人視網(wǎng)膜脫離后細(xì)胞及細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)變化的觀察

紀(jì)康康 路星 丁婕 胡聞 章梅 董凱

視網(wǎng)膜脫離(retinal detachment，RD)是指視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層與色素上皮層的分離，是造成人類視力障礙的常見(jiàn)原因[1，2]。進(jìn)行視網(wǎng)膜再附著手術(shù)是促進(jìn)視力恢復(fù)的主要方法，隨著外科技術(shù)的發(fā)展，手術(shù)促進(jìn)視網(wǎng)膜再附著的成功率超過(guò)90%[3，4]，但由于RD后組織缺血、缺氧，造成感光細(xì)胞的死亡，因此，患者術(shù)后視力恢復(fù)情況不甚理想，尤其當(dāng)RD涉及黃斑部位時(shí)[2，5]。

近年來(lái)關(guān)于實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離的相關(guān)研究表明，實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離后，感光細(xì)胞出現(xiàn)凋亡、壞死、壞死性凋亡的形態(tài)學(xué)改變[6-8]，其中以凋亡為主[9]。過(guò)去關(guān)于RD后細(xì)胞形態(tài)變化的研究大都建立在動(dòng)物模型的基礎(chǔ)之上，關(guān)于人類RD后視網(wǎng)膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變的研究比較少，且研究的重點(diǎn)往往不是RD后各類視網(wǎng)膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，Nag等[10]總結(jié)了人類視網(wǎng)膜正常情況下的超微結(jié)構(gòu)以及在衰老和各種病理狀態(tài)下的微結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)衰老的視錐視桿細(xì)胞出現(xiàn)外節(jié)盤膜的無(wú)序排列，感光細(xì)胞核形狀、大小不一，染色質(zhì)密度不同，空位明顯等改變，在外傷性視網(wǎng)膜損傷后，內(nèi)核層、外核層出血，感光細(xì)胞壞死；Nork等[11]在一項(xiàng)關(guān)于人類RD后視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞的選擇性丟失的研究中提到，RD后3 d視網(wǎng)膜色素上皮層缺失，圓錐體嚴(yán)重腫脹，伴有異位核和固縮核。其他關(guān)于RD的相關(guān)研究中，尚未有對(duì)于人類視網(wǎng)膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的針對(duì)性介紹，因此我們對(duì)5例RD患者進(jìn)行術(shù)中取材，分別取孔蓋、原發(fā)孔后緣、術(shù)中造孔后緣的視網(wǎng)膜組織，制片后分別記為A(2人)、B(2人)、C(1人)組，制片后通過(guò)透射電子顯微鏡(transmissionelectron microscopy，TEM)簡(jiǎn)單觀察和比較了各組視網(wǎng)膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

資料與方法

一、取材來(lái)源

本研究實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守《赫爾辛基宣言》的基本原則，并通過(guò)中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2020-(N)H-086)。取材來(lái)自5例RD患者?；颊逜1為右眼RRD患者，周邊網(wǎng)膜10點(diǎn)鐘方向可見(jiàn)1.5 PD大小的馬蹄形裂孔1個(gè)，上方隱約可見(jiàn)孔蓋,如圖 1A，手術(shù)過(guò)程中將粘附有玻璃體的孔蓋剪下，制作標(biāo)本?；颊逜2周邊網(wǎng)膜9點(diǎn)鐘方向可見(jiàn)1個(gè)2 PD大小的馬蹄形裂孔，同樣方法處理孔蓋制作標(biāo)本?；颊連1為左眼RD患者，全視網(wǎng)膜呈360度青灰色隆起，如圖 1B，術(shù)中可見(jiàn)顳上方有約2.5 PD大小的長(zhǎng)條形裂孔，裂孔后緣視網(wǎng)膜卷曲，視網(wǎng)膜為避免該卷曲的邊緣影響視網(wǎng)膜再附著，術(shù)中予以剪下，作為標(biāo)本制作的材料，B2為右眼鼻上方周邊視網(wǎng)膜3 PD大小橢圓形裂孔伴有裂孔后緣網(wǎng)膜卷曲，同樣方法處理裂孔后緣制作標(biāo)本。患者C為右眼RD患者，于顳上方約10點(diǎn)方向可見(jiàn)約2/3 PD大小類圓形裂孔1個(gè)，下方網(wǎng)膜青灰色隆起，裂孔下方約9點(diǎn)方向有視網(wǎng)膜下增殖線條，如圖 1C，該線條會(huì)影響RD術(shù)后視網(wǎng)膜的再附著，為提高患者預(yù)后，術(shù)中于視網(wǎng)膜增殖線條旁造孔，造孔時(shí)剪下的視網(wǎng)膜作為標(biāo)本制作的材料，所制作的標(biāo)本為C組。

圖1 3例RD患者的眼底檢查圖像 A：患者A1右眼眼底圖像，顳側(cè)10點(diǎn)方向可見(jiàn)1.5 PD大小馬蹄形裂孔和1PD大小圓形裂孔(白箭)；B：患者B1左眼眼底圖像，全網(wǎng)膜隆起；C：患者C右眼眼底圖像，顳上方1點(diǎn)方向可見(jiàn)2/3 PD大小類圓形裂孔(白箭)，其下方可見(jiàn)視網(wǎng)膜下長(zhǎng)增殖線條(黑箭)

二、標(biāo)本制作

取下的組織用2.5%戊二醛電鏡固定液固定12 h,使用磷酸緩沖鹽水(PBS)清洗3次，每次15 min,1%四氧化鋨固定2h,然后用濃度梯度的酒精脫水，使用環(huán)氧乙烷浸透、包埋，然后將包埋塊切片，厚度為70 nm,最后使用鉛和鈾，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，使核酸和細(xì)胞膜著色后自然風(fēng)干，在TEM(日產(chǎn)JEM-1400Flash透射電鏡)下觀察拍照[2，8，12]。

結(jié) 果

以染色質(zhì)濃縮邊聚，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞間距增大為凋亡；以質(zhì)膜不完整，破裂，核固縮溶解為壞死；以質(zhì)膜不完整、破裂，核固縮溶解，染色質(zhì)濃集，并伴有明顯的自噬泡和空泡為壞死性凋亡[6，8，12]。通過(guò)TEM觀察發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，已經(jīng)無(wú)法具體區(qū)分某些細(xì)胞屬于哪一類視網(wǎng)膜細(xì)胞，只能描述細(xì)胞死亡后的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。

在A組標(biāo)本中，我們找到大量凋亡的感光細(xì)胞，它們主要表現(xiàn)為染色質(zhì)濃縮邊聚，質(zhì)膜皺縮，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞間空位明顯，偶見(jiàn)空泡化的線粒體，如圖 2a；能夠發(fā)現(xiàn)一些典型的壞死性凋亡表現(xiàn)，完全找不到質(zhì)膜的邊界，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核膜皺縮，染色質(zhì)濃縮，密度極不均勻，核周圍可見(jiàn)大量空泡，無(wú)法區(qū)分該細(xì)胞屬于哪一類視網(wǎng)膜細(xì)胞,如圖 2b；電鏡視野下發(fā)現(xiàn)了內(nèi)部結(jié)構(gòu)丟失的空泡化線粒體以及膨脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，部分線粒體結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生明顯改變,如圖 2c、圖 2d；未發(fā)現(xiàn)該組標(biāo)本有典型的壞死表現(xiàn)。電鏡視野中偶見(jiàn)形態(tài)規(guī)則，質(zhì)膜完整，染色質(zhì)密度較均一的細(xì)胞。

圖2 A組標(biāo)本電子顯微鏡圖像 a：凋亡的感光細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)濃集、邊聚(黑箭)，質(zhì)膜皺縮(白箭)，細(xì)胞間空位明顯，可見(jiàn)線粒體嵴斷裂，逐漸空泡化(黑星),標(biāo)尺：2 μm；b：壞死性凋亡的細(xì)胞。找不到細(xì)胞邊界，染色質(zhì)濃集邊聚(黑箭)，核膜皺縮(白箭)，細(xì)胞核周圍分布大量的空泡和自噬泡(黑星)，標(biāo)尺：1 μm；c：胞質(zhì)中可見(jiàn)空泡(黑星)，有結(jié)構(gòu)完整的線粒體，部分線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)丟失及空泡化(黑箭)，標(biāo)尺：1 μm；d：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹(黑箭)，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡(黑星)，標(biāo)尺：1 μm

在B組標(biāo)本中，出現(xiàn)典型的壞死細(xì)胞，質(zhì)膜破裂，胞漿內(nèi)容物釋放，可見(jiàn)完全空殼化的視網(wǎng)膜細(xì)胞，胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，如圖 3a；視錐細(xì)胞內(nèi)節(jié)壞死，質(zhì)膜破裂，空泡化現(xiàn)象明顯，線粒體數(shù)量減少且結(jié)構(gòu)腫脹，線粒體嵴斷裂，內(nèi)部結(jié)構(gòu)丟失，部分線粒體發(fā)生破裂,見(jiàn)圖 3b；可見(jiàn)少量視桿細(xì)胞，內(nèi)節(jié)出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，外節(jié)盤膜破裂,見(jiàn)圖 3c；外核層感光細(xì)胞皺縮，細(xì)胞核邊界模糊，但染色質(zhì)密度尚均一，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，符合壞死性凋亡的表現(xiàn)，還可發(fā)現(xiàn)趨于裂解的細(xì)胞核，見(jiàn)圖 3d；在神經(jīng)纖維層附近發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)濃集、邊聚的凋亡細(xì)胞，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)尚正常,見(jiàn)圖 3e；電鏡視野下可以找到一些結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)密度均一，核仁清晰的感光細(xì)胞，見(jiàn)圖 3f。

圖3 B組標(biāo)本電子顯微鏡圖像 a：壞死的視網(wǎng)膜細(xì)胞。細(xì)胞完全空殼化(黑星)，相鄰細(xì)胞質(zhì)膜破裂(黑箭)，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡(白星)，標(biāo)尺：2 μm；b：視錐細(xì)胞內(nèi)段。質(zhì)膜破裂,發(fā)生壞死(黑箭)，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡(黑星)，線粒體數(shù)量減少，腫脹、嵴斷裂、空泡化，乃至破裂(白箭)，標(biāo)尺：2 μm；c:視桿細(xì)胞。外節(jié)盤膜破裂(黑箭)，內(nèi)節(jié)胞質(zhì)中可見(jiàn)空泡(黑星)，標(biāo)尺：2 μm；d：壞死及壞死性凋亡的感光細(xì)胞。壞死感光細(xì)胞的細(xì)胞核趨于分裂(黑星)，壞死性凋亡感光細(xì)胞質(zhì)膜皺縮(黑箭)、核邊界模糊(白箭)、胞質(zhì)出現(xiàn)少量空泡，標(biāo)尺：2 μm；e:凋亡的視網(wǎng)膜細(xì)胞。在神經(jīng)纖維層(黑星)附近發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)濃集、邊聚的視網(wǎng)膜細(xì)胞(白箭)，胞質(zhì)中可見(jiàn)結(jié)構(gòu)清晰的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(黑箭)，標(biāo)尺：2 μm；f：感光細(xì)胞。質(zhì)膜完整，染色質(zhì)密度均勻，核形態(tài)規(guī)則，邊界分明，核仁清晰，標(biāo)尺：2 μm

在C組標(biāo)本中，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)典型的壞死表現(xiàn)，核形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)密度均勻，質(zhì)膜完全消失，裸露的核周圍出現(xiàn)大量的自噬泡和空泡，無(wú)法分辨細(xì)胞類型，見(jiàn)圖 4a；偶見(jiàn)凋亡細(xì)胞，染色質(zhì)濃集現(xiàn)象明顯，胞質(zhì)中可見(jiàn)空泡,見(jiàn)圖 4a；未發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡細(xì)胞；視錐細(xì)胞內(nèi)節(jié)線粒體數(shù)量明顯減少，尚存的線粒體出現(xiàn)腫脹、空泡化、嵴斷裂等表現(xiàn)，內(nèi)部?jī)H見(jiàn)少量殘余的線粒體嵴結(jié)構(gòu)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹明顯，胞質(zhì)中可見(jiàn)空泡,見(jiàn)圖 4b、圖 4c；相比于凋亡、壞死和壞死性凋亡，單純的自噬現(xiàn)象在本組標(biāo)本中更加常見(jiàn)，可見(jiàn)極細(xì)胞染色質(zhì)密度均一，核形態(tài)規(guī)則，質(zhì)膜完整，但胞漿空泡多見(jiàn),見(jiàn)圖 4d；部分視野中未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，僅見(jiàn)大量自噬泡和空泡堆積,見(jiàn)圖 4e。

圖4 C組標(biāo)本電子顯微鏡圖像。a：壞死和凋亡的視網(wǎng)膜細(xì)胞。細(xì)胞膜完全破裂，找不到細(xì)胞邊界，核形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)密度均勻(白星)，裸露的核周圍出現(xiàn)大量空泡和自噬泡(黑星)；相鄰的細(xì)胞染色質(zhì)濃集現(xiàn)象明顯(黑箭)，胞質(zhì)中可見(jiàn)空泡，標(biāo)尺：2 μm；b：視錐細(xì)胞內(nèi)節(jié)。線粒體(黑箭)數(shù)量明顯減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯腫脹(白箭)，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡和自噬泡(黑星)，標(biāo)尺：1 μm；c：視錐細(xì)胞內(nèi)節(jié)。線粒體嵴斷裂、腫脹、空泡化，可見(jiàn)殘余的線粒體嵴(黑箭)，標(biāo)尺：1 μm；d：極細(xì)胞。胞質(zhì)中出現(xiàn)大量空泡，標(biāo)尺：2 μm；e：自噬泡和空泡堆積，標(biāo)尺：2 μm；f：感光細(xì)胞，標(biāo)尺：2 μm

比較A、B、C 3組標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)A組標(biāo)本中幾乎沒(méi)有正常細(xì)胞，凋亡現(xiàn)象更為典型，存在不同程度的壞死及壞死性凋亡；B組標(biāo)本中可見(jiàn)少量正常細(xì)胞，以壞死現(xiàn)象更為典型，存在不同程度的凋亡及壞死性凋亡；C組標(biāo)本發(fā)現(xiàn)大量正常細(xì)胞，各種死亡方式表現(xiàn)均不典型，而自噬現(xiàn)象更加典型。

討 論

關(guān)于RD的研究通常是在動(dòng)物模型中進(jìn)行，包括貓、大鼠以及一些靈長(zhǎng)類動(dòng)物等[2, 8, 13-16]，RD后感光細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡、壞死、壞死性凋亡以及自噬的形態(tài)學(xué)變化。一項(xiàng)關(guān)于貓RD的研究發(fā)現(xiàn)RD后光感受器細(xì)胞外節(jié)、內(nèi)節(jié)以及胞體都發(fā)生不同程度的死亡，視桿細(xì)胞死亡的速度快于視錐細(xì)胞，且RD時(shí)間越久，細(xì)胞死亡的表現(xiàn)就越明顯，但在RD后3個(gè)月，細(xì)胞死亡的速度開(kāi)始減緩[13]。受到以上研究成果的啟發(fā)，我們進(jìn)行了人類RD后視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)變化的研究，并從細(xì)胞距離原發(fā)病灶的距離這一角度出發(fā)，對(duì)比不同部位視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡的程度，以了解細(xì)胞死亡程度是否與細(xì)胞距離原發(fā)病灶的距離有關(guān)。同時(shí)，本研究也首次在人體視網(wǎng)膜脫離組織中發(fā)現(xiàn)了光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RD后，視網(wǎng)膜細(xì)胞出現(xiàn)凋亡及壞死性的表現(xiàn)，以孔蓋處最為多見(jiàn)，壞死性凋亡表現(xiàn)為壞死和凋亡的共同特征，伴有明顯的空泡化表現(xiàn)；細(xì)胞壞死以裂孔后緣最為典型；研究發(fā)現(xiàn)，在損傷早期，視網(wǎng)膜細(xì)胞自噬具有保護(hù)作用[17]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)造孔標(biāo)本中，自噬現(xiàn)象更為多見(jiàn)，因此我們推測(cè)，在距離原發(fā)孔距離越遠(yuǎn)的地方，細(xì)胞死亡的程度越輕，由遠(yuǎn)及近，出現(xiàn)以自噬、凋亡、壞死為主要形態(tài)的變化?？紤]到視網(wǎng)膜脫離是一個(gè)連續(xù)性過(guò)程，造孔處視網(wǎng)膜與裂孔周圍視網(wǎng)膜的脫離時(shí)間可能存在較大差異，因此時(shí)間因素的影響也不能排除，由于無(wú)法在人體中根據(jù)視網(wǎng)膜裂孔等距離連續(xù)取材，也無(wú)法動(dòng)態(tài)觀察人視網(wǎng)膜脫離范圍的變化，因此這一推測(cè)可能需要進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。受樣本量限制，RD后距離原發(fā)孔不同距離的視網(wǎng)膜細(xì)胞的主要死亡方式是否存在差異，這一點(diǎn)還有待深入研究。