低溫異養(yǎng)硝化–好氧反硝化菌的分離及其除氮特性

陳思宇，劉晶，楊正，黃元昊，彭英杰，舒志恒，張俊豪，蘭時樂

低溫異養(yǎng)硝化–好氧反硝化菌的分離及其除氮特性

陳思宇，劉晶，楊正，黃元昊，彭英杰，舒志恒，張俊豪，蘭時樂*

(湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

針對目前大部分除氮微生物遇冬季低溫難以對污水進行有效脫氮的問題，從冬季水浸稻田土壤中分離到1株在10～15 ℃下具有高效異養(yǎng)硝化好氧反硝化能力的菌株D15。經鑒定，確定該菌株為嗜堿假單胞菌()?？疾炝说促|量濃度(100、150、200、250、300、400、600、800 mg/L)，碳源種類(檸檬酸三鈉、丁二酸鈉、乙酸鈉、草酸鈉、麥芽糖)，搖床轉速(130、150、170、190、210 r/min)，培養(yǎng)溫度(5、10、15、20、25、30、35 ℃)對菌株D15除氮效果的影響。結果表明，菌株D15在以檸檬酸三鈉為碳源、初始氮源質量濃度150 mg/L、搖床轉速190 r/min、15 ℃條件下培養(yǎng)，對氨氮、硝氮及亞硝氮的去除率均達到了100.0%。在豬糞廢水中添加檸檬酸三鈉、15 ℃下分別處理54 h和66 h后，對氨氮和總氮的去除率分別達到100.0%和88.8%。

低溫異養(yǎng)硝化–好氧反硝化菌；嗜堿假單胞菌；豬糞廢水脫氮；除氮率

水產養(yǎng)殖及畜牧業(yè)快速發(fā)展的同時，伴隨著水體氮污染問題，對自然生態(tài)環(huán)境構成威脅。《2020年中國環(huán)境狀況公報》指出，氮素污染仍然是現(xiàn)階段海陸漁業(yè)水域的主要問題之一[1]。水體除氮主要采取物化法[2]和生物法[3]。物化法通過物理吸附、離子互換或向污水和廢水中添加藥劑來去除水中含氮類污染物，見效快，但容易造成水體環(huán)境的二次污染。生物脫氮則工藝流程簡單、對環(huán)境友好，被認為是更加節(jié)能環(huán)保、經濟高效的脫氮方式。傳統(tǒng)生物脫氮分為硝化作用和反硝化作用兩部分進行。由于2個過程的功能微生物生態(tài)位差別大，硝化和反硝化作用通常需要在2個獨立的反應器中進行，這在很大程度上增加了生物脫氮的成本[4]。ROBERTSON 等[5]分離出1株異養(yǎng)硝化–好氧反硝化(HN–AD)細菌。這種細菌可從有機碳中攝取營養(yǎng)，兼具硝化與反硝化能力，且整個脫氮過程可在有氧環(huán)境下進行。相較于傳統(tǒng)生物除氮技術，由HN–AD菌主導的新型脫氮技術更高效，成本更低廉。

有研究表明，低溫會使反硝化關鍵酶基因表達延遲[6]，抑制酶的活性，減緩微生物的生長，導致反硝化作用明顯減弱[7]，因此低溫成為冬季生物脫氮的限制性因素[8–9]。大多數(shù)脫氮菌株最適溫度為25～30 °C[10–11]，但冬季室外水體溫度通常低于20 ℃，常規(guī)的生物脫氮法受限于低溫環(huán)境，致使冬季廢水脫氮效果變差。已有研究者發(fā)現(xiàn)sp. M–11[12]、HITLi7T[13]、Y–9[14]、sp. HA2[15]等菌種，可在2～15 ℃條件下有效去除水體中的氨氮、硝態(tài)氮和亞硝氮，這為低溫環(huán)境下的污水除氮提供了生物技術支持。筆者從冬季水浸稻田土壤中篩選分離出1株在低溫條件下快速生長、除氮性能良好的HN–AD菌株，利用形態(tài)學和16S rDNA序列測定進行菌種鑒定，基于單因素試驗法研究其除氮特性，并進行豬場養(yǎng)殖廢水脫氮試驗，以期為冬季養(yǎng)殖廢水的除氮提供依據。

1　材料與方法

1.1　材料

2019年冬季，自湖南省農業(yè)科學院水稻田取土壤樣品。

2021年8月，自湖南農業(yè)大學動物試驗場取豬糞廢水。廢水原液初始氨氮含量為300.57 mg/L，硝態(tài)氮含量為37.59 mg/L，總氮含量為396.51 mg/L。

1.2　方法

1.2.1HN–AD菌株的篩選與鑒定

取土壤樣品，參照肖思遠等[16]方法，稍有修改，富集培養(yǎng) 72 h；連續(xù)富集2次后，利用BTB培養(yǎng)基分離出在平板上具有藍色顯色圈的菌株；再對分離的菌株進行搖瓶復篩，將菌株分別接入含有氨氮、硝氮和亞硝氮的培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h，測定氨氮、硝氮和亞硝氮的含量，并計算其去除率。依據氮去除率高低篩選出除氮性能最佳的菌株。利用形態(tài)學方法[3]和16S rDNA序列分析對目的菌株進行鑒定，測序交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.2HN–AD菌株除氮特性的測定

分別以硫酸銨、亞硝酸鈉和硝酸鉀為氮源，依次考察基礎培養(yǎng)基中的氮源質量濃度(100、150、200、250、300、400、600、800 mg/L)，碳源種類(檸檬酸三鈉、丁二酸鈉、乙酸鈉、草酸鈉、麥芽糖)，搖床轉速(130、150、170、190、210 r/min)，培養(yǎng)溫度(5、10、15、20、25、30、35 ℃)4個因素對HN–AD菌株除氮效果的影響。每個單因素試驗都基于前一單因素試驗結果來設計。單因素試驗的初始培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基初始pH7.0、接種量5%、培養(yǎng)溫度15 ℃、搖床轉速170 r/min培養(yǎng)48 h。測定發(fā)酵上清液中氨氮、硝氮、亞硝氮及總氮含量[17]，并計算除氮率。

1.2.3HN–AD菌株對豬糞廢水除氮效應的測定

基于單因素試驗結果，利用HN–AD菌對豬糞廢水進行發(fā)酵，模擬廢水除氮。以豬糞廢水原液為對照組；處理1組在廢水原液中添加經過適當培養(yǎng)的HN–AD菌種子液；處理2組在試驗1組的基礎上再添加1%的檸檬酸三鈉作為碳源。處理組于15 ℃、190 r/min 振蕩培養(yǎng)，定時取樣，測定樣液中氨氮、亞硝氮、硝氮和總氮含量，計算除氮率。

2　結果與分析

2.1　水稻土HN–AD菌種的篩選和鑒定結果

初篩共篩選到10株在分離培養(yǎng)基上具有藍色顯色圈的菌株，將這10株菌株純化后接種至斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存，分別編號為S1、S2、S3、W3、D1、D13、D15、D16、D17、D18。

10株菌株對氨氮、硝氮和亞硝氮的去除率列于表1。菌株D15對氨氮、亞硝氮和硝氮去除效果較佳，去除率分別達到了93.5%、99.9%和100.0%；因此，選用菌株D15作為后續(xù)試驗菌株。

表 1　HN–AD菌株的除氮效果

同列不同字母表示菌株間差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。

菌株D15在BTB平板上形狀規(guī)則，呈圓形，邊緣整齊；菌落較小、表面光滑濕潤、灰白色(圖1–a)。掃描電鏡結果顯示，菌體形狀為桿狀，大小為(0.29～0.36) μm×(1.14～2.39) μm。

a　菌落形態(tài)；b　菌體電鏡掃描結果(10 000倍)。

將D15菌株的16S rDNA基因序列(GenBank序列號為ON088982)與GenBank數(shù)據庫中已有細菌16S rDNA進行比對，發(fā)現(xiàn)其與屬菌株的16S rDNA序列同源性達99%以上，其中與JAB1(CP016162.1)同源性達100.00%。根據序列比對結果構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。將菌株D15鑒定為嗜堿假單胞菌()。

圖2　基于16S rDNA 基因序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2　HN–AD菌株的除氮特性

2.2.1初始氮質量濃度對菌株D15除氮效果的影響

培養(yǎng)基的初始氮質量濃度分別為100、150、200、250、300、400、600、800 mg/L時，菌株D15的除氮效果列于表2。當初始氨氮、亞硝氮和硝氮質量濃度均為150 mg/L時，菌株D15對氨氮、亞硝氮和硝氮去除率分別達到最大值96.2%、99.9%和100.0%。隨著初始氮質量濃度的增加，菌株D15的氨氮、亞硝氮和硝氮和總氮去除率逐步降低，因此，選擇培養(yǎng)基初始氮質量濃度為150 mg/L。

表2　初始氮質量濃度下菌株D15的除氮效果

同列不同字母表示處理間差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。

2.2.2碳源種類對菌株D15除氮效果的影響

培養(yǎng)基碳源分別為檸檬酸三鈉、丁二酸鈉、乙酸鈉、草酸鈉和麥芽糖時，菌種D15的除氮效果列于表3。不同碳源對菌株D15在不同氮源下的除氮效果差異顯著(<0.05)。當分別以檸檬酸三鈉、丁二酸鈉為碳源時，菌株D15的氨氮、亞硝氮和硝氮去除率均達到了100.0%。但整體而言，檸檬酸三鈉條件下的總氮去除率更高。綜合考慮，選擇以檸檬酸三鈉為適宜碳源。

表3　不同碳源培養(yǎng)菌株D15的除氮效果

同列不同字母表示處理間差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。

2.2.3搖床轉速對菌株D15除氮效果的影響

搖床轉速分別為130、150、170、190和210 r/min時，菌株D15的除氮效果如表4所示。在轉速為190 r/min時，菌株D15對氨氮、亞硝氮和硝氮去除率分別達到100.0%、99.9%和99.2%；繼續(xù)增加轉速，對氨氮、亞硝氮和硝氮去除率無明顯變化，但總氮去除率明顯降低。綜合考慮，選擇轉速190 r/min為宜。

表4　不同搖床轉速下菌株D15的除氮效果

同列不同字母表示處理間差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。

2.2.4培養(yǎng)溫度對菌株D15除氮效果的影響

培養(yǎng)溫度分別為5、10、15、20、25、30和35 ℃時，菌株D15的除氮效果列于表5。結果表明，當培養(yǎng)溫度為5 ℃時，菌株D15除氮效果并不明顯；當溫度升至10 ℃時，菌株D15的除氮效果有了顯著提升，氨氮去除率能達到98.2%，亞硝氮去除率也有54.3%；當溫度為15 ℃時，菌株D15的氨氮、亞硝氮和硝氮去除率均達到100.0%，總氮去除率也超過95.0%；當溫度超過20 ℃后，不同氮源條件下的總氮去除率逐漸降低；因此，選擇培養(yǎng)溫度15 ℃為宜。

表5　不同培養(yǎng)溫度下菌株D15的除氮效果

同列不同字母表示處理間差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。

2.3　菌株D15對豬糞廢水的除氮效果

從表6結果可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，各處理組氨氮去除率均呈上升趨勢。培養(yǎng)60 h，處理2的氨氮去除率達100.0%，顯著高于對照組(52.6%)和處理1(54.8%)。說明外加適量碳源可提高菌株D15對豬糞廢水中氨氮的去除率。

隨著培養(yǎng)時間的延長，CK與處理1對硝氮的去除率也隨之提高。當培養(yǎng)54 h時，兩者硝氮去除率均達100.0%，但在培養(yǎng)54 h前，處理1對硝氮的去除率均高于對照組，說明接入菌株D15可加快硝氮的去除。而處理2在培養(yǎng)48 h前，培養(yǎng)液中硝氮含量增加，說明添加碳源有利于加快氨氮的轉化。至培養(yǎng)66 h，硝氮去除率顯著下降，推測可能是因為培養(yǎng)時間過長，菌體死亡裂解，細胞內硝氮物質外流所致。

各處理豬糞廢水中總氮去除率也隨著時間的延長而提高。培養(yǎng)至54 h，CK和處理1的總氮去除率達最高分別為55.4%和56.3%，培養(yǎng)時間延長，總氮去除率下降，且CK組在培養(yǎng)至12 h后才表現(xiàn)出對總氮有去除能力，可能是廢水中自身的微生物利用其中氨氮或硝氮生長所致。處理2的總氮去除率隨培養(yǎng)時間的延長而提高，培養(yǎng)至66 h，總氮去除率高達88.8%。

表6　菌株D15在豬糞廢水中的除氮效果

3　結論與討論

從冬季浸稻田土壤中分離到1株在低溫下具有異養(yǎng)硝化–好氧反硝化能力的細菌D15，經形態(tài)學觀察、16S rDNA序列分析鑒定，確定為嗜堿假單胞菌()。HN–AD菌D15分別以氨氮、硝氮和亞硝氮為氮源，檸檬酸三鈉為碳源，15 ℃、初始氮質量濃度150 mg/L、搖床轉速190 r/min培養(yǎng)時，對氨氮、硝氮和亞硝氮去除率均達到了100.0%。

D15對豬場廢水的除氮試驗結果表明，在添加檸檬酸三鈉的條件下，發(fā)酵48 h時，對硝氮去除率可達98.3%；發(fā)酵66 h時，對氨氮、總氮去除率可分別達到100.0%和88.8%，脫氮效果較好。

從試驗結果來看，菌株D15對高濃度的氨氮和硝氮有較強的耐受性。在初始氮質量濃度高達800 mg/L時，菌株D15對氨氮、硝氮去除率仍有50.6%和58.4%，而菌株N3[18]在硝酸鹽質量濃度超過80.0 mg/L時，脫氮率顯著下降；菌株YN3[19]在氨氮質量濃度達到200 mg/L時，氨氮去除率僅有2.0%，這表明菌株D15在處理高濃度含氮廢水時將有較好的應用前景。

轉速過低難以為發(fā)酵提供充足的溶解氧(DO)條件，從而抑制好氧微生物的生長和脫氮性能[20]；而轉速過高又可能抑制反硝化過程中酶的活性[21]。本試驗中，當轉速為130～190 r/min時，隨著轉速的增加，菌株D15的除氮率隨之提高；當轉速繼續(xù)升至210 r/min時，菌株D15的氨氮、硝氮及亞硝氮去除率則相對穩(wěn)定，總氮去除率略有下降。這與ZHAO等[21]、邰勇等[22]的研究結果相似，但不同菌株的最適宜溶氧量有所差異，在實際應用過程中還需控制適當?shù)腄O值，亦即保持適當?shù)霓D速，以便菌株有效脫氮。

在15～35 ℃，菌株D15對氨氮、硝氮及亞硝氮的去除率幾乎都保持在100.0%的高水平。當溫度升至35 ℃時菌株D15在不同氮源條件下的總氮去除率降至70.0%左右，但仍高于相同溫度下熒光假單胞菌L2[23]的總氮去除率。此外，當培養(yǎng)溫度為10 ℃時，菌株D15的氨氮去除率高于此溫度下sp. M–33[24]的氨氮去除率。與假單胞菌GK–01、施氏假單胞菌SC221–M、氣單胞菌HN–02等[25–29]相比，菌株D15對溫度的適應性更加寬泛。

在處理豬糞廢水的試驗中，添加檸檬酸三鈉后，菌株D15的除氮效果顯著提升，說明添加碳源可確保合適的C/N、提供硝化和反硝化作用電子供體和充足的能量，從而提升菌株在廢水中的除氮競爭力。該研究結論與雷強等[30]一致。且菌株D15的廢水除氮率高于菌株GNR[31]，顯示菌株D15在豬糞廢水除氮上良好的應用潛能。

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Isolation and nitrogen removal characteristics of a low temperature heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium

CHEN Siyu，LIU Jing，YANG Zheng，HUANG Yuanhao，PENG Yingjie，SHU Zhiheng，ZHANG Junhao，LAN Shile*

(College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

In view of the problem that most nitrogen removal microorganisms are difficult to effectively remove nitrogen from sewage in winter at low temperature, a strain D15 with high efficiency of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification(HN-AD) at 10-15℃ was isolated from the soil of flooded rice fields in winter. Strain D15 was identified as. The effects of nitrogen source concentration (100, 150, 200, 250, 300, 400, 600, 800 mg/L), carbon sources type (trisodium citrate, sodium succinate, sodium acetate, sodium oxalate, maltose), shaking table speed (130, 150, 170, 190, 210 r/min), and culture temperature (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ℃) on nitrogen removal efficiency of strain D15 were investigated. The results showed that the removal rate of ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen of strain D15 reached 100.0% under the conditions of using trisodium citrate as carbon source, initial nitrogen source mass concentration of 150 mg/L, shaking table speed of 190 r/min with a culture temperature of 15 ℃. After adding trisodium citrate to pig manure wastewater, the wastewater was incubated with D15 strain at 15 ℃ for 54 h and 66 h respectively, the removal rates of ammonia nitrogen and total nitrogen from the wastewater by D15 strain reached 100.0% and 88.8% respectively.

low temperature heterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying bacteria;; nitrogen removal from pig manure wastewater; nitrogen removal rate

X172

A

1007-1032(2022)06-0712-06

陳思宇，劉晶，楊正，黃元昊，彭英杰，舒志恒，張俊豪，蘭時樂．低溫異養(yǎng)硝化–好氧反硝化菌的分離及其除氮特性[J]．湖南農業(yè)大學學報(自然科學版)，2022，48(6)：712–717．

CHEN S Y，LIU J，YANG Z，HUANG Y H，PENG Y J，SHU Z H，ZHANG J H，LAN S L．Isolation and nitrogen removal characteristics of a low temperature heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacterium[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(6)：712–717．

http://xb.hunau.edu.cn

2022–03–15

2022–10–12

湖南省自然科學基金項目(2020JJ6058)

陳思宇(1997—)，女，湖南衡陽人，碩士研究生，主要從事微生物資源開發(fā)利用研究，aclover@163.com；*通信作者，蘭時樂，副教授，主要從事微生物資源開發(fā)利用研究，875540378@qq.com

10.13331/j.cnki.jhau.2022.06.013

責任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維