長白山不同產(chǎn)地豬苓的HPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識別

劉一儒， 于雪冬， 齊慧敏， 梁運(yùn)江， 李太元， 許廣波

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

豬苓(PolyporusumbellatusPers.Fr.)是我國常見的中藥材之一[1]，它的藥用歷史可追溯到2000年以前，別名有豬茯苓、野豬糞、豬靈芝等[2-4]。長白山豬苓又名雞爪苓，是長白山特有的種質(zhì)資源。豬苓主要由長在地下土層中的菌核以及長在地面上的子實體組成。它的干燥菌核常用來入藥，在中醫(yī)臨床應(yīng)用上，因其具有滲水利濕的效果，所以常用于治療全身浮腫、尿急尿頻、急性肝炎、急性腎炎等疾病[5-6]。

多糖是豬苓的主要活性成分，具有較好的調(diào)節(jié)免疫作用、抗腫瘤、延緩衰老、增強(qiáng)免疫和保護(hù)肝臟等作用[7-9]。甾體類化合物是豬苓的主要化學(xué)成分，具有利水滲濕功效[10]，其中，麥角甾醇已被《中國藥典》收入作為豬苓指標(biāo)性成分[11]。

中藥指紋圖譜是一種可量化的質(zhì)量分析方法，它是用某些發(fā)現(xiàn)方法分析處理后的中藥材或中成藥得到共有峰圖譜，這些共有峰圖譜能夠宏觀、全面的展示各種中藥、中成藥及其制劑的各種化學(xué)成分及含量，進(jìn)而反映藥材的質(zhì)量[12-14]。對于中藥材來說，由于其復(fù)雜的化學(xué)組成成分，即使同種藥材在不同環(huán)境、地理位置、不同采摘時間及不同存儲方式下都會產(chǎn)生化學(xué)成分含量差異，它們的指紋圖譜也會存在較大的差異。因此，需要化學(xué)模式識別方法來處理分析數(shù)據(jù)，再提取其中的化學(xué)特征信息來解決它的復(fù)雜性[15]。

該研究以長白山區(qū)不同產(chǎn)地25個豬苓為試驗材料，測定它們主要藥效成分麥角甾醇和多糖含量；通過高效液相色譜法(HPLC)建立長白山區(qū)豬苓的指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)模式識別分析方法分析豬苓質(zhì)量差異，利用主成分進(jìn)一步探索不同產(chǎn)地豬苓綜合質(zhì)量，初步評價長白山區(qū)不同產(chǎn)地的豬苓質(zhì)量，為解決豬苓的質(zhì)量控制問題提供參考，以便合理開發(fā)利用長白山豬苓資源。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

島津LC-2010A高效液相色譜儀、麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，北京盛世康普化工技術(shù)研究院)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜級)。

1.2 豬苓菌核材料

該試驗采集了不同產(chǎn)地的25個豬苓(雞爪苓)菌核，這些豬苓菌核采自長白山區(qū)具有代表性的豬苓產(chǎn)地，豬苓產(chǎn)地的基本狀況見表1。

1.3 麥角甾醇對照品溶液的制備

精密稱取麥角甾醇對照品0.006 g放入燒杯中，倒入甲醇使其溶解，將溶解后的溶液定容于100 mL的容量瓶中得到0.06 mg/mL的對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，放入4 ℃冷藏箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 豬苓菌核樣品溶液的制備

精密稱取豬苓菌核樣品粉末0.5 g放入三角瓶中，并加入精密量取的甲醇10 mL，稱定其重量后記錄并蓋塞，經(jīng)過超聲處理后放冷，加純甲醇補(bǔ)足至記錄的重量，再用0.45 μm的濾膜將樣品溶液過濾，得到豬苓菌核樣品溶液。

表1 長白山區(qū)不同豬苓產(chǎn)地的基本狀況

1.5 豬苓指紋圖譜試驗條件的選擇

該試驗選用254 nm作為檢測波長，在該波長下呈現(xiàn)大多數(shù)色譜峰，通過查閱豬苓相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)劉國庫[16]、魯文靜等[17]人都選取254 nm作為檢測波長；分別用流動相甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.3%乙酸水的梯度洗脫方式比較分離情況，其中，乙腈-水能夠相對較好的洗脫豬苓菌核成分但是響應(yīng)值較低，用乙腈-0.3%乙酸水做流動相會提高響應(yīng)值，洗脫時間程序如圖1；對柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)、流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)柱溫為30 ℃和流速為1.0 mL/min色譜圖的分離效果最好。

圖1 流動相洗脫梯度

分別用純甲醇、70%甲醇、50%甲醇對豬苓菌核進(jìn)行時間為40、60、80 min的提取，結(jié)果表明，純甲醇提取的指紋圖譜的峰面積較高，提取時間為60和80 min時指紋圖譜的峰面積較高且相差不大，因此，選擇用純甲醇超聲提取60 min。

最終確定實驗條件：色譜條件為色譜柱為ZORBAX C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.3%乙酸水，檢測波長為254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL；提取條件為純甲醇超聲提取60 min。

1.6 豬苓指紋圖譜方法學(xué)考察

1.6.1 精密度試驗

取同一樣品豬苓菌核粉末JDH-1，在最佳提取條件下制備豬苓菌核樣品溶液，精密吸取1 mL，在最佳色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄樣品共有峰的保留時間和峰面積。

1.6.2 重復(fù)性試驗

取同一樣品豬苓菌核粉末JDH-1，在最佳提取條件下制備豬苓菌核樣品溶液，精密量取該溶液5份，在最佳色譜條件下分別進(jìn)樣，記錄樣品色譜峰保留時間和峰面積。

1.6.3 穩(wěn)定性試驗

取同一樣品豬苓菌核粉末JDH-1，在最佳提取條件下制備豬苓菌核樣品溶液，在最佳色譜條件下分別在0，4，6，8，10，12，24 h進(jìn)樣，記錄樣品色譜峰保留時間和峰面積。

1.6.4 考察結(jié)果

由于10號色譜峰含量較高，保留時間很穩(wěn)定，因此選擇10號峰作為參照峰，并以它計算豬苓菌核樣品JDH-1相對保留時間以及相對峰面積。通過對精密度考察結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于0.32%和3.02%，表明儀器精密度良好；由重復(fù)性考察結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于0.25%和5.36%，說明該方法的重復(fù)性良好；由穩(wěn)定性考察結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD小于2.73%，說明豬苓菌核樣品溶液在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

將25個豬苓菌核樣品的HPLC色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”，對色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，生成對照指紋圖譜圖，并進(jìn)行相似度評價分析。將25個長白山區(qū)不同產(chǎn)地豬苓菌核HPLC指紋圖譜共有峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0分析軟件，以10個共有峰峰面積為參數(shù)，利用組間聯(lián)接聚類法和平方歐氏距離進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法判別制作25個豬苓菌核樣品的得分矩陣圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬苓指紋圖譜的建立

在中國藥典中以及相關(guān)文獻(xiàn)中，可知麥角甾醇是豬苓的特征性成分，故選該成分作為對照品進(jìn)行分析(圖2)。

圖2 麥角甾醇對照品色譜圖

按照1.5的最佳提取條件和色譜條件，得到25個長白山區(qū)不同產(chǎn)地豬苓菌核樣品色譜圖數(shù)據(jù)，將這25個豬苓菌核樣品圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”，采用“平均數(shù)”法，經(jīng)多點(diǎn)校正確定了10個共有峰。其中,10號峰通過比對指認(rèn)為麥角甾醇，并進(jìn)行數(shù)據(jù)匹配，生成對照指紋圖譜(圖3)，并得到25個長白山區(qū)豬苓菌核對應(yīng)的指紋圖譜(圖4)，其中,有標(biāo)為A、B的兩個峰有待于深入研究。

圖3 豬苓對照指紋圖譜

圖4 25個長白山區(qū)不同產(chǎn)地豬苓指紋圖譜

以10號峰作為參照峰，按公式計算25個長白山區(qū)不同產(chǎn)地豬苓菌核樣品的10個共有峰的相對保留時間及相對峰面積(表2，3)。

相對保留時間=各組分峰的保留時間/參照峰的保留時間；相對保留峰面積=各組分峰的峰面積/參照峰的峰面積。

表2 25個長白山區(qū)不同產(chǎn)地豬苓指紋圖譜中共有峰的相對保留時間

表3 25個長白山區(qū)不同產(chǎn)地豬苓指紋圖譜中共有峰的相對峰面積

續(xù)表3 25個長白山區(qū)不同產(chǎn)地豬苓指紋圖譜中共有峰的相對峰面積

由表2,3可知，長白山區(qū)不同產(chǎn)地豬苓菌核HPLC指紋圖譜共有峰的相對保留時間RSD值小于0.24%，而各共有峰相對峰面積的RSD相差較大，說明豬苓菌核樣品的峰面積間有差異，這就代表豬苓菌核樣品的化學(xué)成分含量相差較大，表明質(zhì)量有一定差異。

2.2 豬苓指紋圖譜的相似度評價

將25個豬苓菌核樣品的色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”并生成豬苓對照指紋圖譜后，按夾角余弦法對這25個豬苓菌核樣品與豬苓對照指紋圖譜進(jìn)行比較得到豬苓菌核樣品相似度數(shù)據(jù)，再根據(jù)相似度數(shù)據(jù)繪制熱圖(圖5)。經(jīng)過相似度評價，所選擇的25個長白山區(qū)豬苓菌核的指紋圖譜相似度為0.819～0.979，由于并不是所有樣品相似度都達(dá)到0.9，說明樣品成分之間有一定差異。

注：越綠表示相似度越高，越紅表示相似度越低，黃色表示介于中間。

2.3 豬苓指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別分析

2.3.1 豬苓菌核的聚類分析

將25個長白山區(qū)不同產(chǎn)地豬苓菌核HPLC指紋圖譜共有峰面積導(dǎo)入SPSS 22.0分析軟件，以10個共有峰峰面積為參數(shù)，利用組間聯(lián)接聚類法和平方歐氏距離進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析(圖6)。組間的距離值(臨界值R)越小則樣品間的差異越小。當(dāng)分類距離<5時，除樣品HMDJ-1、HMDJ-4、LBX-1、JAT-1外，其他樣品就已聚為一類，在5<分類距離<10時，樣品HMDJ-4、LBX-1、JAT-1也逐漸與其他樣品聚集在一起，當(dāng)分類距離>20時，樣品JAT-1才與其他樣品有交點(diǎn)，說明樣品JAT-1與其他樣品有一定差異。這可能是由于不同產(chǎn)地豬苓環(huán)境有差異，也有可能是其他因素導(dǎo)致部分化學(xué)成分的含量具有一定的差異。

圖6 25個長白山豬苓聚類結(jié)果圖

2.3.2 豬苓菌核的主成分分析(PCA)

為了能夠評價10個共有成分對樣品的分辨能力，采用SPSS 22.0版軟件對25個長白山區(qū)豬苓菌核共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，求出相關(guān)矩陣的特征值及其貢獻(xiàn)率(表4)，并以它們作為依據(jù)篩選主成分。以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果顯示，3個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為75.996%，包含了大部分的信息，達(dá)到了降維的目的。其中，第1主成分(PC1)、第2主成分(PC2)、第3主成分(PC3)特征根分別為4.629、1.609和1.362，方差貢獻(xiàn)率分別為46.287%、16.09%和13.619%。PCA碎石圖(圖7)，率先提取出來的3個成分的坡度較為陡峭而后續(xù)形成的坡度較為平緩，說明這3個主成分可能就是鑒別長白山區(qū)豬苓最主要的色譜峰。

通過旋轉(zhuǎn)后共有峰因子載荷矩陣(表5)發(fā)現(xiàn)，第1主成分的信息包括色譜峰1～4、6～8；第2主成分的信息包括色譜峰4、9～10；第3主成分的信息包括色譜峰5、10，說明有多個成分作用共同影響豬苓菌核的質(zhì)量。

為了分析長白山豬苓菌核質(zhì)量的差異性規(guī)律，利用SIMCA 14.1軟件對25個長白山區(qū)豬苓指紋圖譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA-X分析(圖8)。從圖8中可以更清楚的看出不同產(chǎn)地樣品分布情況，樣品分布距離越遠(yuǎn)表明差異性越大，除了JAT-1的豬苓菌核，其他豬苓菌核依次聚為一類，表明長白山區(qū)不同產(chǎn)地的豬苓間存在一定的相關(guān)性，結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

表4 豬苓的特征值和方差貢獻(xiàn)率

圖7 豬苓的主成分碎石圖

表5 豬苓的旋轉(zhuǎn)后共有峰因子載荷矩陣

圖8 豬苓主成分分析PCA-得分圖

2.3.3 豬苓菌核的正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析對25個豬苓菌核樣品進(jìn)一步分析，得分矩陣圖見圖9。該模型R2X(cum)=0.991，R2Y(cum)=0.894，Q2=0.573，該模型各數(shù)值均大于0.5，說明模型穩(wěn)定可靠，適合作為長白山區(qū)豬苓指紋圖譜的模式識別方法。通過變量重要性投影值(VIP)來篩選能引起長白山豬苓菌核成分差異的主要標(biāo)記性成分，其中，擁有較大VIP值的變量，對分類的貢獻(xiàn)越大。以VIP>1為標(biāo)準(zhǔn)，從圖10可以看出，篩選出對模型上2組間分類貢獻(xiàn)較大的4個變量，依次是色譜峰2、色譜峰10、色譜峰5、色譜峰4，其中，色譜峰10被指認(rèn)為麥角甾醇。

圖9 豬苓的OPLS-DA得分圖

圖10 豬苓的正交偏最小二乘法判別分析VIP值圖

3 討論

該試驗建立了長白山區(qū)不同產(chǎn)地25個豬苓菌核的HPLC指紋圖譜，利用《中國藥典》“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004”版確定了10個共有峰，指認(rèn)了其中1個成分為麥角甾醇。25個豬苓指紋圖譜的相似度為0.819～0.979，表明不同產(chǎn)地豬苓之間有一定差異。這與劉國庫[16]研究結(jié)果相似，但劉國庫采集了秦嶺、燕山、太行山、長白山、云貴高原和關(guān)中平原6個產(chǎn)區(qū)的豬苓，其豬苓指紋圖譜的相似度為0.486～0.972，差異很大，可能是由于采集的豬苓產(chǎn)區(qū)跨度大，尤其長白山產(chǎn)區(qū)的豬苓被認(rèn)為應(yīng)該單獨(dú)歸為一類。由于無法確定引起差異的具體原因，因此同時結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對長白山區(qū)豬苓進(jìn)行質(zhì)量評價，由聚類分析、主成分分析結(jié)果可知，當(dāng)分類距離大于20時，除JAT-1外，其余豬苓菌核已經(jīng)聚集在一起，可以認(rèn)為JAT-1的豬苓菌核與其他豬苓菌核有差別，可能是生長環(huán)境不同導(dǎo)致。由正交偏最小二乘判別分析發(fā)現(xiàn)5個造成不同豬苓菌核質(zhì)量差異性的主要標(biāo)記物依次是峰2、峰10、峰5、峰4，其中，峰10是麥角甾醇。

該試驗采用HPLC中藥指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)模式識別分析的方法，可以更可靠的用于中藥質(zhì)量評價[18]，對于長白山區(qū)不同產(chǎn)地豬苓質(zhì)量評價有初步判斷，為更深入地研究豬苓，更有效的控制豬苓質(zhì)量提供一個參考。

由于豬苓中的內(nèi)含化學(xué)成分多而復(fù)雜，并且會受到外界的影響，因此所建立的豬苓指紋圖譜具有“模糊性”。該試驗的豬苓指紋圖譜中除了這10個共有峰外，有2個峰在多個樣品中出現(xiàn)且面積較大，已在指紋圖譜中標(biāo)記為峰A和峰B，有待進(jìn)一步用更多樣品進(jìn)行驗證是不是豬苓共有成分，在后續(xù)的研究中可以使用儀器聯(lián)用技術(shù)來建立更完整、詳細(xì)的豬苓指紋圖譜。

4 結(jié)論

該試驗建立了長白山區(qū)不同產(chǎn)地的25個豬苓(雞爪苓)樣品的HPLC指紋圖譜，25個豬苓指紋圖譜的相似度為0.819～0.979，說明不同產(chǎn)地的豬苓菌核樣品質(zhì)量有差異；聚類分析和主成分分析均顯示豬苓分為2類；通過正交偏最小二乘判別分析發(fā)現(xiàn)4個造成不同豬苓菌核質(zhì)量差異性的主要標(biāo)記物，依次是峰2、峰10、峰5、峰4，其中，峰10是麥角甾醇。