響應(yīng)面法優(yōu)化超聲協(xié)同胃蛋白酶提取鰹魚皮膠原蛋白的工藝研究

陳 文 娟

(漳州城市職業(yè)學(xué)院 食品工程系，福建 漳州 363000)

鰹魚(Katsuwonus pelamis)又名炸彈魚，是金槍魚科、鰹魚屬魚類，廣泛分布于太平洋、印度洋和大西洋的熱帶和亞熱帶海域，是金槍魚漁業(yè)中重要的目標(biāo)魚類之一[1-2]。鰹魚肉質(zhì)柔軟、膽固醇低、蛋白質(zhì)含量高、氨基酸比例合理、容易被人體吸收，是優(yōu)質(zhì)的食品蛋白質(zhì)來源。鰹魚不僅可以鮮食，還可以加工成咸干制品或罐頭，是重要的海鮮加工品之一[3-4]。但目前鰹魚加工過程中產(chǎn)生的鱗片、魚皮等副產(chǎn)品通常被丟棄或制成廉價(jià)飼料，造成巨大的資源浪費(fèi)，鰹魚皮中含有大量的蛋白質(zhì)，是開發(fā)水產(chǎn)膠原蛋白的良好原料[5]。膠原蛋白占動(dòng)物體內(nèi)總蛋白質(zhì)含量的25%～30%，是動(dòng)物結(jié)締組織的主要成分，已廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域[6-7]。超聲提取具有低污染、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在生物活性物質(zhì)提取方面具有良好的應(yīng)用前景。酶法提取具有反應(yīng)快、時(shí)間短、無污染等優(yōu)點(diǎn)，此外，酶法對(duì)膠原蛋白的破壞力較小，可以獲得的較高活性的膠原蛋白[8]。將超聲提取與酶法提取進(jìn)行協(xié)同作用，是提高膠原蛋白提取率的一種新型方法，史睿等[9]采用超聲協(xié)同胃蛋白酶輔助對(duì)駱駝皮膠原蛋白進(jìn)行提取，確定了在最優(yōu)的提取工藝條件下，駱駝皮膠原蛋白的提取率可達(dá)41.99%(±1.57%)；李根等[10]為提高鯢皮膠原蛋白的提取率，采用超聲協(xié)同胃蛋白酶對(duì)鯢皮膠原蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，采用超聲協(xié)同胃蛋白酶所提取的鯢皮膠原蛋白提取率可達(dá)37.36%(±2.61%)，明顯高于未用超聲處理鯢皮膠原蛋白的提取率17.56%(±1.77%)。目前，尚未發(fā)現(xiàn)有利用超聲協(xié)同胃蛋白酶對(duì)鰹魚皮膠原蛋白提取的報(bào)道，該研究以鰹魚皮為原料，對(duì)超聲協(xié)同胃蛋白酶提取膠原蛋白的工藝進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，確定了最佳提取工藝條件，為鰹魚皮資源提取膠原蛋白的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鰹魚，市售；胃蛋白酶(1 200 U/g)，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、羥脯氨酸等均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-100DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1800PC-DS2型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白的提取

將鰹魚去鱗、去鰭、去頭、去內(nèi)臟后對(duì)剖成2片，再將魚皮與魚肉分離。將魚皮剪成碎片，清水沖洗干凈，陰涼處自然晾干，備用。用NaOH溶液浸泡魚皮脫蛋白和脫色，后用正己烷去除脂肪，后加入pH值為2.0的磷酸鹽緩沖溶液浸泡12 h進(jìn)行勻漿，放入超聲波中處理一定時(shí)間，加入適量的胃蛋白酶溶液，然后放入一定的恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解提取，滅酶，冷卻、離心，取上清液測(cè)定鰹魚魚皮膠原蛋白提取率。

1.3.2 鰹魚皮膠原蛋白提取率的測(cè)定

利用《肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定》(GB/T 9695.23-2008)對(duì)羥脯氨酸含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出鰹魚皮膠原蛋白提取率。

(1)

式中,W為羥脯氨酸得率，%；k為稀釋倍數(shù)；b為羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度，g/L；V為提取液體積，mL；n為換算系數(shù)(取0.1)；m1為鰹魚皮質(zhì)量，g。

最終通過下式得到鰹魚皮膠原蛋白提取率為：

(2)

式中,X為鰹魚皮膠原蛋白提取率，%；w為羥脯氨酸含量，g；11.1 為羥脯氨酸換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)；m2為鰹魚皮質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以鰹魚皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，每次實(shí)驗(yàn)鰹魚皮用量為10 g，以超聲時(shí)間、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶用量4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，固定各單因素條件在超聲時(shí)間150 min，酶解溫度35 ℃，酶解時(shí)間240 min，酶用量180 U/g的條件下提取膠原蛋白，分別設(shè)置考察超聲時(shí)間(90、120、150、180、210 min)，酶解溫度(25、30、35、40、45 ℃)、酶解時(shí)間(180、210、240、270、300 min)和加酶量(140、160、180、200、220 U/g)對(duì)膠原蛋白提取率的影響，每個(gè)水平測(cè)定3次，取均值。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素的最佳工藝條件，選取超聲時(shí)間、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶用量4個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)并進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，具體工藝參數(shù)如表1所示。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

由圖1可知，隨著超聲時(shí)間的延長膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在超聲時(shí)間為150 min時(shí)，提取率效果最佳，說明此時(shí)膠原蛋白溶出量最好，但超過150 min后，膠原蛋白提取率反而降低，這是因?yàn)椴糠帜z原蛋白在長期的超聲處理過程中由于系統(tǒng)局部溫度過高導(dǎo)致結(jié)構(gòu)被破壞[11]。因此，超聲波時(shí)間選擇為150 min。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.1.2 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在酶解溫度為35 ℃時(shí)，提取率效果最佳，說明此時(shí)溫度為酶最適宜的活性溫度，酶活力強(qiáng)，酶解速度快，膠原蛋白提取率高，但酶解溫度超過35 ℃后，膠原蛋白提取率反而降低，這是因?yàn)槲傅鞍酌覆辉谶m宜的活性溫度下，容易發(fā)生鈍化而活力下降[12]，因此，酶解溫度選擇為35 ℃。

圖2 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在酶解時(shí)間為240 min時(shí)，提取率效果最佳，說明此時(shí)酶與底物充分接觸，酶解效果最佳，但酶解時(shí)間超過240 min后，膠原蛋白提取率反而降低，這是因?yàn)椴糠帜z原蛋白在酶作用太長時(shí)間時(shí)會(huì)發(fā)生水解[13]。因此，酶解時(shí)間選擇為240 min。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.1.4 酶用量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

由圖4可知，隨著酶用量的增加膠原蛋白提取率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在酶用量為180 U/g時(shí)，提取率效果最佳，說明此時(shí)酶的濃度與底物的作用效率最高，但當(dāng)酶用量超過180 U/g后，膠原蛋白提取率反而降低，這是因?yàn)檫^量的酶濃度作用，酶會(huì)將底物包裹而減少了酶解作用[14]，因此，酶用量選擇為180 U/g。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化工藝

2.2.1 回歸模型

基于Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design Expert 8.05b軟件進(jìn)行處理，確定了以膠原蛋白提取率為響應(yīng)值，超聲時(shí)間(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)、酶用量(D)4個(gè)工藝為因素的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

圖4 酶用量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

表2 膠原蛋白提取的Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)表2的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再通過Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行計(jì)算，確定了超聲時(shí)間(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)和酶用量(D)對(duì)膠原蛋白提取率(Y)的四元二次回歸方程：

Y=37.88-0.54A+1.11B+1.06C+0.53D+0.74AB-0.51AC+0.01AD+0.08BC+0.24BD-0.36CD-2.03A2-2.04B2-1.86C2-1.77D2。

(3)

根據(jù)表3提取工藝的回歸模型及結(jié)果，得到該回歸方程F=34.09，P<0.000 1，回歸方程極顯著；回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.971 5，說明有97%以上的響應(yīng)值的變化可以用該模型來進(jìn)行描述與預(yù)測(cè)。而失擬項(xiàng)F=3.99，P=0.097 4>0.05，不顯著，說明該回歸方程的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)的真實(shí)值之間具有較好的擬合度。綜上分析，利用該回歸模型方程來對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)是有一定的依據(jù)，是可靠的。回歸方程中一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AB、二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)膠原蛋白提取率影響極顯著(P<0.01)；交互項(xiàng)AC對(duì)膠原蛋白提取率影響顯著(P<0.05)，說明超聲時(shí)間(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)和酶用量(D)等工藝與膠原蛋白提取率之間不是簡單的線性關(guān)系。另外,從表3方差分析表中的F值及P值可以看出，各工藝對(duì)膠原蛋白提取率影響的大小順序?yàn)椋築>C>A>D，即酶解溫度>酶解時(shí)間>超聲時(shí)間>酶用量。

表3 提取工藝的回歸模型及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面圖和等高線圖是反映所考察工藝及工藝間交互作用對(duì)響應(yīng)值作用程度的圖形，從圖中可以直觀地判斷兩兩因素之間交互作用的影響程度。利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，繪制得到圖5～6，其它影響不顯著的圖略。圖中反映了超聲時(shí)間(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)和酶用量(D)4個(gè)因素中，其中2個(gè)因素取零水平的情況下，剩余的其它兩因素之間相互作用對(duì)膠原蛋白提取率的影響程度。從圖中可以直觀地看出超聲時(shí)間和酶解溫度交互作用的響應(yīng)面圖曲線最陡，等高線圖呈橢圓形最厲害，說明超聲時(shí)間和酶解溫度的交互作用對(duì)膠原蛋白提取率的影響最為顯著，同理可得，影響鰹魚皮膠原蛋白提取率的各交互作用因素順序?yàn)锳B>AC>CD>BD>BC>AD。

圖5 超聲時(shí)間和酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

圖6 超聲時(shí)間和酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.2.3 最佳工藝及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Design Expert 8.05b軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的分析及結(jié)果，得到超聲協(xié)同胃蛋白酶提取鰹魚皮膠原蛋白的最佳工藝條件為：超聲時(shí)間146.34 min、酶解溫度36.32 ℃、酶解時(shí)間248.85 min、酶用量182.74 U/g，在此最佳工藝條件下，預(yù)測(cè)的膠原蛋白的提取率為38.25%。為了實(shí)驗(yàn)操作的簡便，將最佳工藝條件修正為：超聲時(shí)間146 min、酶解溫度36 ℃、酶解時(shí)間249 min、酶用量183 U/g，在修正后提取工藝條件下，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)作平行驗(yàn)證，得到鰹魚皮膠原蛋白提取率的平均值為38.11%，與預(yù)測(cè)提取率的相對(duì)誤差為0.37%，說明該回歸模型具有一定的可靠性，準(zhǔn)確度好，因此，利用響應(yīng)面對(duì)超聲協(xié)同胃蛋白酶提取鰹魚皮膠原蛋白的提取工藝進(jìn)行分析與工藝指導(dǎo)具有一定的應(yīng)用意義。

3 結(jié)論

該研究以鰹魚皮為原料，采用超聲協(xié)同胃蛋白酶提取鰹魚皮膠原蛋白，利用單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)影響提取工藝的因素進(jìn)行了優(yōu)化。研究表明，在單因素實(shí)驗(yàn)中，膠原蛋白提取率隨著超聲時(shí)間、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶用量4個(gè)因素水平的增加，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中，由方差分析結(jié)果可知，各工藝對(duì)膠原蛋白提取率影響的大小順序?yàn)椋好附鉁囟?酶解時(shí)間>超聲時(shí)間>酶用量。超聲協(xié)同胃蛋白酶提取鰹魚皮膠原蛋白的最佳工藝條件為：超聲時(shí)間146 min、酶解溫度36 ℃、酶解時(shí)間249 min、酶用量183 U/g。在此工藝條件下，膠原蛋白的提取率為38.11%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.37%，說明該回歸模型具有一定的可靠性，準(zhǔn)確度好，說明響應(yīng)面法可以較好地預(yù)測(cè)超聲協(xié)同胃蛋白酶提取鰹魚皮膠原蛋白的提取率。