黑莓、樹莓不同發(fā)育時期葉片鞣花酸與抗氧化、糖類物質(zhì)的相關性分析

王佳鸞，趙俸藝，吳文龍，張春紅, ，李維林,2

（1.江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇南京 210014；2.南京林業(yè)大學，江蘇南京 210037）

植物界蘊含著豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，為營養(yǎng)物質(zhì)的天然儲藏庫。植物中抗氧化途徑主要分為酶途徑與非酶途徑兩種。非酶途徑主要為抗氧化物質(zhì)、維生素等，而攝入人體抗氧化活性較高的為非酶途徑的抗氧化物質(zhì)。黑莓（Blackberry）與樹莓（Raspberry）同為薔薇科懸鉤子屬（RubusL.）多年生果樹，果實為聚果型小漿果。黑莓原產(chǎn)于北美[1]，最先由江蘇省中國科學院植物研究所在1986年引入國內(nèi)[2]。樹莓含有多種營養(yǎng)成分與微量元素，含有多種有益于人體健康的活性物質(zhì)[3]。黑莓具有優(yōu)秀的抗氧化活性而被稱為抗氧化之王，酚酸類物質(zhì)為植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，鞣花酸為酚酸類物質(zhì)之一，為果實中重要的抗氧化活性物質(zhì)之一。

鞣花酸為沒食子酸二聚體[4]，是一種天然的多酚二內(nèi)酯[5]，其廣泛存在于多種植物體內(nèi)[6-9]。鞣花酸具有多種生物活性如：抗氧化活性[10-11]、抗癌活性[12-15]、緩解糖尿病[16-17]、抗炎活性[18-20]以及保健功效[21-23]等，對保持人體健康具有一定的輔助作用。由于鞣花酸同時具有親水與親脂結(jié)構(gòu)這種特殊的理化性質(zhì)，導致鞣花酸在多種溶劑中溶解度較差[24]，導致鞣花酸在工業(yè)生產(chǎn)以及日常生活中使用較少?？偡訛榉宇愇镔|(zhì)的總稱，除抗氧化活性外還具有抗癌[25]、抗炎[26]、抑菌[27]等活性。類黃酮物質(zhì)在植物體內(nèi)為重要的次生代謝產(chǎn)物，黃酮為膳食中含量最為豐富的酚酸類物質(zhì)[28]，對植物的生長發(fā)育與抵御逆境脅迫均發(fā)揮重要作用。維生素C為水溶性維生素，其具有很強的還原性[29]，同時也具有一定的抗癌活性[30]。氧化是衰老和部分疾病產(chǎn)生的重要影響因素之一[31-33]，這使得機體抗氧化尤為重要，而抗氧化物質(zhì)的攝入對此大有裨益。糖類物質(zhì)為主要的生理指標，鞣花酸合成途徑為莽草酸途徑，鞣花酸可以與糖類物質(zhì)結(jié)合成糖苷，糖類物質(zhì)的含量對游離鞣花酸含量具有一定影響。

目前對黑莓、樹莓的研究主要集中在果實，包括果實品質(zhì)、果實貯藏等[34-35]，而目前對葉片中鞣花酸含量的研究報道較少。鞣花酸廣泛存在于多種植物體內(nèi)，且在植物的不同部位均有所分布，但其在植物體內(nèi)的不同部位含量與分布均有所不同。目前有文獻報道鞣花酸含量種子＜果汁＜果皮＜葉片[36]。葉片作為種植業(yè)中的副產(chǎn)品，較果實更為便宜、量大且更易獲得，具有一定的潛在經(jīng)濟利用價值。本文對不同品種黑莓、樹莓不同生長時期葉片中鞣花酸含量進行測定，并對不同發(fā)育時期抗氧化物質(zhì)以及糖類物質(zhì)含量進行測定，旨在初步揭示葉片中鞣花酸含量與抗氧化特性的變化趨勢及關系，對懸鉤子屬小漿果葉片的潛在利用價值進行綜合分析，以期為后續(xù)葉片開發(fā)利用、鞣花酸的深入研究以及抗氧化產(chǎn)品的研發(fā)提供部分理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑莓、樹莓不同發(fā)育時期葉片 主要為江蘇省主要種植品種以及自主繁育的優(yōu)良品種，均采自江蘇省中國科學院植物研究所溧水科學基地，選取正常生長無病蟲害的完整葉片，擦干表面水分-30 ℃保存待用。葉片按其生長發(fā)育時期分為：嫩葉期（從頂端起1～3片）、伸展葉期（從頂端起3～8片，完全伸展生長的功能葉片）以及老葉期三個時期；鞣花酸標準品（含量＞96%） 葉源生物公司；NaOH 分析純，西隴科學；乙醇 分析純，華大公司；DPPH自由基清除能力試劑盒、總抗氧化能力測定試劑盒、維生素C測定試劑盒、類黃酮試劑盒、可溶性糖試劑盒、蔗糖測試盒、葡萄糖試劑盒、果糖試劑盒 南京建成生物有限公司。

Centrifuge 5804 R低溫高速離心機 德國Eppondorf；759-紫外分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Multiskan Sky酶標儀 德國Thermo Scientific；FA1004電子天平 舜宇公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州潤華電器有限公司；KQ-300DE超聲清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鞣花酸提取與含量測定 鞣花酸提取方法主要為溶劑提取法，一般采用超聲波輔助[37]、酸輔助水解[38]以提高提取率。參照文獻[39]方法，本實驗采用超聲輔助溶劑提取法。取冷凍保存葉片1 g，剪碎液氮研磨成粉末，準確秤取0.100 g葉片粉末，加入2 mL 40%乙醇作為提取溶劑，80 ℃超聲提取20 min，超聲提取后7000 r/min離心10 min，取其澄清上清液待測。

鞣花酸含有酯基和酚羥基，容易與堿發(fā)生反應[24]，采用紫外分光光度法能夠快速檢測鞣花酸含量。根據(jù)陳笳鴻等[40]的方法，在待測液中加入0.1 mol/L NaOH，其可與鞣花酸發(fā)生反應并且在357 nm處有最大吸收峰，該方法根據(jù)統(tǒng)計學分析可信度為95%，誤差較小，可用于鞣花酸的快速檢測。1.2.1中獲得的待測上清液與稀堿按1:4（v:v）混勻后室溫反應15 min，用蒸餾水調(diào)零，測定吸光度值，通過標準曲線y=0.0504x+0.003（R2=0.999）計算待測樣品中鞣花酸含量。

1.2.2 抗氧化物質(zhì)與糖類物質(zhì)含量測定 取冷凍保存的葉片，液氮研磨成粉。配制0.1 mol/L pH7.4的PBS作為緩沖液，按照料液比為1:9（g:mL）渦旋混勻，7000 r/min離心5 min取上清液。采用試劑盒比色法測定不用發(fā)育時期葉片中總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力，黃酮、維生素C、可溶性糖、果糖、葡萄糖、蔗糖等含量。

葉片總酚含量測定采用Floin-Ciocalteu法[41]，將研磨的葉片粉末按照料液比為1:20加入50%乙醇，35 ℃超聲提取20 min，離心7000 r/min離心5 min除雜，取1 mL上清液加入0.5 mL福林酚試劑、2 mL 7.5%碳酸鈉溶液和6.5 mL蒸餾水，渦旋混勻，靜置2 h后，750 nm處測定吸光度值，通過標準曲線y=0.128x+0.00045（R2=0.999）計算樣品中總酚含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹莓、黑莓葉片中鞣花酸含量

對溧水實驗基地中黑莓、樹莓、黑莓樹莓雜交種，共21個品種葉片的三個生長時期中鞣花酸含量進行測定后發(fā)現(xiàn)，鞣花酸含量隨葉片的生長發(fā)育呈下降趨勢，其中嫩葉中鞣花酸含量最高?！畬毶煌L時期的葉片中鞣花酸含量均較高，‘寶森’嫩葉中鞣花酸含量最高為39.622 mg/g FW。紅樹莓‘哈瑞泰茲’伸展葉中鞣花酸含量高于嫩葉中含量為28.066 mg/g FW。‘赫爾’、‘納瓦荷’與紅樹莓品種中嫩葉與伸展葉中鞣花酸含量相近，而‘赫爾’與‘納瓦荷’老葉中鞣花酸含量有所降低，‘哈瑞泰茲’老葉中的鞣花酸含量最低約為7.649 mg/g FW，其下降趨勢較為明顯，詳細結(jié)果見表1。

表1 不同品種黑莓、樹莓葉片不同生長時期鞣花酸含量Table 1 Ellagic acid content in leaves of different varieties of blackberry and raspberry at different growth stages

2.2 抗氧化物質(zhì)含量分析

本文從21個品種中選取鞣花酸含量較高、較低以及不同發(fā)育期內(nèi)鞣花酸含量變化較大的品種進行后續(xù)實驗分析。選取‘寶森’、‘卡依娃’、‘寧植2號’、紅樹莓‘哈瑞泰茲’、‘納瓦荷’等品種對其進行抗氧化指標分析，對葉片的總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力，總酚、類黃酮、維生素C等含量變化進行測定，旨在進一步評價懸鉤子屬小漿果葉片的潛在利用價值。測定葉片中除紅樹莓‘哈瑞泰茲’外，DPPH自由基清除能力變化規(guī)律與總抗氧化能力相似均隨葉片的生長發(fā)育呈現(xiàn)下降的趨勢，均以嫩葉中含量高，結(jié)果詳見圖1。其中‘寶森’、‘卡依娃’、‘寧植2號’葉片中抗氧化能力與DPPH自由基清除能力均為嫩葉最高老葉中最低而‘納瓦荷’品種中為伸展葉中最低。紅樹莓‘哈瑞泰茲’為伸展葉中總抗氧化能力與DPPH自由基清除能力均較嫩葉中高，分別約為331.738 U/mg prot FW和1121.784 mg Trolox/g FW?！{瓦荷’的伸展葉中抗氧化能力與DPPH自由基清除能力均較其他發(fā)育時期低，分別為92.600 U/mg prot FW和420.691 mg Trolox/g FW。

圖1 黑莓葉片抗氧化能力測定Fig.1 Determination of antioxidant capacity of blackberry leaves

黑莓、樹莓葉片中抗氧化物質(zhì)含量測定如圖2所示，葉片中總酚含量均表現(xiàn)為隨葉片發(fā)育生長呈下降趨勢，嫩葉中最高，老葉中含量最低?！畬毶廴~中總酚含量最高為161.306 mg/g FW，‘哈瑞泰茲’老葉中總酚含量最低為78.361 mg/g FW。類黃酮為酚酸類物質(zhì)為重要的次生代謝產(chǎn)物，為膳食攝取的主要酚酸類物質(zhì)之一，其含量變化與總抗氧化能力變化趨勢相似?！畬毶ⅰㄒ劳蕖?、‘寧植2號’黃酮含量隨葉片生長而逐漸降低，其中‘卡依娃’嫩葉中類黃酮含量最高為22.557 mg/g FW。紅樹莓‘哈瑞泰茲’伸展葉中類黃酮含量相較其余兩個發(fā)育時期高，為11.391 mg/g FW?！{瓦荷’伸展葉與老葉中類黃酮含量接近，分別為9.023和9.648 mg/g FW。維生素C為水溶性抗氧化物質(zhì)，‘寶森’品種葉片中維生素C含量總體較高，其嫩葉中最高為193.533 mg/g FW。綜合測定結(jié)果表明‘寶森’、‘卡依娃’品種嫩葉以及‘哈瑞泰茲’伸展葉的抗氧化能力與抗氧化物質(zhì)含量較高，抗氧化能力較強。

圖2 黑莓葉片抗氧化物質(zhì)含量測定Fig.2 Content determination of antioxidant substances in blackberry leaves

2.3 糖類物質(zhì)含量分析

糖類物質(zhì)為重要的能源物質(zhì)，參與眾多代謝活動，為測定的重要生理指標之一。黑莓、樹莓葉片中鞣花酸含量隨葉片的生長發(fā)育整體為下降趨勢。據(jù)報道，鞣花酸合成通路為莽草酸途徑，鞣花酸合成始于4-磷酸赤蘚糖和磷酸烯醇式丙酮酸的縮合，而磷酸烯醇式丙酮酸可參與糖類物質(zhì)的合成代謝[42]，同時鞣花酸可以與糖結(jié)合形成糖苷，雖糖苷也具有豐富的生物活性[43]，但糖類物質(zhì)對游離鞣花酸含量具有一定影響。本文采用試劑盒法對黑莓不同發(fā)育時期葉片中可溶性糖、果糖、葡萄糖、蔗糖等含量進行測定。結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)葉片中糖類物質(zhì)含量隨葉片的生長發(fā)育呈現(xiàn)上升的趨勢，嫩葉中糖類物質(zhì)含量普遍較低，老葉和伸展葉中含量較高。測定發(fā)現(xiàn)葉片中可溶性糖含量整體呈上升趨勢，‘寶森’老葉中可溶性糖含量最高為19.395 mg/g FW，而‘卡依娃’嫩葉中含量最低為7.834 mg/g FW。黑莓葉片中蔗糖含量為嫩葉中最低，其中‘寧植2號’嫩葉中含量最低為0.813 mg/g FW，而其伸展葉中蔗糖含量最高為2.841 mg/g FW。果糖與葡萄糖含量除紅樹莓外總體為上升趨勢，‘哈瑞泰茲’中伸展葉中果糖與葡萄糖含量均較低分別為4.591和3.923 mg/g FW。‘哈瑞泰茲’老葉中果糖含量最高為5.957 mg/g FW，‘納瓦荷’老葉中葡萄糖較高為9.016 mg/g FW。

圖3 黑莓、樹莓葉片糖類物質(zhì)含量測定Fig.3 Determination of carbohydrate content in blackberry and raspberry leaves

2.4 葉片發(fā)育進程鞣花酸與其他抗氧化、糖類指標相關性分析

對本文黑莓、樹莓共五個品種葉片發(fā)育進程中鞣花酸含量與其他指標含量相關性進行相關性分析（表2），隨葉片的生長發(fā)育鞣花酸含量逐漸下降其嫩葉中含量最高，而在此生長發(fā)育過程中鞣花酸與其他測定的抗氧化物質(zhì)總體呈現(xiàn)正相關且變化趨勢相同，其中鞣花酸與總酚含量在極顯著水平上呈現(xiàn)正相關。由于維生素C在葉片中變化趨勢為先下降后上升，在‘卡依娃’、‘納瓦荷’、‘寧植2號’品種中與鞣花酸含量呈現(xiàn)負相關。糖類物質(zhì)在葉片中變化趨勢為上升趨勢，在嫩葉中含量最低，但在部分品種中伸展葉中糖類物質(zhì)含量較高，可能是由于伸展葉功能活性較強導致。鞣花酸與糖類物質(zhì)含量總體呈現(xiàn)負相關，且部分指標在顯著的水平上呈現(xiàn)負相關。

表2 黑莓、樹莓葉片發(fā)育進程中各品質(zhì)指標與鞣花酸含量的相關性分析Table 2 Correlation analysis between ellagic acid content and quality indexes during leaf development of blackberry and raspberry

2.5 不同物種葉片鞣花酸含量分析

鞣花酸為酚酸類物質(zhì)之一，為重要的次生代謝產(chǎn)物，引起具有多種優(yōu)秀的生物性而被廣泛研究。對其他不同物種葉片中鞣花酸含量進行統(tǒng)計如下表3，石榴葉片中鞣花酸含量較低，因生長環(huán)境以及品種的不同，鞣花酸含量也有所差異。常見園藝果實草莓中其干葉片中鞣花酸含量較高且最高可到32.300 mg/g。樹莓‘秋福’與石榴‘泰山紅’葉片中鞣花酸含量較低分別為0.519與0.622 mg/g。

表3 不同物種葉片中鞣花酸含量Table 3 Ellagic acid content in leaves of different species

3 討論與結(jié)論

隨著社會的發(fā)展與進步，人們愈來愈關注自身健康，食補也備受重視。黑莓、樹莓因其果實具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)而被廣泛關注，有研究表明經(jīng)常食用富含酚酸類物質(zhì)的食物對慢性疾病的發(fā)生具有積極的影響[47-48]，所以發(fā)現(xiàn)膳食生活中鞣花酸以及酚酸類物質(zhì)含量較高的食品，對保持人體健康具有深遠的意義。唐瑩等[49]將樹莓葉片炮制成葉片茶后，經(jīng)檢測其茶香滋味鮮醇且具有良好的抗氧化以及抑菌效果，而葉片為生產(chǎn)加工中的副產(chǎn)品，其較于果實更易獲得且價格低廉，可作為鞣花酸提取研究樣品，對黑莓、樹莓鞣花酸以及酚酸類物質(zhì)的研究具有一定的意義，同時嫩葉可以開發(fā)成葉片茶具有一定的潛在經(jīng)濟利用價值。

綜上所述，相較于前人研究，本文測定品種葉片中鞣花酸含量相對較高，在測定的21個品種中‘寶森’和‘卡依娃’品種葉片中鞣花酸含量較高且嫩葉中含量最高為39.622 mg/g FW，顯著高于表格中測定品種，但由于測定方法以及葉片發(fā)育時期的不同，鞣花酸含量也存在一定差異，但可以肯定的是黑莓嫩葉中鞣花酸含量豐富，具有一定的研究以及經(jīng)濟利用價值。在對總抗氧化活性，自由基清除能力、以及抗氧化物質(zhì)含量測定中‘寶森’和‘卡依娃’品種均含量較高，其中‘卡依娃’品種中黃酮含量最高為22.557 mg/g FW，‘哈瑞泰茲’葉片中鞣花酸含量為伸展葉最高，除黃酮含量外其余抗氧化指標均為伸展葉中較高。在糖類物質(zhì)的測定中，糖類物質(zhì)與鞣花酸等抗氧化物質(zhì)呈負相關，均為嫩葉中最低，這主要是因為糖類物質(zhì)的合成、鞣花酸和其他酚酸類物質(zhì)合成、黃酮類物質(zhì)的合成均與磷酸烯醇式丙酮酸相關，磷酸烯醇式丙酮酸在酶的作用下生成丙二酰CoA，為黃酮類物質(zhì)合成的起始物質(zhì)，磷酸烯醇式丙酮酸為鞣花酸合成起始物質(zhì)之一，同時也參與糖類物質(zhì)的代謝與合成。近年來，對懸鉤子果實中鞣花酸合成通路以及中間代謝產(chǎn)物均有研究[42]，但對葉片中鞣花酸累積規(guī)律鮮有報道，鞣花酸在植物體內(nèi)不同部位含量分布不同，葉片中鞣花酸含量較高且具有一定開發(fā)利用價值，本文旨在為后續(xù)黑莓、樹莓葉片的深入研究與開發(fā)利用提供部分理論基礎。