頂空-氣相色譜法與氫氣微電極法用于富氫水中氫氣含量的檢測(cè)

劉伯言，賈修濱，薛俊莉，秦樹存

（山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，泰山氫生物醫(yī)學(xué)研究院，山東泰安 271000）

氫氣在常溫常壓下為無(wú)色無(wú)味氣體，其分子量小，在體內(nèi)可無(wú)障礙地透過各種屏障進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[1-2]。2007年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)吸入低濃度的氫氣在體內(nèi)可中和毒性自由基，減少缺血再灌注損傷[3]。之后，氫氣的生物醫(yī)學(xué)效應(yīng)得到了廣泛關(guān)注。從基礎(chǔ)研究到臨床治療，氫氣在呼吸系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、衰老相關(guān)疾病等多個(gè)領(lǐng)域嶄露頭角[4-8]。氫氣用于人體的安全性體現(xiàn)在多個(gè)方面：首先，氫氣是人體腸道菌群的正常代謝產(chǎn)物[9-10]。同時(shí)，在潛水醫(yī)學(xué)領(lǐng)域氫氣早已應(yīng)用于人體，沒有發(fā)現(xiàn)任何的毒性反應(yīng)及不良后果[11]。在氫氣醫(yī)學(xué)迅速發(fā)展的近十幾年中，大量的臨床試驗(yàn)也未發(fā)現(xiàn)氫氣的毒副作用[12-14]。更多高質(zhì)量的氫氣安全性和有效性數(shù)據(jù)有待科學(xué)家們進(jìn)一步收集分析。在我國(guó)，氫氣已被認(rèn)可作為食品添加劑，出現(xiàn)在正式頒布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中[15]，在日本[16]、歐盟[17]、美國(guó)[18]，氫氣也被列為安全的食品添加劑。作用于人體的氫氣供體多種多樣，主要包括吸入不同濃度氫氣、飲用富氫水、氫水沐浴等[12,19-20]，其中飲用富氫水是較為常見的一種方式[21]。

富氫水即含有氫氣的水，其制備及儲(chǔ)存方式有多種，氫氣含量為評(píng)價(jià)富氫水的最關(guān)鍵指標(biāo)之一[22-23]。在常溫常壓下飽和氫氣水溶液中氫氣含量約為1.61 mg/L，通過微氣泡等技術(shù)，可以使水中不僅有溶解狀態(tài)的氫氣，也有微氣泡狀態(tài)的氫氣，從而提高了富氫水中的氫氣含量[24]。目前水中氫氣含量的檢測(cè)方法有氣相色譜法、氫氣微電極法、亞甲藍(lán)氧化還原滴定法等[25-27]。文獻(xiàn)中已有相關(guān)檢測(cè)方法的報(bào)道，但檢測(cè)對(duì)象均為實(shí)驗(yàn)室中充入氫氣的水，對(duì)市面上的富氫水產(chǎn)品或超飽和富氫水中氫氣含量檢測(cè)尚無(wú)報(bào)道。這些方法是否適合目前富氫水產(chǎn)品中氫氣含量的檢測(cè)尚無(wú)系統(tǒng)研究。氣相色譜法檢測(cè)從富氫水中釋放出來的氫氣，對(duì)于含微氣泡的超飽和富氫水，可以通過加熱等方式促進(jìn)氫氣的釋放。氫電極法適用于檢測(cè)溶解于水中的氫氣，其測(cè)量范圍為飽和濃度以下，目前市面上很多富氫水為超飽和的微氣泡富氫水，本文通過稀釋的方式使氫氣濃度至飽和以下并完全溶解。亞甲藍(lán)氧化還原滴定法通過納米鉑催化氫氣還原亞甲藍(lán)，根據(jù)亞甲基藍(lán)的用量得到水溶液中氫氣的含量[28]。此法方便快捷，但較為粗略，無(wú)法準(zhǔn)確定量。

在我國(guó)，富氫水產(chǎn)品尚未制訂國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，目前僅有團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/NAHIEM 16-2019《含氫包裝飲用水》[29]，其中提到“產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)，氫氣含量不低于0.6 mg/L”，在氫氣含量檢驗(yàn)中提到“氫氣的含量使用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定（對(duì)氫濃度的檢測(cè)也可采用與氣相色譜法精度相當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法）”，但具體檢測(cè)流程尚未制定。為規(guī)范相關(guān)市場(chǎng)，推進(jìn)行業(yè)發(fā)展，建立標(biāo)準(zhǔn)的富氫水中氫氣含量檢測(cè)方法刻不容緩?？梢远繖z測(cè)富氫水中氫氣含量的方法主要為頂空-氣相色譜法和氫氣微電極法。本文對(duì)兩種檢測(cè)方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，建立了可用于實(shí)際富氫水產(chǎn)品中氫氣含量的檢測(cè)方法，并檢測(cè)了市面罐裝富氫水中氫氣含量，可以為相關(guān)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20 mL頂空瓶 美國(guó)Agilent公司；超純水 密理博Milli-Q超純水機(jī)；7種市售罐裝富氫水 （產(chǎn)品1，生產(chǎn)日期：2022-02-25，1.5 mg/L＜標(biāo)注濃度＜2 mg/L；產(chǎn)品2，生產(chǎn)日期：2022-02-26，2.5 mg/L＜標(biāo)注濃度≤3 mg/L；產(chǎn)品3，生產(chǎn)日期：2022-01-25，1.5 mg/L＜標(biāo)注濃度＜2 mg/L；產(chǎn)品4，生產(chǎn)日期：2021-11-24，2.5 mg/L＜標(biāo)注濃度≤3 mg/L；產(chǎn)品5，生產(chǎn)日期：2021-11-23，2 mg/L≤標(biāo)注濃度≤2.5 mg/L；產(chǎn)品6，生產(chǎn)日期：2022-01-19，2 mg/L≤標(biāo)注濃度≤2.5 mg/L；產(chǎn)品7，生產(chǎn)日期：2022-01-19，1.5 mg/L＜標(biāo)注濃度＜2 mg/L）。

8890氣相色譜儀配熱導(dǎo)檢測(cè)器、7697A頂空進(jìn)樣器、GS-CarbonPLOT毛細(xì)管柱（30 m×3 μm，0.32 mm） 美國(guó)Agilent公司；微電極系統(tǒng)（配有H2-50氫氣微電極） 丹麥Unisense公司；SPE-300純水氫氣發(fā)生器 濟(jì)南浩偉實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氫氣標(biāo)準(zhǔn)水溶液的制備 在20 ℃，標(biāo)準(zhǔn)大氣壓（101 kPa）下將氫氣發(fā)生器制備的高純度氫氣（＞99.99%）經(jīng)分散器充入超純水中直到飽和。查閱文獻(xiàn)可知此時(shí)水中氫氣濃度約為805 μmol/L[30]，即1.61 mg/L。將此溶液用超純水稀釋，配制成濃度為0、0.161、0.322、0.805、0.966、1.449、1.610 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 頂空-氣相色譜檢測(cè) 色譜柱：GS-Carbon-PLOT毛細(xì)管柱（30 m×3 μm，0.32 mm）；載氣（N2）流速3.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度200℃，分流比20:1；柱溫35 ℃，檢測(cè)器溫度: 200 ℃。頂空條件：樣品平衡時(shí)間20 min；頂空瓶溫度70 ℃；定量環(huán)溫度80 ℃；傳輸線溫度80 ℃；進(jìn)樣時(shí)間0.5 min。取5 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液置于20 mL頂空瓶中，立即封閉后檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)富氫水用超純水稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)（氫氣濃度＜1.61 mg/L），取5 mL稀釋后樣本置于20 mL頂空瓶中檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算稀釋后樣本中氫氣含量，并乘以稀釋倍數(shù)得到原始樣本中氫氣含量。

1.2.3 氫氣微電極檢測(cè) 氫氣微電極極化電壓為100 mV，將氫氣微電極插入超純水中，待電極信號(hào)穩(wěn)定后開始進(jìn)行檢測(cè)。極化時(shí)間約為2 h。取10 mL標(biāo)準(zhǔn)工作液于50 mL離心管中，立即將氫氣微電極插入液面以下待信號(hào)穩(wěn)定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)富氫水用超純水稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)（氫氣濃度＜1.61 mg/L），取10 mL稀釋后樣本檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算稀釋后樣本中氫氣含量，并乘以稀釋倍數(shù)得到原始樣本中氫氣含量。

1.2.4 罐裝富氫水產(chǎn)品中氫氣含量檢測(cè) 開蓋后立即取適量體積富氫水用超純水稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)（氫氣濃度＜1.61 mg/L），根據(jù)1.2.2和1.2.3中的方法分別檢測(cè)罐裝富氫水產(chǎn)品中氫氣含量。檢測(cè)日期均為2022年3月，各產(chǎn)品均在保質(zhì)期內(nèi)。對(duì)于產(chǎn)品1和產(chǎn)品2，采用氫氣微電極法檢測(cè)開蓋后8.3 h內(nèi)定時(shí)取樣，檢測(cè)氫氣含量隨時(shí)間變化情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2組之間檢測(cè)結(jié)果使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析顯著性差異。采用使用SPSS 20 及 Origin 8.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 頂空-氣相色譜法

2.1.1 頂空進(jìn)樣平衡溫度與時(shí)間的優(yōu)化 對(duì)于水中氫氣的檢測(cè)，分子篩毛細(xì)管柱會(huì)受到水蒸氣的影響，本研究采用GS-CarbonPLOT毛細(xì)管柱。圖1A為單純氫氣進(jìn)樣色譜圖，圖1B為富氫水樣本檢測(cè)色譜圖?？芍?dú)錃獬龇鍟r(shí)間為1.22 min。在該色譜條件下，色譜圖基線穩(wěn)定，氫氣峰能夠分離，并且無(wú)拖尾等現(xiàn)象。

圖1 氫氣（A）及富氫水樣本（B）頂空進(jìn)樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of headspace sampling of hydrogen (A)and hydrogen-rich water sample (B)

氣相色譜法檢測(cè)的前提是將水中的氫氣釋放出來，這就需要采用頂空的前處理方法。選取同一濃度（氫氣0.805 mg/L）樣品，考察了頂空進(jìn)樣的不同平衡溫度（40、50、60、70、80 ℃）和不同平衡時(shí)間（5、10、15、20、30 min）對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果表明：平衡時(shí)間為15 min時(shí)，隨著平衡溫度的升高，氫氣峰面積相應(yīng)遞增，當(dāng)溫度超過70 ℃，目標(biāo)物的峰面積增加緩慢，且溫度過高會(huì)影響頂空瓶氣密性，故實(shí)驗(yàn)選擇70 ℃作為平衡溫度（圖2A）；平衡溫度為70 ℃時(shí)，隨著平衡時(shí)間增加，5～20 min目標(biāo)物的峰面積逐級(jí)遞增并趨于平穩(wěn)，之后峰面積才基本不再增加（圖2B）。故實(shí)驗(yàn)選擇頂空進(jìn)樣的平衡溫度和平衡時(shí)間分別為70 ℃和20 min。

圖2 頂空平衡溫度（A）和平衡時(shí)間（B）對(duì)氫氣峰面積的影響Fig.2 Effects of equilibrium temperature (A) and time (B) on hydrogen peak area

2.1.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限 在優(yōu)化后的條件下，將0、0.161、0.322、0.805、0.966、1.449、1.610 mg/L梯度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液使用頂空-氣相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，氫氣濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到頂空-氣相色譜法回歸方程為Y=19.38X+0.9595，R2=0.9976。在0～1.610 mg/L范圍內(nèi)本方法具有良好的線性關(guān)系（圖3A）。以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限，得檢出限為0.0036 mg/L，定量限為0.012 mg/L。

圖3 頂空-氣相色譜法（A）和氫氣微電極法（B）檢測(cè)水中氫氣含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of hydrogen concentration detection in water by headspace gas chromatography (A) and hydrogen microsensor (B)

2.1.3 準(zhǔn)確度和精密度 配制氫氣濃度為0.1613、0.805、1.449 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度在優(yōu)化后條件下平行測(cè)定6次，通過回收率來考察方法的準(zhǔn)確度，通過相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）來考察方法的精密度，測(cè)定結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0.161、0.805、1.449 mg/L添加水平，回收率分別為104.90%、102.22%和97.78%，說明準(zhǔn)確度良好。RSD分別為3.87%、2.29%和1.69%，均小于5%，說明精密度良好（表1）。

表1 頂空-氣相色譜法的準(zhǔn)確度及精密度Table 1 Accuracy and precision of the detection by headspace gas chromatography

2.2 氫氣微電極法

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限 將0、0.161、0.322、0.805、0.966、1.449、1.610 mg/L梯度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液使用氫氣微電極法進(jìn)行檢測(cè)，以信號(hào)強(qiáng)度（Y）為縱坐標(biāo)，氫氣濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到氫氣微電極法回歸方程為Y=1297X-22.98，R2=0.9978。在0～1.610 mg/L范圍內(nèi)本方法均具有良好的線性關(guān)系（圖3B）。以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限，得檢出限為0.00023 mg/L，定量限為0.00077 mg/L。

2.2.2 準(zhǔn)確度和精密度 對(duì)氫氣濃度為0.1613、0.805 、1.449 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液使用氫氣微電極法進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定6次。如表2所示，在0.161、0.805、1.449 mg/L添加水平，回收率分別為96.75%、95.78%和98.00%，說明準(zhǔn)確度良好。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.84%、0.98%和2.80%，均小于5%，說明精密度良好（表2）。

表2 氫氣微電極法的準(zhǔn)確度及精密度Table 2 Accuracy and precision of the detection by hydrogen microsensor

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)市售7種罐裝富氫水（編號(hào)1～7），每種3個(gè)樣品（01～03），使用2種方法進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果見表3?？梢钥闯?，市面上罐裝富氫水氫氣含量均達(dá)到了團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/NAHIEM 16-2019《含氫包裝飲用水》中規(guī)定的0.6 mg/L，但不同品牌產(chǎn)品氫氣含量相差很大，從0.8至6.2 mg/L不等。富氫水中的氫氣在暴露于空氣之中后易于散發(fā)[31]，在產(chǎn)品開蓋后氫氣存留情況如何，也是一個(gè)值得關(guān)注的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以氫氣含量最高的產(chǎn)品（產(chǎn)品1和產(chǎn)品2）為代表，得到了在開蓋后富氫水氫氣含量隨時(shí)間變化情況。由圖4可知，在開始階段氫氣散失速度較快，之后逐漸減緩。對(duì)于初始濃度約為3 mg/L的富氫水產(chǎn)品，開蓋后5 h內(nèi)仍然在氫氣水溶液飽和濃度之上；對(duì)于初始濃度約為6 mg/L的富氫水產(chǎn)品，開蓋后8 h內(nèi)仍然可達(dá)到2.2 mg/L以上，遠(yuǎn)超過飽和氫氣濃度?？傮w來說，開蓋后超飽和富氫水中氫氣存留量在30 min內(nèi)降低約10%，6 h內(nèi)約降低一半。

圖4 罐裝富氫水產(chǎn)品開蓋后水中氫氣含量隨時(shí)間變化情況Fig.4 Hydrogen concentration of different hydrogen-rich water products after opening cover over time

表3 樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Measurement result of the sample

3 討論與結(jié)論

隨著氫氣的生物醫(yī)學(xué)效應(yīng)和機(jī)制研究的深入，氫氣相關(guān)健康產(chǎn)品也越來越多，富氫水是其中重要的產(chǎn)品之一，氫氣含量是富氫水的關(guān)鍵指標(biāo)。本文建立了富氫水中氫氣含量的檢測(cè)方法，并對(duì)市面上的罐裝富氫水進(jìn)行了檢測(cè)。在樣本的前處理方面，對(duì)于超飽和的富氫水，需通過稀釋的方式使氫氣含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，即氫氣的飽和濃度1.61 mg/L以下。此外，氣相色譜法需通過頂空進(jìn)樣的方式，使溶解于水中的氫氣釋放出來，因此增加了前處理的步驟。在檢測(cè)成本方面，氫氣微電極法設(shè)備和耗材的成本低于氣相色譜法。方法學(xué)考察結(jié)果表明，頂空-氣相色譜法與氫氣微電極法在0～1.61 mg/L氫氣含量范圍內(nèi)均有良好線性關(guān)系，在低、中、高三個(gè)添加水平下，回收率分別為97.78%～104.90%、95.78%～98.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.69%～3.87%、0.98%～2.80%，均能夠滿足檢測(cè)要求。目前市面上罐裝富氫水產(chǎn)品標(biāo)注的氫氣含量從1.6 ppm（約1.6 mg/L）到3 ppm（約3 mg/L）不等。通過對(duì)市面上7種罐裝富氫水進(jìn)行檢測(cè)表明這些產(chǎn)品均達(dá)到團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.6 mg/L，但氫氣含量相差較大，不同產(chǎn)品甚至能相差近8倍。本文通過頂空-氣相色譜法和氫氣微電極法對(duì)富氫水中氫氣含量進(jìn)行檢測(cè)，可以為相關(guān)應(yīng)用及標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。