定提供理論依據(jù)。

1 磷與膦酸酯

有機(jī)膦酸酯是一類古老的分子，在原始的缺氧時(shí)期，其被認(rèn)為是地球有機(jī)磷的主要形態(tài)[28]。膦酸酯中的磷為+3價(jià)，因此其亦構(gòu)成了水體磷氧化還原循環(huán)中最主要的成分[6,29]。

1.1 水環(huán)境中的膦酸酯

膦酸酯在水環(huán)境中廣泛存在，在海洋環(huán)境中，膦酸酯可占DOP的10%～25%[6,30-31]；而在部分淡水水體中，DOP中膦酸酯可達(dá)35%[32-33]。水體中的膦酸酯主要由生物合成產(chǎn)生，但也有相當(dāng)一部分膦酸酯來源于人類活動(dòng)。

1.1.1 人工合成的膦酸酯 1944年，Pikl合成了氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic)，這是人類首次成功合成膦酸酯[7]。自此，越來越多人工合成膦酸酯被應(yīng)用于商業(yè)，包括制藥、農(nóng)業(yè)、造紙與環(huán)境等領(lǐng)域。例如，氨基三亞甲基膦酸是水處理過程中常用的絮凝劑，泰諾福韋(tenofovir)被用于Ⅰ型艾滋病的治療，三氯松(敵百蟲)被用作殺蟲劑，乙烯利被用作植物生長調(diào)節(jié)劑等[7-9,34-35]。此外，人工合成膦酸酯還常作為阻燃劑與增塑劑等被廣泛使用[7-9]。

在所有人工合成的膦酸酯中，草甘膦(N-(膦酸甲基)甘氨酸，圖1E)是最廣泛使用的產(chǎn)品，占全球除草劑使用量的25%[36]。美國每年至少有2萬t膦以除草劑的形式被釋放到環(huán)境中[37]，而我國2020年草甘膦產(chǎn)量已逾55萬t[38]。盡管草甘膦具有高效、低毒等特點(diǎn)，但其大規(guī)模使用會(huì)引發(fā)水體污染、危害人類健康，已成為《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB5749-2006)中嚴(yán)格控制的有機(jī)污染物，對(duì)其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的研究也日趨深入。

1.1.2 生物源的膦酸酯及其生物合成 雖然科學(xué)家在1944年就已實(shí)現(xiàn)膦酸酯的人工合成，但直至1959年才首次鑒定到生物源的膦酸酯——2-氨基乙基膦酸(2-amino ethylphosphonic acid, 2-AEP)，而2-AEP也被認(rèn)為是野外豐度最高的生物源膦酸酯[7]。目前人們已在不同的原始生物中鑒定出多種生物源膦酸酯，如從弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)中分離的抗生素磷霉素(fosfomycin)，從產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomycesviridochromogenes)中分離的除草劑草胺膦(phosphinothricin)以及從海洋古菌Nitrosopumilusmaritimus中分離的甲基膦酸等[39-40]。上述膦酸酯常以胞外多糖、糖蛋白及磷脂的修飾基團(tuán)或以抗生素的形式在生物中存在。膦酸酯基團(tuán)的修飾，被認(rèn)為可增加上述大分子的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，以抵御磷酸酶酶解等[7-9]。

雖然生物源膦酸酯結(jié)構(gòu)多樣，但是其生物合成途徑卻極其保守：其共享生物合成前體，即磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvic acid, PEP)、膦酸丙酮酸(phosphonopyruvate, PnPy)和膦酸乙醛(phosphonoacetaldehyde，PnAA)[7-9]。在磷酸烯醇式丙酮酸變位酶(PEP mutase，PepM, EC 5.4.2.9)和膦酸丙酮酸脫羧酶(PnPy decarboxylase，Ppd, EC 4.1.1.82)的作用下，PEP被轉(zhuǎn)化為PnAA，并形成C-P鍵[7-9]。因此，pepM也常作為膦酸酯生物合成能力篩選的標(biāo)記基因；研究發(fā)現(xiàn)，10%的細(xì)菌編碼該基因[11]。PnAA作為其他膦酸酯的前體，可用于廣泛的產(chǎn)物合成。例如，PnAA經(jīng)過脫氫酶(PnAA dehydrogenase, Pdh)加氫形成羥乙基膦酸(hydroxyethylphosphonate, HEP)，HEP再經(jīng)由MPn合成酶(MPn synthase, MpnS)轉(zhuǎn)化形成甲基膦酸(圖2)[16]。作為甲基膦酸合成的關(guān)鍵酶，研究發(fā)現(xiàn)0.6%的海洋微生物含編碼MpnS的基因，而這一豐度被認(rèn)為可維持水體表層的高甲基膦酸濃度，以解釋水體表面甲烷的超飽和現(xiàn)象[16]。

圖2 甲基膦酸生物合成通路Fig.2 A biosynthetic pathway for methyl phosphonate synthesis

1.2 膦酸酯的生物利用

1963年，Zeleznick等首次發(fā)現(xiàn)大腸桿菌(Escherichiacoli)可分解甲基膦酸或乙基膦酸供磷[41]，但當(dāng)時(shí)并未闡明其利用機(jī)制。La Nauze與Rosenberg發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的細(xì)胞提取物可降解2-AEP[42]；而Lacoste與Neuzil則進(jìn)一步證實(shí)2-AEP的分解是由氨基轉(zhuǎn)移與C-P鍵斷裂兩個(gè)步驟組成[43]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)三類膦酸酯生物利用途徑，包括非底物特異的C-P鍵裂解酶(C-P lyase)途徑和與底物特異的氧化裂解與水解裂解途徑。其中，氧化裂解途徑主要指特異性裂解2-AEP的膦酸酯加氧酶通路(phosphonate oxygenase, PhnY*Z)；水解裂解途徑包括膦酸丙酮酸水解酶(PnPy hydrolase, PalA)通路、膦酸乙醛水解酶(PnAA hydrolase, PhnX)通路與膦酸乙酸水解酶(phosphonoacetate hydrolase, PhnWAY)通路；上述通路的具體催化過程，在文獻(xiàn)[7-9]中有詳細(xì)描述，此處便不再贅述。

在上述膦酸酯利用途徑中，C-P lyase途徑是目前研究最為透徹的通路[7-9]，已發(fā)現(xiàn)其可代謝至少25種膦酸酯底物[8]。該通路主要由膦酸酯降解(phosphonate degradation,phn)基因簇完成，phn基因簇由膦酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(phnC-E)、調(diào)節(jié)子基因(phnF)、C-P lyase復(fù)合體基因(phnG-M)與輔助基因(phnN-P)等組成[7-9]；膦酸酯的裂解，首先由核苷酸磷酸化酶PhnI執(zhí)行，在PhnGHL存在的情況下，PhnI催化膦酸基取代ATP的腺嘌呤形成三磷酸酯；后者經(jīng)由磷酸水解酶PhnM作用，水解生成無機(jī)焦磷酸鹽與5-磷酸核糖-1-膦酸酯；該膦酸酯再作為底物被PhnJ作用，經(jīng)腺苷甲硫氨酸依賴過程裂解C-P鍵，并生成相應(yīng)的烷烴與5-磷酸核糖-1,2-環(huán)狀磷酸酯。

2 藍(lán)藻膦酸酯利用與合成研究簡史

作為水生生態(tài)系統(tǒng)中最重要的原核生物類群之一，藍(lán)藻也被證實(shí)廣泛參與膦酸酯的生物合成與分解代謝。相關(guān)研究成果深化了對(duì)藍(lán)藻磷策略的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)了對(duì)水體磷循環(huán)的全面理解。

2.1 藍(lán)藻膦酸酯生物利用的研究進(jìn)展

1991年，Orús與Marco對(duì)藍(lán)藻降解敵百蟲過程進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)無菌藍(lán)藻培養(yǎng)液可快速清除敵百蟲；但其后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)，無細(xì)胞培養(yǎng)液和藍(lán)藻培養(yǎng)液中的敵百蟲降解情況無明顯差異，因此排除了藍(lán)藻對(duì)該膦酸酯降解的貢獻(xiàn)[44]。Ravi則發(fā)現(xiàn)在磷限制條件下多變魚腥藻(Anabaenavariabilis) ACA 101可分解草甘膦供磷，并提出可能是胞外堿性磷酸酶參與C-P鍵的裂解[45]。隨后，Palenik等發(fā)現(xiàn)聚球藻(Synechococcus) WH8102可以膦酸酯為唯一的磷源維持細(xì)胞生長，并在其基因組中鑒定到了膦酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[46]。

在2006年，Dyhrman等在海洋固氮藍(lán)藻紅海束毛藻(Trichodesmiumerythraeum) IMS101基因組中鑒定到phn基因簇，這是首次明確藍(lán)藻膦酸酯利用的遺傳基礎(chǔ)[10]。在上述工作中，作者比較了9株海洋藍(lán)藻基因組(包括原綠球藻Prochlorococcus、聚球藻與鱷球藻Crocosphaera等)，發(fā)現(xiàn)僅IMS101編碼phn基因簇，提出該性狀可使束毛藻在低磷條件下獲得額外競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該基因簇極有可能通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得，并在野外水體中鑒定到束毛藻膦酸酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(phnD)與C-P裂解酶基因(phnJ)的較高豐度表達(dá)，表明膦酸酯利用在束毛藻增殖過程中持續(xù)發(fā)揮積極作用；這一成果也開啟了后續(xù)一系列藍(lán)藻膦酸酯利用的研究[10]。表1總結(jié)了目前已報(bào)道的、經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的可利用膦酸酯的藍(lán)藻藻株。

表1 已發(fā)表的經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證可利用膦酸酯的藍(lán)藻藻株匯總Tab.1 Summary of experimentally confirmed cyanobacterial strains that are capable of phosphonate utilization

2.2 藍(lán)藻膦酸酯生物合成的研究進(jìn)展

Dyhrman等發(fā)現(xiàn)兩株紅海束毛藻藻株(IMS101與ST6-5)可合成膦酸酯，其含量可占細(xì)胞總顆粒磷的8%～17%，該研究也是首次經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)浮游原核生物可以自主合成膦酸酯；作者認(rèn)為束毛藻可能是海洋貧營養(yǎng)區(qū)膦酸酯的主要來源，并提出膦酸酯在海水中的積累會(huì)驅(qū)動(dòng)浮游生物群落向膦酸酯利用細(xì)菌轉(zhuǎn)變，進(jìn)一步影響海洋碳、氮、磷循環(huán)[55]。在2022年，Acker等報(bào)道了一株原綠球藻SB可自主合成膦酸酯，且膦酸酯可占逾40%的細(xì)胞總磷；通過單細(xì)胞基因組測(cè)序與分析，作者確定膦酸酯合成功能在原綠球藻與海洋浮游細(xì)菌主要類群SAR11中廣泛分布[56]。

3 基因組學(xué)助力膦酸酯代謝藍(lán)藻的挖掘

基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展帶來了藍(lán)藻基因組數(shù)據(jù)量的井噴[57-58]，也為膦酸酯生物代謝與生物合成藍(lán)藻的挖掘提供了堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

3.1 基于基因組比對(duì)的藍(lán)藻門膦酸酯利用功能調(diào)查

Willis等對(duì)9株水華藍(lán)藻擬柱孢藻(Cylindrospermopsisraciborskii)進(jìn)行基因組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)所有藻株均編碼phn基因簇[13]。同年，Teikari等對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫中500株藍(lán)藻基因組進(jìn)行phn基因簇搜索，共發(fā)現(xiàn)28株藍(lán)藻編碼該基因簇，覆蓋擬柱孢藻、魚腥藻、束毛藻與節(jié)球藻(Nodularia)等常見水華藍(lán)藻屬[14]。筆者團(tuán)隊(duì)在前期完成中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫160株藍(lán)藻基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上[58]，于2020年6月結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫中2408個(gè)藍(lán)藻基因組，對(duì)藍(lán)藻門phn基因簇的分布進(jìn)行了全面調(diào)查[15]。結(jié)果顯示，總共31屬151株藍(lán)藻基因組編碼phn基因簇(包括37株淡水藻種庫藍(lán)藻，其基因簇結(jié)構(gòu)如圖3所示)，其中9個(gè)屬為首次報(bào)道含該基因簇；后續(xù)分析藍(lán)藻表型與C-P裂解酶基因phnJ系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，大部分(141/151=93.4%)含該基因簇的藍(lán)藻為絲狀藻，僅8株為單細(xì)胞藍(lán)藻，且未見微囊藻或原綠球藻編碼該基因簇(圖4)；此外，我們驗(yàn)證了5株含phn基因簇藍(lán)藻(表1)利用膦酸酯的能力，確定4株藍(lán)藻可高效分解甲基膦酸供磷，這表明藍(lán)藻phn基因簇的編碼與確切的膦酸酯利用能力存在較強(qiáng)相關(guān)性[15]。Acker等在構(gòu)建完成海洋浮游微生物單細(xì)胞基因組測(cè)序數(shù)據(jù)集基礎(chǔ)上，對(duì)其中藍(lán)藻的膦酸酯生物利用途徑進(jìn)行調(diào)查，確定了2-AEP特異性的膦酸酯加氧酶通路(PhnY*Z)在海洋藍(lán)藻的廣泛分布[56]。

圖3 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫37株藍(lán)藻基因組中phn基因簇結(jié)構(gòu)示意圖(紅色字體表示該藻株同時(shí)編碼參與膦酸酯生物合成的pepM與ppd基因[15]。箭頭方向表示基因簇內(nèi)各基因方向)Fig.3 The phn gene cluster schematics of 37 identified cyanobacterial strains from the Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology (FACHB), Chinese Academy of Sciences (strains in red font indicate their encoding of pepM and ppd genes which are responsible for phosphonate biosynthesis[15]. The arrows’ direction represent the direction of each gene in the clusters of each strain)

3.2 基于基因組比對(duì)的藍(lán)藻門膦酸酯合成能力調(diào)查

目前，對(duì)膦酸酯合成藍(lán)藻挖掘的研究較為缺乏。筆者團(tuán)隊(duì)基于上述2568個(gè)藍(lán)藻基因組數(shù)據(jù)集，通過PepM與Ppd蛋白同源比對(duì)，確定13屬81株藍(lán)藻編碼上述基因，其中7屬11株藻同時(shí)編碼phn基因簇(圖4)。在潛在的膦酸酯合成藻株，可見念珠藻(Nostoc)、魚腥藻、浮絲藻(Planktothrix)與眉藻(Calothrix)等藍(lán)藻屬；其中79株為絲狀藍(lán)藻，顯示了絲狀藻在膦酸酯代謝中的重要作用[15]。而Acker等則通過PepM蛋白保守結(jié)構(gòu)“EDK (X)5NS”比對(duì)，發(fā)現(xiàn)原綠球藻屬、節(jié)旋藻屬(Arthrospira)與細(xì)鞘絲藻屬(Leptolyngbya)部分藻株也編碼該基因，并通過實(shí)驗(yàn)確定原綠球藻SB藻株可自主合成膦酸酯，進(jìn)一步拓寬了膦酸酯合成藍(lán)藻的范圍[56]。

圖4 151條藍(lán)藻C-P lyase基因phnJ最大似然法系統(tǒng)系統(tǒng)發(fā)育樹(以大腸桿菌菌株MG1655基因組phnJ基因?yàn)橥忸惾?。圓圈從外到內(nèi)依次為：膦酸酯生物合成潛能注釋、藍(lán)藻表型注釋、藻株來源生境注釋[15])Fig.4 The maximum likelihood phylogenetic tree of phnJ gene sequences from 151 strains identified as carrying a phn gene cluster (Rings shown from outer to inner are: the presence of genes involved in phosphonate biosynthesis, annotation of cyanobacteria morphological subsections, and habitat classification[15])

4 藍(lán)藻膦酸酯代謝的生態(tài)意義

膦酸酯生物利用與合成藍(lán)藻的發(fā)現(xiàn)，明確了膦酸酯的藍(lán)藻可利用性，確認(rèn)了藍(lán)藻在磷氧化還原循環(huán)中的重要作用，促進(jìn)了對(duì)磷生物地球化學(xué)循環(huán)的全面認(rèn)識(shí)[10]。同時(shí)，基于絕大多數(shù)藍(lán)藻[14-15,56]與真核藻類(目前僅記錄一株綠藻與一株金藻可代謝膦酸酯)[59]無法利用膦酸酯的事實(shí)，膦酸酯(包括生物源與人工源)在水體中的積累，改變了水生生態(tài)系統(tǒng)有機(jī)磷庫的組成，也必然會(huì)驅(qū)動(dòng)浮游生物競(jìng)爭(zhēng)格局的改變，存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。此外，草甘膦的大量使用已對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，而部分藍(lán)藻藻株可利用草甘膦的特性是評(píng)估這一影響的關(guān)鍵性狀。本節(jié)同時(shí)對(duì)這一領(lǐng)域進(jìn)展進(jìn)行梳理。

4.1 藍(lán)藻膦酸酯利用的生態(tài)意義及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)

4.1.1 藍(lán)藻膦酸酯利用的生態(tài)意義 研究發(fā)現(xiàn)，phn基因簇的表達(dá)受低磷條件誘導(dǎo)，并受PhoB/R雙組分系統(tǒng)調(diào)控[7]。因此，藍(lán)藻膦酸酯的利用被認(rèn)為是藻株對(duì)低磷生境的適應(yīng)性演化[10]。當(dāng)水體無機(jī)磷耗盡時(shí)，多數(shù)藍(lán)藻可通過合成堿性磷酸酶水解胞外有機(jī)磷酸酯供磷，這也是最為人熟知的藍(lán)藻磷策略之一[4-5]。在這種情況下，利用DOP中剩余難轉(zhuǎn)化的膦酸酯部分，將賦予這些藻株額外的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，而這一策略也被證實(shí)在自然水體中廣泛存在[10-15]。如Dyhrman等在3份海洋水樣中的2份發(fā)現(xiàn)了束毛藻phnD與phnJ基因的高效表達(dá)[10]；Ilikchyan等建立了基于RT-PCR的聚球藻與原綠球藻phnD定量方法，發(fā)現(xiàn)聚球藻相關(guān)基因的表達(dá)豐度與深度及水體磷濃度存在相關(guān)性，而原綠球藻phnD的表達(dá)量在所有樣本中趨于恒定[60]；Ilikchyan等同時(shí)還確定了兩種藻phnD基因的表達(dá)量在馬尾藻海的季節(jié)變化模式[61]；Feingersch等則通過對(duì)全球海洋調(diào)查宏基因組數(shù)據(jù)集分析，確定原綠球藻是海洋表層膦酸酯生物利用的主要貢獻(xiàn)者[62]；Teikari等也觀察到水華藍(lán)藻泡沫節(jié)球藻(Nodulariaspumigena)相關(guān)基因在波羅的海的廣泛表達(dá)[14]。上述結(jié)果，或許能部分解釋這些藍(lán)藻種類在相關(guān)生境的優(yōu)勢(shì)地位。

相比之下，淡水生境中相關(guān)研究較為缺乏。Ilikchyan等通過相同的方法在美國伊利湖(Erie Lake)等數(shù)個(gè)淡水水體檢測(cè)到聚球藻phnD基因的表達(dá)[60]。筆者團(tuán)隊(duì)基于151條藍(lán)藻phnJ基因數(shù)據(jù)集，分別設(shè)計(jì)了針對(duì)擬柱孢藻(圖4紅色進(jìn)化枝)與部分念珠藻目(Nostocales，圖4綠色進(jìn)化枝)phnJ基因的熒光定量PCR引物，確定相關(guān)基因在廣東大沙河水庫的擬柱孢藻水華樣品中豐度較高。同時(shí)，在已公布的25株擬柱孢藻基因組中的23株編碼phn基因簇，也暗示該性狀在擬柱孢藻增殖過程中的保守性與重要性[15]。

4.1.2 藍(lán)藻膦酸酯利用的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn) 擬柱孢藻是熱帶與亞熱帶地區(qū)最常見的淡水水華藍(lán)藻類群。Bai等發(fā)現(xiàn)，盡管銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa) strain 205與擬柱孢藻FACHB-1096均可高效利用2-AEP，但在兩株藻以2-AEP為唯一磷源共培養(yǎng)時(shí)，在設(shè)置的3種起始濃度下(25∶75、50∶50、75∶25)，擬柱孢藻FACHB-1096均在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)成為優(yōu)勢(shì)種[50]。筆者團(tuán)隊(duì)則利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序手段，對(duì)念珠藻(Nostocsp.)FACHB-892甲基膦酸利用過程進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)甲基膦酸可使細(xì)胞從缺磷條件下恢復(fù)并維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)；同時(shí)觀察到了一個(gè)缺磷條件下被抑制的非核糖體多肽合成基因簇(常與藍(lán)藻藻毒素合成相關(guān))，在甲基膦酸添加之后正常表達(dá)。因此，作為一種廣泛存在的磷源與環(huán)境污染物，膦酸酯在驅(qū)動(dòng)特定藍(lán)藻水華暴發(fā)與藻毒素合成過程中的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)當(dāng)獲得足夠重視與深入研究[15]。

4.1.3 藍(lán)藻草甘膦利用的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn) 草甘膦是一種被廣泛使用的廣譜除草劑，其作為甘氨酸類似物，可通過抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS)，導(dǎo)致莽草酸途徑中芳香族氨基酸的生物合成受到抑制，進(jìn)一步影響必需蛋白質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物的合成，阻礙植物和微生物的生命能量途徑[36,47]。隨著其大量使用，草甘膦通過直接噴灑、風(fēng)流、地表徑流與地面沖刷等方式進(jìn)入水環(huán)境，目前已在多數(shù)水體檢測(cè)到草甘膦及其代謝產(chǎn)物氨基甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid，AMPA)的存在[18-24,63]。

通常觀點(diǎn)認(rèn)為，草甘膦及其衍生物對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)存在雙重影響，同時(shí)作為磷源與除草劑存在。早在1991年，科學(xué)家便發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻對(duì)草甘膦的普遍耐受[64]，這種抗性應(yīng)與其抗草甘膦EPSPS酶結(jié)構(gòu)及草甘膦代謝能力相關(guān)[45,65]。研究發(fā)現(xiàn)大部分藍(lán)藻具有草甘膦耐受能力；而包括綠藻與硅藻在內(nèi)的真核藻類，被證實(shí)對(duì)草甘膦敏感。如Vera等[19]與Pérez 等[21]在室外建造與自然湖泊特征形似的人工池塘，比較添加草甘膦和不添加草甘膦池塘中的淡水微生物群落結(jié)構(gòu)，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明商用草甘膦的添加會(huì)導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)群落從對(duì)草甘膦敏感的綠藻和硅藻轉(zhuǎn)變?yōu)榭衫貌莞熟⒌乃{(lán)藻(以超微藍(lán)藻為主)。Huntscha等則發(fā)現(xiàn)Lake Greifensee水體中草甘膦與AMPA的快速消耗伴隨著藍(lán)藻數(shù)目的快速上升[23]。在2020年，Berman等為確定草甘膦的使用對(duì)自然水體浮游植物群落的影響，調(diào)查了南美大草原地區(qū)(使用草甘膦超過30年) 52個(gè)湖泊和巴塔哥尼亞地區(qū)(幾乎沒有草甘膦使用歷史)24個(gè)湖泊，結(jié)果顯示，持續(xù)的草甘膦使用幾乎對(duì)藍(lán)藻沒有毒性作用，反而促進(jìn)了可利用草甘膦的超微藍(lán)藻生長；草甘膦的損耗和藍(lán)藻的增長發(fā)生在相似的時(shí)間，而這一過程也對(duì)該地區(qū)藍(lán)藻水華的發(fā)生產(chǎn)生了潛在影響[24]。

從表1中不難發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻對(duì)草甘膦的可利用性與其是否編碼phn基因簇關(guān)系不大。盡管目前已證實(shí)草甘膦與AMPA的生物降解主要?dú)w因于C-P lyase途徑與phnWAY途徑，但這并不足以解釋表1中多數(shù)藻株的草甘膦利用能力。后續(xù)對(duì)這些藻株草甘膦及AMPA利用機(jī)制的全面解析，是準(zhǔn)確評(píng)估草甘膦之于水生生態(tài)系統(tǒng)風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)與前提。

4.2 藍(lán)藻膦酸酯代謝與水體磷循環(huán)

目前對(duì)膦酸酯生物學(xué)功能的解析尚不充分，常認(rèn)為其作為修飾基團(tuán)維持生物大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或作為抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物存在。如Acker等發(fā)現(xiàn)膦酸酯生物合成能力在海洋原綠球藻的廣泛存在，同時(shí)細(xì)胞又分配高達(dá)40%的磷用于膦酸修飾基團(tuán)合成，表明其參與了原綠球藻關(guān)鍵生物過程；進(jìn)一步對(duì)膦酸酯合成藍(lán)藻的分布特征研究發(fā)現(xiàn)，其相對(duì)豐度在低營養(yǎng)的表層水體較低并隨著深度增加而上升，至營養(yǎng)相對(duì)豐富的深層葉綠素最大層(deep chlorophyll maximum layer)到達(dá)峰值，提出藍(lán)藻膦酸酯的合成是在相對(duì)富營養(yǎng)條件下的一種生存策略；同時(shí)考慮到捕食者與病毒在該層的高豐度，作者更傾向于認(rèn)為膦酸酯作為生物大分子的修飾基團(tuán)，使原綠球藻抵御浮游動(dòng)物捕食與病毒侵染[56]。

同時(shí)，Acker等也嘗試通過實(shí)驗(yàn)否定膦酸酯合成作為藍(lán)藻額外磷庫的假設(shè)，其對(duì)無菌原綠球藻SB(可合成膦酸酯但無膦酸酯利用通路)磷饑餓過程中的膦酸酯含量進(jìn)行追蹤，發(fā)現(xiàn)隨著磷饑餓的深入原綠球藻選擇合成更多的膦酸酯而非消耗原有膦酸酯；同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)盡管膦酸酯分解代謝與合成代謝功能在原綠球藻中廣泛存在，但極少有藻株同時(shí)具備這兩個(gè)功能，進(jìn)一步佐證了其觀點(diǎn)[56]。上述觀點(diǎn)更多停留在細(xì)胞生物學(xué)層面，而未從宏觀的磷循環(huán)角度解釋。在生物的生長過程，磷元素被用于各類有機(jī)物的合成；而當(dāng)生物死亡分解時(shí)，細(xì)胞物質(zhì)重新釋放入環(huán)境，有機(jī)物可被生物利用進(jìn)入另一輪的細(xì)胞生長，周而復(fù)始。而膦酸酯被同一類群具有分解代謝功能的部分利用，或被共生類群中具有分解代謝功能的部分利用，同樣可以維持種群或共生群落的生長與增殖。比如，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，盡管同時(shí)擁有膦酸酯分解代謝與合成代謝功能的藻株數(shù)目較少(僅7屬11株)[15]，但我們常可在野外水體觀察到分解代謝優(yōu)勢(shì)類群與合成代謝優(yōu)勢(shì)類群的共存，如擬柱孢藻屬與浮絲藻屬[66]、Okeania與Moorea[67]等?？偟膩碚f，藍(lán)藻的膦酸酯利用不僅是為其自身供磷的過程，還維持了活躍的磷氧化還原循環(huán)，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)與物質(zhì)循環(huán)有重要意義。因此，藍(lán)藻膦酸酯生物合成驅(qū)動(dòng)的水體有機(jī)磷庫組成與浮游生物群落變化，以及這一過程對(duì)水體磷循環(huán)的影響值得進(jìn)一步探究。

5 藍(lán)藻甲基膦酸代謝與水體好氧甲烷發(fā)生的潛在關(guān)系

在所有藍(lán)藻膦酸酯代謝生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)中，最受關(guān)注的則是甲基膦酸代謝對(duì)水體好氧甲烷發(fā)生的潛在貢獻(xiàn)。水生生態(tài)系統(tǒng)貢獻(xiàn)了全球近一半的甲烷排放，對(duì)其內(nèi)部甲烷發(fā)生機(jī)制的全面解析是實(shí)現(xiàn)“雙碳”目標(biāo)的關(guān)鍵一環(huán)[68]。通常認(rèn)為，甲烷的生物發(fā)生是基于產(chǎn)甲烷古菌 (細(xì)菌)在嚴(yán)格厭氧條件下完成，甲烷在水體厭氧底層產(chǎn)生之后向上遷移，此過程伴隨著甲烷的微生物氧化，其濃度應(yīng)從底層到表層逐漸降低[69-71]。但野外觀察發(fā)現(xiàn)，水體次表層存在甲烷過飽和現(xiàn)象，這一現(xiàn)象被稱為甲烷悖論(methane paradox)，暗示該水層存在好氧的甲烷發(fā)生過程[25-26,72-78]。盡管目前該過程對(duì)全球甲烷排放的具體貢獻(xiàn)仍存在爭(zhēng)議[79-81]，但好氧甲烷發(fā)生又是切實(shí)發(fā)生并被頻繁觀察到的[25-26,72-79]。目前已被證實(shí)的好氧甲烷發(fā)生機(jī)制包括可溶性有機(jī)物的光催化產(chǎn)甲烷[81-83]、特殊底物的生物脫甲基作用產(chǎn)甲烷[25-26,74]、藻類光合[75,84]和固氮作用[85]等。其中藍(lán)藻的甲基膦酸利用也被認(rèn)為是水體好氧甲烷發(fā)生的可能來源之一[25-26,74]。

Karl等發(fā)現(xiàn)，添加甲基膦酸的海洋原水可高效產(chǎn)生甲烷。通過培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)束毛藻在海水代謝甲基膦酸產(chǎn)甲烷過程中發(fā)揮重要作用[25]。Teikari等對(duì)兩株泡沫節(jié)球藻進(jìn)行甲烷排放模式研究，發(fā)現(xiàn)兩株藍(lán)藻均可高效產(chǎn)生甲烷，并確定其積累模式為線性[14]。筆者團(tuán)隊(duì)對(duì)3株藍(lán)藻的甲基膦酸代謝過程進(jìn)行追蹤，確定在整個(gè)生長周期體系均可高效代謝甲基膦酸釋放甲烷，同時(shí)正磷酸鹽的添加可大幅降低甲烷排放速率。而模擬12 h∶12 h晝夜比的36 h甲烷積累實(shí)驗(yàn)顯示，產(chǎn)甲烷多集中于光周期，在夜晚則減弱。上述結(jié)果與已報(bào)道的多個(gè)好氧甲烷發(fā)生特性一致，暗示了藍(lán)藻的膦酸酯利用對(duì)水體好氧甲烷發(fā)生的貢獻(xiàn)[15]。

表2總結(jié)了部分已發(fā)表的好氧甲烷發(fā)生研究中對(duì)藍(lán)藻參與度的評(píng)述。從表中不難發(fā)現(xiàn)，不同文獻(xiàn)中的主要結(jié)論可能存在矛盾，這也體現(xiàn)了好氧甲烷發(fā)生機(jī)制的多樣性與復(fù)雜性?？偟膩碚f，水生生態(tài)系統(tǒng)中好氧甲烷的發(fā)生應(yīng)該是多種生物參與、多機(jī)制的整合結(jié)果，這些機(jī)制隨著水體類型的不同、環(huán)境因素的差異會(huì)出現(xiàn)不同的組合變化。而基于藍(lán)藻的膦酸酯利用在這一過程中持續(xù)發(fā)揮著積極的作用。對(duì)該過程甲烷排放模式與通量的具體解析將有助于水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)甲烷機(jī)制的全面認(rèn)識(shí)。另一方面，全球氣候變化被認(rèn)為是藍(lán)藻水華暴發(fā)頻次與強(qiáng)度增加的驅(qū)動(dòng)因子之一，而如果水華藍(lán)藻可以通過代謝水體中廣泛存在的甲基膦酸產(chǎn)生甲烷，那么這一過程必將正反饋于全球變暖[1-2]。因此對(duì)這一過程的持續(xù)追蹤不僅有助于解析藍(lán)藻水華發(fā)生機(jī)理，也將推動(dòng)藍(lán)藻水華生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的全面評(píng)估。

表2 部分已發(fā)表的好氧甲烷發(fā)生研究中對(duì)藍(lán)藻參與度評(píng)述Tab.2 Participation of cyanobacteria in published filed observations on oxic methane production

6 研究展望

生物利用膦酸酯的生態(tài)意義不僅局限于磷循環(huán)：如Gomez-Garcia等[12]發(fā)現(xiàn)，聚球藻代謝甲基膦酸產(chǎn)生的甲烷，可被藻細(xì)胞用作碳源以維持生長，從而參與碳循環(huán)；Chin等[86]發(fā)現(xiàn)了一條非磷限制依賴的2-AEP特異性利用通路，顯示該膦酸酯可能作為氮源維持生物生長；在2021年，Murphy等[87]則發(fā)現(xiàn)一個(gè)非氮磷濃度依賴型2-AEP特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體，提出2-AEP是可能水體初級(jí)生產(chǎn)者重要的氮源與磷源。因此，后續(xù)研究應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注藍(lán)藻膦酸酯代謝新通路的挖掘與驗(yàn)證，以最終確定藍(lán)藻膦酸酯(包括人工合成源與生物源)代謝的生態(tài)意義與生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

此外，藻際細(xì)菌可能在藍(lán)藻膦酸酯代謝過程中發(fā)揮重要作用。藻際環(huán)境是藻菌關(guān)系發(fā)生的主要界面，其定義為浮游植物細(xì)胞周圍富含其分泌的有機(jī)基質(zhì)的區(qū)域，是水生細(xì)菌的重要微環(huán)境[88]。研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻與藻際細(xì)菌間存在多方面的功能互補(bǔ)，藻際細(xì)菌在藍(lán)藻生長及水華生消過程中發(fā)揮重要作用；同時(shí)藍(lán)藻可根據(jù)自身需求，選擇性招募藻際細(xì)菌[89-91]。而膦酸酯利用細(xì)菌在野外水體廣泛存在，如Villarreal-Chiu等基于功能基因比對(duì)，發(fā)現(xiàn)近16%細(xì)菌基因組編碼phn基因簇，而40%細(xì)菌基因組中存在一種或多種膦酸酯生物利用途徑[11]。在2011年，Saxton等對(duì)草甘膦污染水體膦酸酯代謝途徑進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)浮游細(xì)菌而非藍(lán)藻是草甘膦降解的主要執(zhí)行者；其進(jìn)一步提出在自然環(huán)境中微生物以群落行使功能，而群落的集合功能(the collective ability of the community)遠(yuǎn)比個(gè)體代謝能力重要[18]。此外，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)膦酸酯利用藻際細(xì)菌在微囊藻水華生物樣本與實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)藍(lán)藻藻際中廣泛存在(筆者團(tuán)隊(duì)未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此，對(duì)膦酸酯利用藻際細(xì)菌在藍(lán)藻，尤其是不編碼膦酸酯代謝通路藍(lán)藻的膦酸酯利用過程中作用的研究，將有助于全面理解藍(lán)藻膦酸酯利用的確切機(jī)制及其對(duì)磷循環(huán)的具體貢獻(xiàn)。