eDNA監(jiān)測方法標準化框架及未來圖景*

楊海樂，張 輝，杜 浩

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，武漢 430223)

1 eDNA及其應(yīng)用領(lǐng)域

eDNA (environmental DNA)是指從環(huán)境樣品(水體、土壤、沉積物、空氣、混合物等)中提取的DNA，是各種生物的DNA混合物，區(qū)別于傳統(tǒng)從單物種樣品中提取的DNA[1-2]。eDNA包括來自活的細胞和生物的胞內(nèi)DNA，以及來自自然死亡細胞及細胞結(jié)構(gòu)破碎后所釋放出來的胞外DNA[1]。

eDNA的應(yīng)用最早可追溯到1987年對沉積物中微生物的研究[3]，但正式興起則要到2000年之后[1]。應(yīng)用eDNA的研究早期主要針對微生物類群，擴展到其它生物類群(比如動物)則要略晚幾年[4]，隨著二代測序(next-generation sequencing)和DNA (meta)barcoding技術(shù)的發(fā)展，生態(tài)學(xué)中應(yīng)用eDNA的研究逐漸增多[1,5]，近年來eDNA的應(yīng)用更是在微生物生態(tài)學(xué)[6-8]、生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)學(xué)[9]、古生態(tài)學(xué)[10-11]、保護生物學(xué)[12]、入侵生物學(xué)[13]、特定類群監(jiān)測[14-15]、生物多樣性監(jiān)測[16-19]等各個研究領(lǐng)域中快速發(fā)展[20-21]，樣品類型覆蓋土壤[8,22]、水體[6,22]、沉積物[10-11]、氣溶膠及碎屑浮塵[23-24]、動物糞便[25-26]、動物腸道[27-30]、動植物體表[27-28,30]等，目標類群涉及微生物[6-8,27,29]、浮游生物[31-32]、真菌[33-34]、植物[35]、低等無脊椎動物[14,19]、軟體動物[36-37]、節(jié)肢動物[38]、魚類[39-41]、兩棲爬行類[41-42]、鳥類[23-24]、哺乳類[15,18]等幾乎所有生物類群(表1)。

表1 eDNA應(yīng)用概述Tab.1 Summary of the eDNA usage in different study fields, samples and taxonomies

eDNA在各研究領(lǐng)域中的應(yīng)用，核心一環(huán)是利用eDNA對相關(guān)生物類群實現(xiàn)信息監(jiān)測檢出及其相對豐度的定量[12-13,16,43-44]。eDNA作為標識特定生物存在與否及其相對豐度的指征信號，可以在兩個維度發(fā)揮功能：1)指征DNA來源物種本身的存在及其相對豐度，2)指征DNA來源物種緊密相關(guān)的其它物種或生態(tài)環(huán)境狀況[45]。

2 eDNA監(jiān)測技術(shù)發(fā)展的4個階段

eDNA監(jiān)測技術(shù)的發(fā)展可劃分為技術(shù)探索、技術(shù)驗證、技術(shù)標準化、技術(shù)常態(tài)化應(yīng)用4個階段(圖1)。第一次利用沉積物中的eDNA開展微生物研究[3]，開啟了eDNA監(jiān)測的技術(shù)探索階段；二代測序和DNA (meta)barcoding技術(shù)的成熟實現(xiàn)了eDNA監(jiān)測技術(shù)可用[5]，開啟了eDNA監(jiān)測的技術(shù)驗證階段，推動了eDNA監(jiān)測在各領(lǐng)域研究中驗證性應(yīng)用(表2)[18-19,23,43,46-47]；隨著eDNA監(jiān)測可行性在各領(lǐng)域研究中獲得驗證，同時也認識到eDNA監(jiān)測結(jié)果受各種因素影響[48-50]，為了夯實基于eDNA監(jiān)測的研究結(jié)果的有效性，開始研究eDNA監(jiān)測的技術(shù)標準[22,40,51]、呼吁eDNA監(jiān)測的規(guī)范化[52-53]、嘗試為eDNA監(jiān)測制定技術(shù)標準[54-55]，開啟了eDNA監(jiān)測的技術(shù)標準化階段；經(jīng)過技術(shù)發(fā)展和知識積累，在eDNA監(jiān)測完成技術(shù)標準化后，eDNA監(jiān)測將進入諸多學(xué)者所預(yù)期的技術(shù)常態(tài)化應(yīng)用階段[10,13,16-17]。

圖1 eDNA監(jiān)測的4個發(fā)展階段Fig.1 Four development stages of eDNA monitoring

表2 eDNA監(jiān)測在各領(lǐng)域研究中的驗證性應(yīng)用Tab.2 The test of eDNA monitoring in different study fields

就當前來看，基于eDNA監(jiān)測的研究整體上處于技術(shù)驗證向技術(shù)標準化過渡的階段。當前基于eDNA監(jiān)測的研究多屬于技術(shù)驗證的研究[18,56-59]，只有少部分可歸類為技術(shù)標準化和數(shù)據(jù)積累的研究[22,40,60]。鑒于eDNA監(jiān)測技術(shù)可以實現(xiàn)非接觸、無損傷、高靈敏度、低人力物力時間成本消耗的多物種(或高級分類單元)監(jiān)測的應(yīng)用優(yōu)勢[47,61-63]，可以預(yù)見未來數(shù)年內(nèi)，在一些當前大家比較關(guān)注的問題上，技術(shù)和數(shù)據(jù)積累可能很快就能完成。近年來，國外[54-55]和國內(nèi)(1)http://www.chinacses.org/xw/gsgg/202205/t20220516_982140.shtml.陸續(xù)有eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化文件/手冊推出，其已經(jīng)集中關(guān)注了采樣點(河流、湖泊、庫塘等)選擇、樣品(水、沉積物、生物膜、混合生物樣等)采集與處理、eDNA提取、eDNA分析(擴增、測序、注釋、統(tǒng)計)等內(nèi)容。這些努力推動了eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化的進步，但在其所關(guān)注的內(nèi)容中還依然存在不少問題有待解決[51]，并且還有一部分問題未受到應(yīng)有的關(guān)注。也就是說，在一些未被關(guān)注問題的標準化研究和數(shù)據(jù)積累上，或有可能掉隊，進而延誤整個技術(shù)標準化的發(fā)展。因此，構(gòu)建一個針對eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化的系統(tǒng)性整體框架是非常必要的，將有助于推動eDNA監(jiān)測技術(shù)盡快發(fā)展到技術(shù)常態(tài)化應(yīng)用階段。

3 eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化的系統(tǒng)性整體框架

針對eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化的系統(tǒng)性整體框架的需求，本文借鑒文獻中所指出的eDNA監(jiān)測技術(shù)中可能面臨的一系列問題[12,17,48-50,52]，并對eDNA監(jiān)測技術(shù)流程進行系統(tǒng)化梳理(圖2)，提出eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化中所需重點關(guān)注和解決的10個環(huán)節(jié)(圖1)：樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計、采樣時間設(shè)計、采樣點設(shè)計、采樣方法設(shè)計、樣品前處理、樣品保存、擴增引物選擇、樣品提取-擴增-測序-分析程序、序列比對注釋、監(jiān)測結(jié)果后評估，并就此進行簡要說明和分析。

圖2 eDNA監(jiān)測技術(shù)流程Fig.2 Technological process of eDNA monitoring

該系統(tǒng)性整體框架主要針對基于eDNA metabarcoding技術(shù)路徑的eDNA監(jiān)測方法?；趀DNA監(jiān)測技術(shù)發(fā)展歷程和未來應(yīng)用圖景，我們判斷未來eDNA監(jiān)測技術(shù)發(fā)展應(yīng)用將是以基于eDNA metabarcoding的技術(shù)路徑為主，以非基于eDNA metabarcoding的技術(shù)路徑為輔，同時考慮到非基于eDNA metabarcoding的技術(shù)路徑的eDNA監(jiān)測技術(shù)流程比基于eDNA metabarcoding的技術(shù)路徑的eDNA監(jiān)測技術(shù)流程只在“擴增引物選擇、樣品提取-擴增-測序-分析程序、序列比對注釋”3個環(huán)節(jié)有差異或省略，所以本文著重闡述基于eDNA metabarcoding技術(shù)路徑的eDNA監(jiān)測方法的標準化框架，兼顧非基于eDNA metabarcoding技術(shù)路徑的eDNA監(jiān)測方法的標準化框架。

3.1 樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計

eDNA監(jiān)測樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計的核心是樣品重復(fù)數(shù)與目標檢出度之間關(guān)系的測算。eDNA監(jiān)測屬于抽樣調(diào)查，抽樣重復(fù)數(shù)越多檢出的信息種類數(shù)也越多(同時，檢出的信息相對豐度結(jié)構(gòu)也越穩(wěn)定)，這種增加遵循物種積累曲線的對數(shù)增長基本規(guī)則，所以會存在一個樣品重復(fù)數(shù)和目標檢出度之間的相對優(yōu)化的投入產(chǎn)出點[40]。比如，在長江武漢江段開展的魚類eDNA監(jiān)測中，10個重復(fù)可以實現(xiàn)近80%的魚類物種檢出度目標，13個重復(fù)可以實現(xiàn)近90%的魚類物種檢出度目標，17個重復(fù)可以實現(xiàn)近95%的魚類物種檢出度目標[40]。在長江武漢江段開展的環(huán)境微生物eDNA監(jiān)測中，8個重復(fù)可以實現(xiàn)近80%的細菌物種檢出度目標，17個重復(fù)可以實現(xiàn)近90%的細菌物種檢出度目標，28個重復(fù)可以實現(xiàn)近95%的細菌物種檢出度目標[29]。

樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計，主要是在一個相對狹小的時間和空間內(nèi)，通過對采樣時間和采樣空間的離散設(shè)計，以隨機抽樣假重復(fù)的方式采集一系列樣品，通過樣品的處理、測序、分析、注釋、物種積累曲線分析，計算最大可檢出物種數(shù)(operational taxonomic units，OTUs)的最優(yōu)估值，獲得樣品重復(fù)數(shù)和目標檢出度之間的量化關(guān)系，然后根據(jù)一定的檢出度目標，確定eDNA監(jiān)測所需的樣品重復(fù)數(shù)[40]。針對單物種監(jiān)測的樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計，可以根據(jù)一系列重復(fù)抽樣監(jiān)測中目標物種群體的檢出頻次，進行基于0/1隨機抽樣模型的概率計算來確定樣品重復(fù)數(shù)與目標檢出度的關(guān)系。

樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計的標準化原理簡單，只需要在各具體區(qū)域針對各具體目標類群在各具體環(huán)境條件范圍內(nèi)開展實驗積累數(shù)據(jù)，建立標準參考庫，然后根據(jù)特定目標檢出度確定樣品重復(fù)數(shù)，或者根據(jù)樣品重復(fù)數(shù)與目標檢出度關(guān)系選取具有最優(yōu)投入產(chǎn)出的樣品重復(fù)數(shù)。

3.2 采樣時間設(shè)計

eDNA監(jiān)測采樣時間設(shè)計的核心是監(jiān)測時間有效度測算。因為eDNA在環(huán)境中存在一定的持留時間[60,64]，所以eDNA監(jiān)測的采樣時間設(shè)計需要解決兩個問題：1)怎么避免前后兩次采樣監(jiān)測到的是同一批信號源，2)怎么避免出現(xiàn)大的監(jiān)測時域空缺，這需要對eDNA的監(jiān)測時間有效度進行量化測算。

監(jiān)測時間有效度，指在監(jiān)測區(qū)域內(nèi)監(jiān)測目標群體的eDNA降解至不可檢出的時間。不可檢出取決于兩個層面的因素：eDNA片段降解至短于監(jiān)測擴增片段長度[65]，可檢出eDNA片段的濃度降解或稀釋至低于檢出限[66]。由于監(jiān)測時間有效度受eDNA初始片段長度、初始濃度、降解速率等的影響[60,64]，eDNA的釋放形態(tài)和釋放率存在較強的類群差異性[67]，eDNA降解速率受來源(生物類群)[67]、形式(胞內(nèi)胞外)[68]、初始濃度[69]、溫度[70-72]、賦存介質(zhì)[73]、BOD[69]、營養(yǎng)鹽組成與濃度[68,70]、pH[72,74]、紫外線[72]、葉綠素[69]、環(huán)境微生物[65]及胞外酶等因素影響[20,75]，監(jiān)測時間有效度呈現(xiàn)出物種差異性、類群差異性、季節(jié)差異性、環(huán)境特征差異性等特征[60,76]。

在陸地上和靜水水體中(以及其它的一些類似情況，比如附著于器物表面)，采樣時間設(shè)計主要是在一個具體環(huán)境條件下，對實際目標生物類群密度條件下所產(chǎn)生的eDNA的降解過程進行定量。因為eDNA的降解存在指數(shù)降解的規(guī)律[20,69-70,77]，所以可以用半衰期來進行定義[65]。因為生物個體所釋放的eDNA都是從大片段降解為小片段再降解為更小的片段，因而eDNA長片段的半衰期比短片段的半衰期更短[64-65,78]，用長片段引物比用短片段引物進行eDNA監(jiān)測時的時間窗口更小。

在流水水體中和強烈受流域過程影響的陸地上(以及其它的一些類似情況，比如受空氣流動而傳播的氣溶膠和碎屑浮塵)，采樣時間的設(shè)計不僅僅需要考慮eDNA降解過程，還要考慮eDNA在水體、沉積物、土壤、空氣等采樣目標介質(zhì)中的持留時間。在徑流、氣流的侵蝕、搬運過程影響下，eDNA會在尚未完全降解的情況下被輸移到其它地方[79-82]，進而導(dǎo)致原位事實上的eDNA不可檢出，因而這種情況下的采樣時間設(shè)計就要考慮eDNA持留時間這一參數(shù)，而非單純的降解過程。

采樣時間設(shè)計的標準化影響因素復(fù)雜，但針對常規(guī)應(yīng)用的標準化方法簡單，只需要在各具體區(qū)域針對各具體目標類群在各具體環(huán)境條件范圍內(nèi)開展實驗積累數(shù)據(jù)，建立標準參考庫，然后根據(jù)相應(yīng)監(jiān)測時間有效度確定監(jiān)測采樣時間間隔。

3.3 采樣點設(shè)計

eDNA監(jiān)測采樣點設(shè)計的核心是監(jiān)測空間有效度測算。因為eDNA在環(huán)境中存在一定的持留時間[60,64]，受徑流、氣流、擴散等的驅(qū)動以及動物攜帶傳播而存在一定的空間遷移[9,75,83]，所以eDNA監(jiān)測的采樣點設(shè)計需要解決兩個問題：1)怎么避免兩個采樣點監(jiān)測到的是同一個信號源，2)怎么避免出現(xiàn)監(jiān)測區(qū)域大的空間空缺，這需要對eDNA的監(jiān)測空間有效度進行量化測算。

針對流水系統(tǒng)中的eDNA監(jiān)測，有學(xué)者提出用基于水文學(xué)模型，考慮eDNA降解速率以及各環(huán)境因子，通過模型模擬計算來設(shè)計eDNA監(jiān)測的最適采樣方案[84]。這屬于通過受控實驗明晰環(huán)境因子對eDNA輸移、降解過程中各環(huán)節(jié)的影響[85-86]，再通過各環(huán)境因子的參數(shù)化、eDNA輸移降解過程各環(huán)境的模型化來實現(xiàn)對eDNA監(jiān)測的最適采樣方案設(shè)計的思路[75]。另外一個思路，即暫時先把eDNA產(chǎn)生、輸移、降解等的復(fù)雜過程(各物種的eDNA形成參數(shù)、各物種eDNA的降解速率參數(shù)、各環(huán)境要素對eDNA降解的影響參數(shù))打包成黑箱，接受不確定性、控制不確定性、量化不確定性，通過對eDNA輸入端和輸出端關(guān)聯(lián)性的量化分析，實現(xiàn)對eDNA監(jiān)測的最適采樣方案設(shè)計，這是我們所提出的流域生物信息流分析框架的處理問題方式[9,22]。由于該思路所需確定的背景變量少、所需預(yù)先開展的計算簡單，雖然精確度有所折損，但更適合大范圍推廣使用。

因為eDNA的降解存在指數(shù)降解的規(guī)律[20,69-70,77]，在流水水體中eDNA的監(jiān)測空間有效度可以用無效生物信息流(用來標記沒有生命活性的生物物質(zhì)，即來自自然死亡細胞及細胞結(jié)構(gòu)破碎后所釋放出來的胞外DNA)的半衰距離來量化[22]。因為依賴于eDNA的降解速率以及由徑流驅(qū)動的運輸、吸附與沉積、再懸浮等過程[75,79-82]，其中eDNA的降解速率受來源(生物類群)[67]、形式(胞內(nèi)胞外)[68]、初始濃度[69]、溫度[70-72]、賦存介質(zhì)[73]、BOD[69]、營養(yǎng)鹽組成與濃度[68,70]、pH[72,74]、紫外線[72]、葉綠素[69]、環(huán)境微生物[65]及胞外酶等因素影響[20,75]，無效生物信息流半衰距離會呈現(xiàn)出物種差異性、類群差異性、季節(jié)差異性[22]，以及基于河流特征的區(qū)域性差異。比如，在青藏高原一個小型河流中，春季封凍期的細菌無效生物信息流半衰距離為1.5 km左右，秋季多云天的細菌無效生物信息流半衰距離為10.5 km左右，夏季降雨天的細菌無效生物信息流半衰距離為14.5 km左右，而夏季降雨天的真核生物無效生物信息流半衰距離為4.5 km左右[22]。因為樣品重復(fù)數(shù)對流域生物信息流的估算準確度和精密度有影響[87]，所以采樣點設(shè)計需要基于具體樣品重復(fù)數(shù)所指向的目標檢出度進行，并通過后驗概率檢驗來對eDNA監(jiān)測空間有效度進行評估。

在靜水水體中eDNA的監(jiān)測空間有效度往往依賴于水體內(nèi)監(jiān)測目標類群的空間分布以及eDNA在水體中的擴散方向和范圍，監(jiān)測空間有效度可以用eDNA空間分布差異度和eDNA矢量化有效擴散距離來量化。比如，在不同規(guī)模(面積分別為3、122和4343 hm2)的湖泊中的eDNA監(jiān)測研究顯示，近岸水體eDNA樣品檢出的魚類物種數(shù)比湖中水體eDNA樣品檢出的魚類物種數(shù)和多樣性高，且大多數(shù)物種相同[88]。在海洋中的eDNA監(jiān)測研究顯示，受水體垂直分層和水生生物群落結(jié)構(gòu)的垂直分層影響，采樣點也需根據(jù)需要進行分層設(shè)置[89]。

對陸地生物的eDNA監(jiān)測的采樣點設(shè)置，可以基于由陸地到水體的流域生物信息流的框架通過河流水體eDNA來監(jiān)測[9]，也可以比照靜水水體中eDNA監(jiān)測框架來開展，只是需要將eDNA在水體中的擴散過程替換成陸地動物移動/攜帶擴散和風力驅(qū)動擴散過程。比如，在青藏高原一個小流域中，離岸5 m內(nèi)的陸地土壤eDNA中檢出的細菌可以在河流水體中檢出的比例，在春季封凍期為16.6%，秋季多云天為48.1%，夏季降雨天為62.8%，真核生物的檢出普遍要低一些，夏季降雨天的真菌檢出比例為44.7%，后生動物的檢出比例為22.6%[22]。

對附著于器物或者生物個體(內(nèi))表面的eDNA監(jiān)測的采樣點設(shè)置，主要依賴于對所監(jiān)測目標eDNA分布的預(yù)判，而這個目標eDNA由監(jiān)測或研究目的所決定。比如監(jiān)測動物的腸道微生物，采樣點為動物腸道(有的會區(qū)分前腸、中腸、后腸)或者其所延伸的排泄物[25,27-30]；監(jiān)測動物的體表共生微生物，采樣點為動物皮膚或者特定器官/區(qū)域的外表皮[27-28]。

采樣點設(shè)計標準化的影響因素復(fù)雜，對于存在明確eDNA空間輸移的情況，可以選擇黑箱處理方法，基于流域生物信息流分析框架，計算eDNA監(jiān)測的空間有效度，并對其進行概率檢驗；對于不存在明確eDNA空間輸移的情況，可以借鑒生態(tài)學(xué)中經(jīng)典的種-面積曲線思路，基于均勻采樣設(shè)計來量化采樣點間距或采樣數(shù)量與目標檢出能力的關(guān)系。具體標準化工作只需要在各具體區(qū)域針對各具體目標類群在各具體環(huán)境條件范圍內(nèi)開展實驗積累數(shù)據(jù)，建立標準參考庫，然后根據(jù)相應(yīng)監(jiān)測空間有效度確定監(jiān)測樣點。

3.4 采樣方法設(shè)計

對不同地區(qū)、對象、目的，eDNA監(jiān)測需要選取不同的樣品類型(水體、沉積物、土壤、動物糞便、大型昆蟲、物體表面附著物)或樣品類型組合。因為生物在分布區(qū)域內(nèi)不同樣品介質(zhì)中的eDNA存留會存在明顯差異，不同樣品介質(zhì)對不同的生物eDNA的持留方式、持留能力和持留時間也會存在明顯差異，環(huán)境條件也會對這兩類差異產(chǎn)生顯著影響，進而導(dǎo)致不同樣品類型所保存的類群不一樣，或?qū)Ω黝惾旱母采w度不一樣，所以在相關(guān)監(jiān)測工作中，要注意選擇最適樣品類型(組合)進行采樣。比如，一個對澳大利亞(印度洋和南大洋)和哈薩克斯坦(里海)港口的eDNA監(jiān)測研究顯示，來自表層水、沉積物、沉降盤、浮游拖網(wǎng)的eDNA樣品檢出的真核生物類群具有明顯分異，不同類型樣品eDNA監(jiān)測到的真核生物類群存在系統(tǒng)性互補[90]。在對西澳大利亞的高溫荒漠氣候的Pilbara和高溫地中海氣候的Swan海岸平原的陸生生物eDNA調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，食肉動物糞便eDNA樣品比土壤eDNA樣品能夠檢出更多的植物和無脊椎動物類群(科級別)[91]。沉積物中的eDNA降解速率比水體中的eDNA降解速率要慢、持留時間要長，同樣體積的樣品，沉積物中累積的eDNA濃度比水體的要高、時間跨度比水體的要長[73,92]，這可為不同監(jiān)測目標下的樣品類型選擇提供參考。因為地上節(jié)肢動物留在植物葉面的eDNA容易受雨霧沖刷而下落[93]，所以林間節(jié)肢動物eDNA監(jiān)測建議采集植物冠/葉下的露水、雨水或者表層土壤樣品。

野外采樣量一方面取決于樣品類型和eDNA監(jiān)測目標，另一方面取決于eDNA提取過程中樣品的最大使用量。當前eDNA提取最常用的試劑盒法中，eDNA提取所使用的樣品量通常不超過1.5 mL。所以對于不需要預(yù)處理且能夠大量采集的沉積物樣品、土壤樣品等，可以用5 mL無菌離心管采集3～5 mL樣品[22]，根據(jù)需求可增加樣品重復(fù)數(shù)；對于不需要預(yù)處理但樣品較不易采集的生物腸道樣品、生物體表黏膜樣品、物體表面附著物樣品、氣體懸浮物沉降樣品等，可以用2 mL無菌離心管采集0.5～2 mL樣品[27,29]，根據(jù)需求可增加樣品重復(fù)數(shù)；對于需要通過抽濾來富集eDNA的水體樣品，目前多以1.5 L為量(不同研究不同標準對這一量的要求有所差異)，在不同水體狀況和孔徑濾膜條件下，抽濾完所有水樣可能需要使用多張(1～5)濾膜，多張濾膜在eDNA提取時可以作為一份樣品一次性提取[22,29]，根據(jù)需求可增加樣品重復(fù)數(shù)；對于需要通過抽濾來富集eDNA的氣溶膠及碎屑浮塵樣品，可以基于研究區(qū)域的空氣懸浮物狀況來確定抽濾空氣的時間(0.5～2 h)[23-24]，根據(jù)需求可增加樣品重復(fù)數(shù)。

不同樣品(樣品重復(fù))不要混樣。因為eDNA監(jiān)測采樣的隨機抽樣特性以及eDNA在介質(zhì)中非均一分布特性，各樣品中所包含的各物種的eDNA豐度不一，豐度超過檢出閾值的物種大概率會被檢出，低于檢出閾值的大概率不會被檢出，所以各樣品中所檢出的群落結(jié)構(gòu)也不一，一個樣點所有樣品的檢出結(jié)果(在分析過程中)合并在一起可以更貼近事實地反映其群落結(jié)構(gòu)狀況；而不同樣品進行混樣(但不進行eDNA富集操作)會稀釋某個樣品所偶然抓住的某低資源量物種超過檢出閾值的eDNA豐度，導(dǎo)致一系列低資源量物種的eDNA豐度低于檢出閾值，進而導(dǎo)致檢出結(jié)果的系統(tǒng)性誤差。綜合分析已有的qPCR實驗研究，不同實驗室不同研究條件下的eDNA檢出限(limits of detection)在4～250個拷貝每個反應(yīng)(擬合結(jié)果范圍略有擴張，2.19～260)，eDNA量化限(limits of quantification)在10～1920個拷貝每個反應(yīng)(擬合結(jié)果范圍略有左偏，6～839)[66]。有案例研究也證實，基于各樣點樣品單獨測序結(jié)果的物種累計曲線比基于各樣點樣品混合樣重復(fù)測序的物種累計曲線所獲得的物種數(shù)和多樣性要高[88]。

3.5 樣品前處理

樣品前處理主要是指對水樣的處理以獲得富集的eDNA樣品，因為通常情況下土壤、沉積物、固體混合物、痕跡樣品采集后直接密封冷凍即可。最高效的水樣預(yù)處理方式是過濾，不同的過濾方式所得到的結(jié)果差異不大，但過濾用的濾膜孔徑規(guī)格和濾膜材質(zhì)對結(jié)果有明顯影響：孔徑越小所捕捉到的eDNA類群越多，其代價是過濾時間越長，在實踐中需要根據(jù)監(jiān)測目標的形態(tài)(病毒、細菌、浮游生物、宏體生物碎片、游離DNA)進行權(quán)衡；對于濾膜材質(zhì)，有研究顯示用河流和湖泊水體eDNA監(jiān)測真核生物，玻璃纖維濾膜比樹脂濾膜的過濾效果好，纖維素酯濾膜比聚醚砜濾膜的過濾效果好[94-96]。

不建議對水樣進行預(yù)先過濾(除了為富集某特定類群eDNA而進行的篩分)。一些研究對較渾濁水樣進行預(yù)先過濾以去除大顆粒雜質(zhì)，然后用微孔濾膜過濾獲得細顆粒的eDNA樣品，但考慮到大顆粒雜質(zhì)對于用微孔濾膜進行過濾不會產(chǎn)生特別大的影響，以及預(yù)處理在除去大顆粒雜質(zhì)時也會去除相當一部分被大顆粒雜質(zhì)吸附的目標eDNA，所以對懸浮顆粒較多、泥沙含量較高或富營養(yǎng)化的水體可進行分樣處理(通過靜置或離心將顆粒物進行富集形成沉淀物樣品，按照沉積物樣品的處理方式進行eDNA提取，上清液進行抽濾形成濾膜上的樣品，進行eDNA提取)，也可以延長抽濾時間、壓縮抽濾水體體積、增加樣品的重復(fù)數(shù)，但不建議對水樣進行預(yù)先過濾。一項對海洋浮游動物群落結(jié)構(gòu)的案例研究確證了經(jīng)過預(yù)先過濾的eDNA樣品中所檢出的生物類群顯著少于未經(jīng)預(yù)先過濾的eDNA樣品中所檢出的[97]。因為預(yù)先過濾并不降低樣品污染、測序錯誤的可能性，所以減少的生物類群大概率是稀有物種/類群。eDNA監(jiān)測的主要目的和優(yōu)勢之一是對稀有物種的檢出，而非對傳統(tǒng)方法能夠輕易得出的結(jié)果進行重復(fù)驗證，所以不進行水樣預(yù)先過濾的代價是值得的。

對于部分特定目的或針對特定類群的非水體eDNA監(jiān)測，也可以通過樣品前處理來提高監(jiān)測效率。比如，對在兩個鮭魚養(yǎng)殖場采集的84個底泥樣品分組進行篩分對比實驗，非篩分樣品中后生動物序列(metazoan reads)的平均百分比分別為19.53%和17.10%；篩分樣品中后生動物序列的平均百分比分別為81.03% 和89.92%[98]。篩分有效地清除了硅藻門類群(如海藻和浮游植物)，富集了后生動物。篩分樣品中eDNA測序中底棲動物平均占比在一個樣點是未篩分樣品的4.1倍(47.29% vs 11.46%)，在另一個樣點是未篩分樣品的5.7倍(20.03% vs 3.52%)[98]。

3.6 樣品保存

樣品保存主要指樣品從被采集到DNA提取之間的這段時間的保存。對于不需要預(yù)處理的樣品(比如土壤、沉積物、固體混合物、痕跡等)最有效且便捷的方法即-80℃、-20℃或干冰浴冷凍保存。對于水樣，冰浴保存可以降低eDNA在水中的降解速率[99]，也有用陽離子表面活性劑來抑制水體中eDNA降解[100]，但是不如低溫保存有效[101]。當然，最有效的還是盡快進行過濾，把eDNA富集在濾膜上，然后干燥冷凍(-80℃、-20℃)保存[96]。

3.7 擴增引物選擇

擴增引物，根據(jù)eDNA監(jiān)測的對象和目的選擇用物種特異性引物或者metabarcoding通用引物。物種特異性引物主要針對特定物種的eDNA(快速)監(jiān)測檢出與定量(比如病源監(jiān)測、入侵物種監(jiān)測、瀕危物種監(jiān)測等)，metabarcoding通用引物主要針對目標生物類群的eDNA監(jiān)測檢出(比如對細菌、魚類、植物、真核生物等的物種組成監(jiān)測)[49]。不同類群往往有不同的常用通用引物(比如真菌常用ITS、18S rRNA基因的通用引物，細菌、古菌常用16S rRNA基因的通用引物，后生動物常用COI、線粒體12S rRNA、Cytb基因的通用引物)。不同通用引物之間，有一定的擴增類群范圍、類群內(nèi)擴增比例、物種/遺傳辨識度差異[102-104]。傳統(tǒng)通用引物在越來越多的使用中逐漸形成大勢并不斷積累數(shù)據(jù)，同時也有不少新的通用引物被開發(fā)出來[35,105-106]，但新開發(fā)通用引物是否真的好用，是否有足夠的優(yōu)勢替代已塑造了一定程度路徑依賴的傳統(tǒng)通用引物，還有待實踐和時間檢驗。

對于魚類，針對線粒體12S rRNA基因的通用引物比針對COI基因的通用引物有更好的檢出效果[104,107]。當前的狀況是，針對線粒體12S rRNA基因的通用引物檢出結(jié)果可重復(fù)性高，但數(shù)據(jù)庫不全；針對COI基因的通用引物檢出結(jié)果可重復(fù)性低，但數(shù)據(jù)庫全[107]，因而當前用COI的通用引物還是更普遍一些。隨著線粒體12S rRNA數(shù)據(jù)庫的完善，線粒體12S rRNA的通用引物之后或?qū)⑹且粋€重要的可選項。由于當前各metabarcoding通用引物對目標類群的擴增都存在一定的效率缺陷，使用多個通用引物分別進行擴增測序分析，并對結(jié)果進行并聯(lián)分析能夠一定程度上緩解部分覆蓋缺陷問題，但是否能夠徹底解決覆蓋缺陷問題、是否能夠準確反映群落結(jié)構(gòu)尚未確定。

對樣品進行環(huán)境宏基因組(metagenome)測序并系統(tǒng)注釋，也是一種檢出方式[108]。宏基因組測序能夠覆蓋各生物類群，所得的數(shù)據(jù)量大得多，但成本卻高得多，結(jié)果的精確度和覆蓋度也未確定，目前在微生物上用得多，在其它類群中用得非常少，需要根據(jù)實際需求進行選擇，并對類群覆蓋度和注釋效率進行相應(yīng)定量評估。

3.8 樣品提取-擴增-測序-分析程序

對每一類樣品，應(yīng)該有標準化的eDNA提取-擴增-測序-分析程序。因為eDNA提取方法和具體操作程序、PCR擴增的退火溫度和循環(huán)數(shù)、測序平臺和測序技術(shù)、分析流程和具體參數(shù)都會對最后所解析出來的OTUs豐度評估產(chǎn)生一定影響，所以只有統(tǒng)一標準化的eDNA提取-擴增-測序-分析程序，其最后所得的結(jié)果之間才具有完全的可比性[109]。對于具體的eDNA提取方法，有學(xué)者提出特定改進方案[110]，但用商業(yè)試劑盒是越來越普遍的方式[111]。從現(xiàn)狀來看，從eDNA商業(yè)試劑盒提取、eDNA樣品質(zhì)量檢測，到PCR擴增、PCR產(chǎn)物質(zhì)量檢測、PCR產(chǎn)物提取與純化、PCR產(chǎn)物定量，再到DNA文庫構(gòu)建、測序、序列數(shù)據(jù)質(zhì)控、OTU聚類、OTU豐度統(tǒng)計[22]，包括其中各個步驟的污染控制、參數(shù)設(shè)置及調(diào)優(yōu)，商業(yè)生物技術(shù)公司都有一整套標準化技術(shù)流程及數(shù)據(jù)處理軟件，并在為非常多的eDNA相關(guān)研究提供技術(shù)服務(wù)支持。從目前趨勢可以預(yù)見，樣品提取-擴增-測序-分析一整套都委托給商業(yè)生物技術(shù)公司也將是未來的一個重要選項和趨勢[112]。

雖然由商業(yè)生物技術(shù)公司執(zhí)行的eDNA樣品提取-擴增-測序-分析程序在執(zhí)行過程中由公司技術(shù)人員不斷技術(shù)參數(shù)調(diào)優(yōu)進而逐漸趨于標準化，但還存在兩個細節(jié)問題尚待解決并值得注意：1)擴增當中的引物偏好問題。該問題的存在比較普遍，并且是對群落結(jié)構(gòu)定量產(chǎn)生重要影響的技術(shù)誤差來源[113]，這個問題的解決一方面需要開發(fā)更好的偏好性更小的通用引物來緩解，另一方面也可以通過定量引物偏好，對整體結(jié)果進行模擬和逆向校正。2)分析當中的OTU聚類的參數(shù)設(shè)置問題。該問題是一個比較直觀的問題，OTU聚類時序列相似度設(shè)置越高，聚類形成的OTU數(shù)目就越多，進而可能影響到后續(xù)的序列比對和分類學(xué)注釋。這是一個計算量和結(jié)果精確度的權(quán)衡，可以在算力允許的情況下自行調(diào)試合適的參數(shù)，比如97%、99%、99.9%。

對序列的分析，除了OTU聚類分析路徑之外，ASV(amplicon sequence variant)降噪分析路徑也在逐漸獲得相關(guān)研究者的關(guān)注。從OTU聚類分析路徑和ASV降噪分析路徑單獨使用比較來看，聚類及注釋結(jié)果各有優(yōu)缺點，比如針對COI基因所得聚類OTUs和降噪所得ASVs差不多，并且注釋所得分類單元也差不多，而針對18S 基因所得聚類OTUs明顯比降噪所得ASVs要多，并且注釋所得分類單元也要多[103]。有研究提出OTU聚類分析路徑和ASV降噪分析路徑不應(yīng)該是相互替代的，而是相互補充的，建議用ASV來指示單倍型，用OTU來指示物種，避免相關(guān)信息丟失，進而提高不同研究間的可加性和可比性[114]。聚類分析路徑和降噪分析路徑都有不止一種算法[115-116]，相應(yīng)類別之內(nèi)的算法在使用中或多或少可互相混合、折中和交換[114]，在標準化過程中建議選定一種或幾種簡易有效的算法進行計算和結(jié)果展示。

對于針對特定物種的eDNA(快速)監(jiān)測檢出與定量，往往只需要使用物種特異性引物進行PCR定性檢出和qPCR或ddPCR定量分析[49]，不需要進行測序、序列分析、序列比對注釋等步驟環(huán)節(jié)。使用物種特異性引物進行qPCR或ddPCR定量分析，主要是進行eDNA相對豐度的定量，因為eDNA相對豐度在一定條件下和目標物種的個體數(shù)量呈線性正相關(guān)[117-118]，進而可被用來開展魚類自然繁殖監(jiān)測[59]。通過eDNA定量分析可以為各物種/類群的eDNA釋放速率、eDNA降解速率、eDNA濃度與個體數(shù)量關(guān)系等進行數(shù)據(jù)積累，進而為未來用模型根據(jù)eDNA濃度模擬計算目標類群個體數(shù)量或資源量提供數(shù)據(jù)庫支持。

3.9 序列比對注釋

序列比對注釋的關(guān)鍵在于參考數(shù)據(jù)庫的建立與完善。對于特定目標物種的監(jiān)測(比如特定珍稀瀕危物種監(jiān)測、入侵種監(jiān)測、寄生蟲監(jiān)測等)只需要通過物種特異性引物進行PCR擴增檢測確認即可，無需進行測序和序列比對[13]；如果需要對特定目標進行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，則需要進行測序和相關(guān)序列分析。對于大類群目標的監(jiān)測則需要特定的序列參考數(shù)據(jù)庫，比如真菌的ITS基因Unite數(shù)據(jù)庫、18S rRNA基因Silva數(shù)據(jù)庫，細菌和古菌的16S rRNA基因Silva或Greengene數(shù)據(jù)庫，后生動物的線粒體COI基因用NCBI核酸數(shù)據(jù)庫等。對于具體區(qū)域的具體類群的eDNA監(jiān)測往往會因為目標數(shù)據(jù)的有限性使得常用參考數(shù)據(jù)庫中相關(guān)序列存儲不全所造成的結(jié)果遺漏顯得不可接受，所以參考數(shù)據(jù)庫的完善對于eDNA監(jiān)測的應(yīng)用非常必要[40]。在公共參考數(shù)據(jù)庫不能滿足特定區(qū)域特定類群的研究需求時，可以根據(jù)已有材料、已知信息建立本地參考數(shù)據(jù)庫[119-120]。

序列比對注釋中另一個需要特別注意的問題是分類置信度的設(shè)置。在參考數(shù)據(jù)庫中參考序列對物種覆蓋不是十分完全的情況下，如果序列比對注釋的分類置信度設(shè)置得較低，往往會出現(xiàn)一些錯誤注釋，即把某一物種的序列錯誤匹配到序列相似的另一物種上，或者把缺少參考序列的某一物種的序列強行匹配到序列相似的另一物種上[40]，在當前參考數(shù)據(jù)庫建設(shè)條件下，后一種情況更為普遍。在參考數(shù)據(jù)庫中參考序列對遺傳多樣性覆蓋不是十分完全的情況下，如果序列比對注釋的分類置信度設(shè)置得很高，往往會出現(xiàn)一些沒有注釋的OTU，即該OTU序列通過比對無法與參考數(shù)據(jù)庫中的任一序列形成匹配，這種問題在基于不完備的本地數(shù)據(jù)庫的比對注釋中較為常見。這是一個參考數(shù)據(jù)庫完備程度和結(jié)果匹配精確度之間的適配，可以自行調(diào)試合適的參數(shù)，比如97%、99%、99.9%。比對注釋所使用的算法差異(比如BLAST、RDP classifier、Bayesian Lowest Common Ancestor)和軟件差異(比如Qiime2、Usearch)對結(jié)果也會產(chǎn)生一定影響，其結(jié)果的準確度需要相應(yīng)的比較研究來確定，在對不同研究的注釋結(jié)果進行橫向比較時應(yīng)對算法和軟件進行統(tǒng)一。

3.10 監(jiān)測結(jié)果后評估

監(jiān)測結(jié)果后評估主要是對監(jiān)測結(jié)果的樣品重復(fù)數(shù)的后評估、時間有效度的后評估、空間有效度的后評估、注釋有效度的后評估，是利用當次監(jiān)測結(jié)果和歷史參考數(shù)據(jù)對當次監(jiān)測過程中相關(guān)環(huán)節(jié)的評估，其它內(nèi)容不是不需要評估，而只是因為無法根據(jù)當次監(jiān)測結(jié)果進行后評估。樣品重復(fù)數(shù)的后評估，即以當次監(jiān)測所采樣品的檢出結(jié)果分析樣品重復(fù)數(shù)和目標檢出度(或特定目標檢出概率)之間的關(guān)系，計算當次監(jiān)測所采樣品重復(fù)數(shù)所能達到的檢出度水平，是對樣品重復(fù)數(shù)設(shè)計的校驗。時間有效度的后評估，即以當次監(jiān)測相鄰采樣時間各相應(yīng)采樣點所獲得的監(jiān)測結(jié)果差異度(組成差異度或豐度差異度)，結(jié)合可確認的物種差異或群落結(jié)構(gòu)差異，分析eDNA的半衰期，評估當次監(jiān)測的時間有效度，是對采樣時間設(shè)計的校驗。空間有效度的后評估，即以當次監(jiān)測各樣點所獲得的監(jiān)測結(jié)果計算eDNA輸移或擴散的半衰距離，評估當次監(jiān)測的空間有效度，是對采樣點設(shè)計的校驗。注釋有效度的后評估，即以當次監(jiān)測所測定序列注釋結(jié)果與傳統(tǒng)調(diào)查結(jié)果相比較，以及與其它參考數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果相比較，評估當次監(jiān)測中參考數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果的有效度，是對參考數(shù)據(jù)庫及分類學(xué)注釋的校驗。比如在長江武漢江段開展的魚類eDNA監(jiān)測中，用線粒體COI基因宏條形碼(引物mlCOIintF/jgHCO2198R)共檢出89種魚類，其中有30種由歷史捕撈調(diào)查結(jié)果所確認，而與之平行開展的捕撈調(diào)查監(jiān)測記錄到35種魚類，其中24種在eDNA監(jiān)測中被檢出[40]。

示例化說明，假如有針對某一小流域的動物多樣性監(jiān)測方案，每個采樣點位設(shè)計5個樣品重復(fù)，每2個月開展1次監(jiān)測，整個樣點沿水系及其岸帶分布且樣點間徑流距離10 km，樣品采集以溪流水體和岸帶土壤為對象，水樣通過抽濾獲得富集eDNA濾膜，干燥冷凍保存運輸，土樣直接冷凍保存運輸，測序引物選擇針對真核生物的COI基因通用引物，樣品委托商業(yè)生物科技公司進行提取、擴增、測序、分析，將已聚類OTU序列比對公共參考數(shù)據(jù)庫進行分類學(xué)注釋，獲得目標類群基礎(chǔ)生物組成及相對豐度信息。樣品重復(fù)數(shù)的后評估，即對每個采樣點位5個樣品重復(fù)的結(jié)果進行物種積累曲線分析，估算理論可檢出物種數(shù)，并根據(jù)物種積累曲線模擬獲得樣品重復(fù)數(shù)和物種檢出度間的量化關(guān)系，給出當前監(jiān)測方案的檢出度。時間有效度的后評估，即對每個采樣點位的相鄰2次監(jiān)測結(jié)果進行縱向比較，分析其相似度(重復(fù)度)及其變化規(guī)律，獲得其動物活動時間差異性和eDNA半衰期，給出當前監(jiān)測方案的時間有效度。空間有效度的后評估，即對系列采樣點每次的監(jiān)測結(jié)果進行橫向比較，分析在每次采樣時段樣點間eDNA輸移的半衰距離，給出當前監(jiān)測方案的空間有效度。注釋有效度的后評估，即將分類學(xué)注釋結(jié)果(或結(jié)果中某特定類群)與傳統(tǒng)分類學(xué)調(diào)查結(jié)果進行對比，評估注釋結(jié)果的有效度(正確注釋的比例、注釋結(jié)果對傳統(tǒng)分類學(xué)調(diào)查結(jié)果的覆蓋度等)。

監(jiān)測結(jié)果后評估并不困難，不需要另外投入物力去補充實驗，只需要根據(jù)已獲得結(jié)果對相關(guān)問題進行后驗的分析評估即可。當前的研究絕大多數(shù)沒有開展監(jiān)測結(jié)果后評估，只是因為沒有注意到其必要性。希望這個內(nèi)容在之后的eDNA監(jiān)測分析評估工作中能夠得到踐行。

4 eDNA監(jiān)測技術(shù)應(yīng)用圖景

4.1 未來的eDNA監(jiān)測應(yīng)用場景

隨著生態(tài)文明建設(shè)的推進，更為系統(tǒng)化精細化的生物監(jiān)測評估將是未來生態(tài)環(huán)境適應(yīng)性管理的基礎(chǔ)需求，eDNA監(jiān)測在未來可憑借其檢出率高、所需樣品重復(fù)數(shù)少、所需付出的人力物力時間成本低[121-122]的優(yōu)勢成為傳統(tǒng)監(jiān)測方案的便捷高效的補充方案。比如在加拿大魁北克地區(qū)對3種兩棲類開展的監(jiān)測中，用傳統(tǒng)主動搜索方法觀察到目標物種的溪流中都監(jiān)測到了相應(yīng)的eDNA信號，主動搜索沒有觀察到目標物種的9條溪流中也監(jiān)測到了相關(guān)eDNA信號[121]。在美國新澤西州12個葡萄園的48個地塊內(nèi)開展的入侵生物監(jiān)測中，eDNA監(jiān)測的檢出率比傳統(tǒng)目視查找的檢出率高一倍多，要達到95%的檢出度，僅需要開展5個次葡萄園和12個次地塊eDNA監(jiān)測，但對應(yīng)的需要開展14個次葡萄園和29個次地塊獨立目視監(jiān)測[122]。因此，eDNA監(jiān)測完全可以作為一個補充方案或者延伸方案來應(yīng)用，以發(fā)現(xiàn)那些難以被記錄到或者容易被忽略的生物信息。

隨著開放科學(xué)的推進，更為標準化系列化的生物監(jiān)測結(jié)果將是未來生態(tài)環(huán)境基礎(chǔ)數(shù)據(jù)透明開放共享的基礎(chǔ)需求，對長期定期監(jiān)測區(qū)域或?qū)ο蟮募夹g(shù)標準化eDNA監(jiān)測作為常規(guī)生物監(jiān)測工具之一，其所獲得的標準化系列化監(jiān)測記錄和數(shù)據(jù)可以為研究者、產(chǎn)業(yè)界和政府部門的研究和決策提供通用的科學(xué)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)(表3)。研究者、產(chǎn)業(yè)界和政府部門可以把eDNA監(jiān)測納入其生物監(jiān)測工具包中，按標準化設(shè)計的樣點和頻度進行長期性周期性監(jiān)測，生成標準化技術(shù)文本和結(jié)果文件，形成相關(guān)數(shù)據(jù)的標準化系列化積累，并通過推進數(shù)據(jù)的通用、集成、開放獲取為后續(xù)的大尺度、長序列研究及相關(guān)決策提供具有重要意義的數(shù)據(jù)包[123-124]。比如水生動物共生微生物影響著宿主的健康[124-126]，同時又受環(huán)境微生物的顯著影響[29,127-130]，因而對環(huán)境微生物進行eDNA監(jiān)測，不僅可用以評估水體微生態(tài)健康狀況，也可用以預(yù)警水生動物健康狀況[29,124]，進而為水生態(tài)系統(tǒng)管理提供支持，為水生野生動物保護提供支撐。長序列的eDNA監(jiān)測結(jié)果文件，也可以為全球變化的生態(tài)系統(tǒng)響應(yīng)、生態(tài)環(huán)境保護的生態(tài)恢復(fù)效果等的深入研究提供數(shù)據(jù)源支撐，并為后續(xù)的管理決策和應(yīng)對政策提供科學(xué)支持。

表3 未來的eDNA監(jiān)測應(yīng)用場景概述*Tab.3 Summary of the scopes of the eDNA monitoring in future

4.2 未來的eDNA監(jiān)測技術(shù)狀況

未來5～10年或?qū)⑹莈DNA監(jiān)測技術(shù)標準化急速發(fā)展的時期，到2030年前后，預(yù)期將基本完成采樣方案、樣品處理方法、分子實驗方案、監(jiān)測結(jié)果后評估方法的標準化。屆時，熱點區(qū)域特定研究對象eDNA監(jiān)測的樣品重復(fù)數(shù)檢出度、eDNA的降解時間周期、eDNA空間輸移的有效距離、eDNA賦存形態(tài)和效率等eDNA生態(tài)學(xué)過程的關(guān)鍵參數(shù)將完成相應(yīng)積累，eDNA監(jiān)測方案中的樣品重復(fù)數(shù)設(shè)置、時間設(shè)置、空間設(shè)置、樣品介質(zhì)選擇或組合將形成一套比較確定的參數(shù)，指導(dǎo)和支撐相關(guān)長期定期監(jiān)測，進而為相關(guān)研究提供開放、穩(wěn)定的系列化數(shù)據(jù)源。非熱點區(qū)域的eDNA監(jiān)測方案中的樣品重復(fù)數(shù)設(shè)置、時間設(shè)置、空間設(shè)置、樣品介質(zhì)選擇或組合也可以通過本框架所示的采樣方案制定方法而進行確定。

樣品處理(樣品前處理、樣品保存方法)也將通過對各種方法和處理效果的對比，選定可以滿足要求的一整套優(yōu)化處理方法。當前國外[54-55]和國內(nèi)(2)http://www.chinacses.org/xw/gsgg/202205/t20220516_982140.shtml.已經(jīng)有相關(guān)的標準制定，雖然離完全達成共識成為通用執(zhí)行標準還有一段距離，但可以預(yù)見，在有組織地推動下，有望在領(lǐng)域內(nèi)達成共識并形成統(tǒng)一規(guī)范。分子實驗將更多地實現(xiàn)引物選擇趨同，室內(nèi)實驗由商業(yè)生物科技公司來完成，數(shù)據(jù)分析依托商業(yè)生物科技公司所提供的分析軟件分析平臺來完成。當前eDNA監(jiān)測的引物選擇已形成部分共識；室內(nèi)實驗大多由商業(yè)生物科技公司來完成，而商業(yè)生物科技公司所采用的程序基本一致，只是個別細節(jié)參數(shù)可能需要進一步統(tǒng)一；基礎(chǔ)生物信息分析軟件的開源獲取和廣泛使用已實現(xiàn)了數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)構(gòu)架的初步標準化，只是在結(jié)果的展示上需要達成統(tǒng)一，即在結(jié)果的展示中哪些結(jié)果必須提供。

監(jiān)測結(jié)果后評估(包括對樣品重復(fù)數(shù)、樣點空間布設(shè)、采樣時間設(shè)定、注釋有效度等的評估)也將隨著研究者們逐漸意識到其必要性和重要性，而獲得方法標準化上的共識，并隨著相關(guān)通用計算方法、計算代碼、計算程序的發(fā)布而得以實現(xiàn)。已有組織提出對研究團隊eDNA監(jiān)測能力進行評估，以適應(yīng)未來常態(tài)化監(jiān)測[131]，當前的標準化整體框架或可為研究團隊eDNA監(jiān)測能力建設(shè)提供指引。

更進一步來講，隨著社會需求擴張和科學(xué)技術(shù)發(fā)展之間的循環(huán)聯(lián)動，eDNA監(jiān)測必然向更快速、便捷、全面、準確、智能、便宜、透明、可得等方向發(fā)展，由于eDNA的生態(tài)學(xué)特性，樣品重復(fù)數(shù)、樣點空間布設(shè)、采樣時間設(shè)定等所依賴的科學(xué)基礎(chǔ)不會發(fā)生明顯改變，所以eDNA監(jiān)測未來進一步發(fā)展的壓力基本在技術(shù)進步和管理進步上。技術(shù)進步，主要是針對固定監(jiān)測站點的在線自動化實時監(jiān)測實時分析實時上報、針對非固定站點的流動便攜監(jiān)測設(shè)備的一體化采樣分析和數(shù)據(jù)結(jié)果上傳以及監(jiān)測結(jié)果的提質(zhì)和監(jiān)測成本的壓縮。管理進步，主要是多部門多數(shù)據(jù)源(比如水文數(shù)據(jù)、水環(huán)境數(shù)據(jù)、氣象數(shù)據(jù)、人類活動數(shù)據(jù)、生物數(shù)據(jù)等)的實時集總實時關(guān)聯(lián)分析實時預(yù)警，以及周期性數(shù)據(jù)包的發(fā)布等。

4.3 eDNA監(jiān)測技術(shù)亟需解決的幾個參數(shù)和問題

就當前的eDNA監(jiān)測技術(shù)應(yīng)用來看，有幾個技術(shù)參數(shù)和問題亟需解決，因為這幾個技術(shù)參數(shù)和問題在理論上并不存在困難，只是需要一批相對細致的實驗研究來進行數(shù)據(jù)積累，所以比較容易解決。1)eDNA監(jiān)測需要設(shè)置的樣品重復(fù)數(shù)，即需要盡快積累各個監(jiān)測區(qū)域/監(jiān)測點不同環(huán)境條件下的樣品重復(fù)數(shù)-檢出度曲線，給出合適的檢出度目標下所需的樣品重復(fù)數(shù)。2)eDNA監(jiān)測兩次采樣間的時間間隔，即盡快積累各個監(jiān)測區(qū)域各個季節(jié)各個目標生物類群的eDNA半衰時間，給出合適的監(jiān)測辨別度目標下最小的時間間隔。3)eDNA監(jiān)測樣點的間距設(shè)置，即需要對于靜水水體和陸地(以及其它無明確eDNA輸移的對象)，盡快積累各監(jiān)測區(qū)域監(jiān)測點不同環(huán)境條件下的樣點-物種差異度曲線，對于流水水體(以及其它存在明確eDNA輸移的對象，比如氣溶膠和碎屑浮塵)，盡快積累各監(jiān)測河段監(jiān)測點不同環(huán)境條件下的eDNA隨徑流(氣流)輸移的半衰距離，給出合適的監(jiān)測精度目標下所需的樣點間距。4)eDNA監(jiān)測的擴增引物和參考數(shù)據(jù)庫，即盡快完善各個類群的公共參考數(shù)據(jù)庫建設(shè)，在公共參考數(shù)據(jù)庫短時間內(nèi)無法完成的情況下，盡快建立各自的本地參考數(shù)據(jù)庫，并針對各特定目標類群和參考數(shù)據(jù)庫確定合適的OTU聚類序列相似度值和序列比對注釋分類置信度。5)eDNA監(jiān)測結(jié)果的定量模型，因為有各種因素引起結(jié)果系統(tǒng)性偏移，所以在完全弄清楚各個影響因素和影響過程之前，針對生物類群的eDNA監(jiān)測，盡快積累各個類群實際群落結(jié)構(gòu)和eDNA監(jiān)測結(jié)果的擬合關(guān)系，建立通過eDNA監(jiān)測結(jié)果獲得實際群落結(jié)構(gòu)信息的映射模型；針對具體目標物種的eDNA監(jiān)測，盡快積累種群資源數(shù)量/重量和eDNA監(jiān)測檢出概率的量化關(guān)系，建立通過eDNA監(jiān)測檢出概率反推種群資源數(shù)量/重量信息的映射模型。

4.4 eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化系統(tǒng)性整體框架的說明

考慮到無法對多種多樣的eDNA監(jiān)測相關(guān)工作給出一個確切的標準化方案，也無意對每種eDNA監(jiān)測工作分別給出一個確切的標準化方案，所以本文未對具體的標準化參數(shù)進行綜述和論證，只集中于eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化系統(tǒng)性整體框架的構(gòu)建和說明。本文所提出的eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化系統(tǒng)性整體框架(圖1，表4)

表4 eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化系統(tǒng)性整體框架的適用概述*Tab.4 Summary of the eDNA monitoring standardizing framework suitability in different sample types

5 總結(jié)與展望

目前，eDNA監(jiān)測技術(shù)標準化10個環(huán)節(jié)中的部分技術(shù)標準化問題已在一定程度上得到解決，剩下的問題在具體的目標指引下，也有望在短期內(nèi)獲得一定程度的解決。在當前技術(shù)快速進步知識快速積累的時代，只要是通過技術(shù)進步和知識積累能夠解決的問題，就一定能夠解決，技術(shù)路徑就一定能夠走通。期待未來5～10年內(nèi)，eDNA監(jiān)測在一些熱點區(qū)域(比如長江)成為一個長期性周期性的常規(guī)監(jiān)測內(nèi)容，并建立嚴謹、透明、開放、可用的高質(zhì)量eDNA監(jiān)測系列數(shù)據(jù)集，推動生物多樣性(及隱藏生物多樣性(hidden biodiversity))研究的開放參與[132]，為第四范式的(生態(tài)學(xué))科學(xué)研究提供數(shù)據(jù)驅(qū)動支撐[133]，為生態(tài)系統(tǒng)功能及健康管理的系統(tǒng)設(shè)計和快速反應(yīng)提供深度理解和及時預(yù)警。