PurB過表達(dá)對(duì)大腸桿菌氨基糖苷類抗生素耐藥性的影響

林 婧，湯 琪，高媛媛

(細(xì)胞逆境響應(yīng)與代謝調(diào)控福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350108)

隨著抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的濫用情況加劇，越來越多的問題逐漸暴露，例如:打破畜禽體內(nèi)微生態(tài)平衡引起的二重感染、造成畜禽集體免疫減退、對(duì)畜禽生存環(huán)境造成潛在的危害等[1-3]。濫用造成的耐藥細(xì)菌(antibiotic-resistant bacteria)和耐藥基因(antibiotic resistance genes)快速出現(xiàn)，導(dǎo)致抗生素對(duì)畜禽的治療效率大幅度降低[4]。在金黃色葡萄球菌中已出現(xiàn)了耐青霉素、四環(huán)素、紅霉素、萬古霉素、甲氧西林的抗生素菌株[5]，在對(duì)畜禽共生大腸桿菌的抗生素耐藥性常規(guī)監(jiān)測(cè)中，也發(fā)現(xiàn)了對(duì)多粘菌素耐藥性的大腸桿菌[6]，細(xì)菌耐藥問題愈發(fā)棘手。為解決該問題，大部分研究人員把目光聚焦于新藥的研發(fā)，然而新藥研發(fā)周期長(zhǎng)[7]，僅僅依靠新藥研發(fā)并不能及時(shí)解決細(xì)菌耐藥問題，同時(shí)尋找新的藥理靶點(diǎn)才是問題解決的雙全的策略。在探索新耐藥靶點(diǎn)的過程中，研究者發(fā)現(xiàn)了一些理想的靶點(diǎn)[8]，通常聚焦于細(xì)菌一些獨(dú)特的能量代謝途徑中，其中涉及到的一些關(guān)鍵酶往往發(fā)揮著不可替代的作用[9-10]。而腺苷酸琥珀酸裂解酶PurB(Purine-element-binding protein B)作為大腸桿菌中高度保守的酶[11]，是嘌呤合成中不可或缺的一部分[12]，被預(yù)測(cè)可作為大腸桿菌的一個(gè)的新耐藥靶點(diǎn)。

近年來，已有研究發(fā)現(xiàn)腺苷酸琥珀酸裂解酶突變?cè)谀图籽跷髁纸瘘S色葡萄球菌(MRSA)中對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥具有重要作用[13]。同時(shí)，在腸炎沙門氏菌(S.Enteritidis)的研究中發(fā)現(xiàn)氟喹諾酮類藥物(FQs)的耐藥性也與purB基因有關(guān)[14-15]。然而目前尚未有研究發(fā)現(xiàn)腺苷酸琥珀酸裂解酶在大腸桿菌中對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥具有貢獻(xiàn)。因此，本試驗(yàn)擬探討腺苷酸琥珀酸裂解酶對(duì)大腸桿菌氨基糖苷類抗生素耐藥性的影響，以評(píng)估腺苷酸琥珀酸裂解酶在氨基糖苷類抗生素應(yīng)激環(huán)境中的作用，希望為解決大腸桿菌耐藥問題提供新的藥理靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用大腸桿菌BW25113菌株以及過表達(dá)載體pCA24N。

卡那霉素(50 mg·mL-1)、慶大霉素(25 mg·mL-1)用無菌超純水配制而成，氯霉素(35 mg·mL-1)用分析乙醇配制而成。以上抗生素儲(chǔ)液均用0.22 μm濾膜過濾除菌后備用。

LB液體培養(yǎng)基(每1 L包含氯化鈉10 g、酵母粉5 g、蛋白胨10 g)、0.01 mol·L-1PBS緩沖液(每1 L包含NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.42 g、KH2PO40.27 g)，以上溶液均經(jīng)過高溫高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基需在LB液體培養(yǎng)基中加入7.5 g瓊脂后高溫高壓滅菌，在培養(yǎng)基溫?zé)釙r(shí)倒入無菌培養(yǎng)皿中，待凝固后備用。

Western Blot試驗(yàn)試劑：0.45 μm PVDF Transfer Membranes、1.5 mol·L-1Tris-HCl (pH 8.8)、0.5 mol·L-1Tris-HCl (pH 6.8)、20% Ara溶液、10% SDS溶液、1×TBST緩沖液、6×loading buffer、4% SDS-PAGE濃縮膠、10% SDS-PAGE分離膠、1×轉(zhuǎn)膜緩沖液、1 mol·L-1IPTG溶液、1×SDS電泳緩沖液、Western Blot封閉液和(PR1100)BCIP/NBT顯色試劑?？贵w為ProteinFind Anti-His Mouse Monocional Antibody和Alkaline Phosp hatase-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG(H+L)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1PurB過表達(dá)菌株的構(gòu)建 在本實(shí)驗(yàn)室保藏的ASKA文庫(kù)中選取表達(dá)載體攜帶PurB基因的JM109菌株，劃線于氯霉素平板后，挑取單克隆于含氯霉素的液體LB中，過夜培養(yǎng)16 h，用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取質(zhì)粒。在野生型大腸桿菌BW25113感受態(tài)細(xì)胞中加入1 μL質(zhì)粒，混勻后冰上靜置30 min。用預(yù)熱完全的42℃金屬浴熱激90 s，冰上靜置2 min，加入1 mL液體LB，37℃搖床恢復(fù)1 h?；謴?fù)后的菌液全量涂布在氯霉素(35 μg·mL-1)抗性板上。過夜培養(yǎng)后挑取攜帶purB基因過表達(dá)載體的單克隆菌株。將PCR結(jié)果長(zhǎng)度正確的菌株送尚亞測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI上E.coli K-12菌株的purB基因進(jìn)行比對(duì)。挑取測(cè)序成功的單克隆過夜培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2免疫印跡法檢測(cè)PurB過表達(dá)情況 將BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N(purB)按1∶100的接菌比例轉(zhuǎn)接至含氯霉素抗性的液體LB中，在搖床中培養(yǎng)至OD600≈0.45時(shí)加入IPTG(1 mmol·L-1)，繼續(xù)放置在搖床中誘導(dǎo)至OD600≈0.8。誘導(dǎo)后取菌液1 mL，離心機(jī)轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1離心2 min，棄上清加入30 μL的10% SDS溶液和30 μL的6×loading buffer，混合均勻，置于100℃的金屬浴上煮沸15 min。用10%的SDS-PAGE凝膠電泳將樣品進(jìn)行分離，電泳液為1×SDS電泳緩沖液。凝膠電泳結(jié)束后，使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后封閉液封閉1 h。封閉結(jié)束后，加入一抗，置于水平搖床上反應(yīng)30 min后，置于4℃冰箱過夜靜置12 h。過夜后的膜置于垂直脫色搖床上，用1×TBST緩沖液洗滌3次，每次間隔8～10 min。洗滌后置于水平搖床上，加入二抗反應(yīng)1.5 h，再換置于搖床上，用1×TBST緩沖液洗滌3次，每次間隔8～10 min。最后進(jìn)行BCIP/NBT試劑顯色。

1.2.3PurB過表達(dá)菌株抗生素耐受性檢測(cè) 將BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N(purB)預(yù)先活化。將活化好的菌液1∶100轉(zhuǎn)接至含氯霉素液體LB中，置于搖床中培養(yǎng)至OD600≈0.45時(shí)加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，繼續(xù)放置于搖床中誘導(dǎo)至OD600≈0.8。取菌液100 μL于EP管中，12 000 r·min-1離心2 min，去上清，用等體積的0.01 mol·L-1PBS緩沖液重懸作為對(duì)照樣品備用。取1 mL誘導(dǎo)至OD600≈0.8的菌液于玻璃搖菌管中，分別加入卡那霉素(終濃度為10 μg·mL-1)、慶大霉素(終濃度為5 μg·mL-1)，繼續(xù)置于搖床中培養(yǎng)，1、2 h后取100 μL于EP管中，離心后去上清，用等體積的0.01 mol·L-1PBS緩沖液重懸作為試驗(yàn)樣品，將以上樣品用緩沖液梯度稀釋后點(diǎn)板，平板在37℃過夜培養(yǎng)12 h，觀察細(xì)菌存活情況，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率。取3次平行試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

1.2.4PurB過表達(dá)菌株最小抑菌濃度(MIC)測(cè)試 將活化好的BW25113-pCA24N、BW25113-pCA24N(purB)按1∶100轉(zhuǎn)接至含氯霉素液體LB中，置于搖床中培養(yǎng)至OD600≈0.45時(shí)加入濃度為1 mmol·L-1的IPTG，繼續(xù)放置于搖床中誘導(dǎo)至OD600≈0.8。將抗生素用2倍稀釋法稀釋成相應(yīng)濃度(0、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg·mL-1)，在無菌96孔板上按照濃度梯度順序每孔加入200 μL抗生素稀釋液，將誘導(dǎo)后的菌液稀釋5倍后，每個(gè)孔中加入2 μL稀釋后的菌液即每孔菌量約為105～106Cfu·mL-1，全部上樣完成后，37℃靜置培養(yǎng)24 h。取出96孔板，用槍頭輕輕吹打混勻菌液，在肉眼條件下對(duì)光觀察，清澄透光的孔對(duì)應(yīng)的最低抗生素濃度為該菌體外培養(yǎng)最低抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PurB過表達(dá)菌株的構(gòu)建

由圖1可知，所構(gòu)建的PurB過表達(dá)菌株基因長(zhǎng)度正確。由圖2可知，目的片段PurB基因測(cè)序結(jié)果與NCBI上大腸桿菌K-12菌株purB基因一致。由圖3可知，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示BW25113-pCA24N(purB)能夠表達(dá)目的蛋白腺苷酸琥珀酸裂解酶。綜上結(jié)果表明PurB過表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

注：大腸桿菌purB基因長(zhǎng)度為1371 bp圖1 BW25113-pCA24N(purB)菌株基因驗(yàn)證Fig.1 Gene validation of BW25113-pCA24N(purB) strain

注：黑色序列為K-12大腸桿菌purB基因，藍(lán)色序列、紅色序列為上下游引物測(cè)序結(jié)果圖2 BW25113-pCA24N(purB)菌株測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequencing results of BW25113-pCA24N (purB) strain

注：腺苷酸琥珀酸裂解酶大小約為50.27 kDa圖3 BW25113-pCA24N(purB)菌株Western Blot檢測(cè)Fig.3 Western Blot detection of BW25113-pCA24N (purB) strain

2.2 PurB過表達(dá)增強(qiáng)大腸桿菌氨基糖苷類抗生素的耐受性

2.2.1慶大霉素處理下BW25113-pCA24N(emp)、BW25113-pCA24N(purB)表型結(jié)果 由圖4可知，BW25113-pCA24N(emp)、BW25113-pCA24N(purB)經(jīng)濃度為5 μg·mL-1的慶大霉素處理0、1、2 h后細(xì)胞存活數(shù)的情況。結(jié)果顯示：在未處理情況下，PurB過表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)與空質(zhì)粒株生長(zhǎng)一致。在慶大霉素處理1 h后，PurB過表達(dá)株細(xì)胞存活數(shù)比空質(zhì)粒株多1個(gè)數(shù)量級(jí)。而處理2 h后，PurB過表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)比空質(zhì)粒株多近100倍。這些結(jié)果證明，過表達(dá)腺苷酸琥珀酸裂解酶可以提高大腸桿菌提高對(duì)慶大霉素的耐受性。

注：**表示P<0.01，差異較顯著。圖4 慶大霉素處理下emp、purB菌株存活率測(cè)定Fig.4 Determination of the survival rate of emp and purB strains treated with gentamicin

2.2.2卡那霉素處理下BW25113-pCA24N(emp)、BW25113-pCA24N(purB)表型結(jié)果 由圖5可知，BW25113-pCA24N(emp)、BW25113-pCA24N(purB)經(jīng)濃度為10 μg·mL-1的卡那霉素處理0、1、2 h后細(xì)胞存活數(shù)的情況。結(jié)果顯示：在未處理情況下，PurB過表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)與空質(zhì)粒株生長(zhǎng)一致。在卡那霉素處理1 h后，PurB過表達(dá)株細(xì)胞存活數(shù)與空質(zhì)粒株無顯著差異。而處理2 h后，PurB過表達(dá)株的細(xì)胞存活數(shù)比空質(zhì)粒株多近100倍。這些結(jié)果證明，過表達(dá)腺苷酸琥珀酸裂解酶可以提高大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐受性，提高菌群的生存率。

注：*表示P<0.05，差異顯著圖5 卡那霉素處理下emp、purB菌株存活率測(cè)定Fig.5 Determination of the survival rate of emp and purB strains treated with kanamycin

2.3 PurB過表達(dá)菌株MIC(最小抑菌濃度)的測(cè)定

由圖6可知，在卡那霉素處理?xiàng)l件下BW25113-pCA24N(emp)與BW25113-pCA24N(purB)的MIC都為2 μg·mL-1，在慶大霉素處理?xiàng)l件下BW25113-pCA24N(emp)與BW25113-pCA24N(purB)的MIC都為1 μg·mL-1。說明過表達(dá)PurB并未改變菌株耐藥性，只是增強(qiáng)了菌株的耐受性。

注：A為卡拉霉素處理，B為慶大霉素處理圖6 emp、purB最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定Fig.6 Determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of emp and purB strains

3 結(jié)論與討論

自1928年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素到現(xiàn)在[16]，抗生素已成為人類不可或缺的藥物。然而隨著抗生素的過度使用，細(xì)菌耐藥在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中出現(xiàn)且勢(shì)不可擋。細(xì)菌主要以3種方式來應(yīng)對(duì)抗生素應(yīng)激環(huán)境：耐受、耐藥、持留菌，而耐受的產(chǎn)生先于耐藥性[17]。因此為盡早遏制更多的細(xì)菌耐藥產(chǎn)生，有必要挖掘出更多的耐受基因，找到合適的新靶點(diǎn)。在耐受菌以及耐藥菌的分類上，主要以MIC來界定。耐受菌能在有效抗生素濃度下存活，但MIC不變，而耐藥菌MIC增加[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)PurB過表達(dá)后能增加大腸桿菌在氨基糖苷類抗生素處理下的存活率，并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PurB后，與對(duì)照相比，其最小抑菌濃度(MIC)并無增加。因此認(rèn)為過表達(dá)PurB能增加大腸桿菌對(duì)氨基糖苷類抗生素耐受性，而不是耐藥性。結(jié)合本試驗(yàn)研究結(jié)果，以及之前研究者們發(fā)現(xiàn)的PurB對(duì)金黃色葡萄球菌以及腸炎沙門氏菌耐藥性的貢獻(xiàn)，認(rèn)為PurB在耐藥細(xì)菌產(chǎn)生的進(jìn)程中發(fā)揮了巨大的作用。

目前，已有研究預(yù)測(cè)，purB基因編碼金黃色葡萄球菌的必須酶，并且研究人員進(jìn)一步驗(yàn)證該酶可作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[19]。鑒于該酶在大腸桿菌中對(duì)氨基糖苷類抗生素耐受性的貢獻(xiàn)，認(rèn)為這可為細(xì)菌耐藥機(jī)制研究和靶點(diǎn)問題提供新的思路。