基于HPLC-Q-TOF-MS的非那雄胺原料雜質結構及來源分析*

鄧 鳴，曾慶花，朱健萍，盧日剛

(廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所，廣西南寧 530021)

非那雄胺(Finasteride)化學名稱為N-叔丁基-3-氧代-4-氮雜-5α-雄甾-1-烯-17β-甲酰胺，分子式為C23H36N2O2。非那雄胺最早由美國默沙東公司開發(fā)研制，1991年獲準上市。非那雄胺是一種合成的甾體激素化合物，它是雄激素睪酮代謝為雙氫睪酮(Dihydrotestosterone，DHT)過程中的細胞內酶Ⅱ型5α還原酶的特異性抑制劑，具有抑制睪酮代謝的作用。良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia，BPH，也稱為前列腺肥大)有賴于體內有效的雙氫睪酮的含量，即取決于前列腺中睪酮向DHT的轉化。非那雄胺能有效降低血液和前列腺內的DHT濃度。目前非那雄胺制劑有5 mg和1 mg兩種規(guī)格，前者適應證為治療和控制良性前列腺增生及相關癥狀，后者用于治療男性脫發(fā)[1,2]。

經查閱各國藥典，非那雄胺被《中華人民共和國藥典：2020年版·二部》[3]、EuropeanPharmacopoeia(《歐洲藥典》)10.0版[4]、UnitedStatesPharmacopeia(《美國藥典》)2022年版[5]收載，均采用高效液相色譜(High Performance Liquid Chomatography,HPLC)法檢查有關物質。其中《歐洲藥典》10.0版該品種項下給出了雜質A、雜質B、雜質C的結構?！吨腥A人民共和國藥典:2020年版·二部》中雜質I即為《歐洲藥典》10.0版中的雜質A，在以下的敘述中該雜質均以雜質A表示。

文獻[6-9]采用高效液相色譜法分離非那雄胺雜質。近年來,液質聯(lián)用技術已日臻成熟,并被廣泛應用于藥物中雜質的結構鑒定及來源分析[10-14]。本研究擬采用高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(High Performance Liquid Chromatography- Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS)研究非那雄胺的雜質，并通過分析非那雄胺的裂解特征，與已知雜質對照品比對，通過強制降解試驗等途徑對其中的主要雜質進行結構推斷，推測雜質可能的來源，以期為藥品雜質控制和工藝優(yōu)化提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

Waters Xevo G2 Q-TOF液質聯(lián)用儀(美國Waters公司),MILLI-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司),XS205DU 電子天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司]。

非那雄胺對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100611-201503，含量99.7%)，雜質I (雜質A)(中國食品藥品檢定研究院，批號420023-201501)，雜質B(Toronto Research Chemicals Inc.，批號Y11M10W86170)，雜質C (Toronto Research Chemicals Inc.，批號Y11M10W86171)。

非那雄胺原料來源于國內兩個廠家，A廠家及B廠家各1批。乙腈為色譜純試劑，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.2 溶液的制備

混合對照品溶液：稱取非那雄胺對照品、雜質A、雜質B、雜質C對照品各約1 mg，置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

供試品溶液：稱取非那雄胺原料(A廠家或B廠家)約10 mg，置10 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。

1.3 強制降解試驗

取非那雄胺原料(A廠家)約50 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。

精密量取貯備液1 mL，置于5 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液1 mL，放置5 h，加入1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL中和，加50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得酸破壞溶液。

精密量取貯備液1 mL，置5 mL量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，放置2 h，加入1 mol/L 鹽酸溶液1 mL中和，加50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得堿破壞溶液。

精密量取貯備液1 mL，置5 mL量瓶中，加30%過氧化氫溶液1 mL，放置1 h，加入50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得氧化破壞溶液。

取非那雄胺原料(A廠家)適量，置120℃烘箱中加熱5 h，放冷，稱取約10 mg置10 mL量瓶中，加入50%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得高溫破壞溶液。

取非那雄胺原料(A廠家)適量，置4 500 lx光照條件下放置48 h，稱取約10 mg置10 mL量瓶中，加入50%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得強光破壞溶液。

1.4 色譜與質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：資生堂Capell-MGⅡ C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)；流動相為乙腈∶水(45∶55)，流速：1.0 mL·min-1；柱后分流，檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：2 μL。

1.4.2 質譜條件

離子化方式：ESI(+/-)；數(shù)據采集質荷比(m/z) 80-800；干燥氣溫度：350℃；脫溶劑氣(N2)流速：6.0 L·min-1；碰撞電壓：10-30 eV；毛細管電壓:4.5 kV。

2 結果與分析

2.1 非那雄胺高效液相色譜圖及雜質來源分析

將非那雄胺供試品溶液、強制降解溶液進樣后，主峰與各雜質峰分離良好。供試品溶液中主要有15個峰，按保留時間順序命名為雜質1-15 (圖1)。強制降解試驗結果表明，非那雄胺在氧化、光照、高溫條件下較穩(wěn)定，未產生明顯的降解產物；強酸破壞時雜質4含量明顯增大，雜質6和雜質8含量有小幅度增大；強堿破壞時雜質2增大；高溫破壞時雜質C含量有小幅度增大。因此雜質1，3，5，7，9，10，11，12，14，15為工藝雜質，雜質2，4，6，8和C可能是降解雜質，也可能是工藝雜質。通過分析雜質的來源，提示企業(yè)應優(yōu)化生產工藝，并在貯藏及運輸過程中控制溫度，減少非那雄胺降解反應的發(fā)生。

a:Mixed solution of reference substances;b:Finasteride (A manufacturer);c:Finasteride (B manufacturer);d:Acidic hydrolysis;e:Alkaline hydrolysis;f:Oxidative degradation;g:Photolytic degradation;h:Thermo degradation；number 1-15：Impurity 1-15圖1 對照品混合溶液、原料供試液及強制降解溶液高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference solution,raw test solution and forced degradation solution

2.2 非那雄胺主要雜質的結構鑒定

雜質結構與主藥往往具有相關性，通過分析非那雄胺二級質譜裂解規(guī)律并結合破壞試驗推測雜質1，2，5，6，8，10，13，14等8種雜質的結構，其中雜質10，13分別對應《歐洲藥典》10.0版的特定雜質A、C，其他7種雜質因含量過低或受其他因素干擾，未推斷出結構。為了確證所推斷的機理，對推斷的雜質均進行了高分辨數(shù)據分析(表1) 。

表1 雜質準分子離子理論值與實驗值的偏差計算Table 1 Deviation calculation of theoretical values and experimental values of the impurities in MS2

2.2.1 非那雄胺

非那雄胺準分子離子m/z為373.286 4，其二級質譜碎片中主要的碎片峰為側鏈斷裂后,脫掉分子量為56的叔丁基形成m/z為317.223 4的碎片離子，其側鏈還可繼續(xù)斷裂生成m/z分別為299.214 9，282.186 6，272.204 3的碎片離子，母核結構中的氮雜環(huán)開環(huán)后脫去質量數(shù)為68的C4H4O后可形成m/z為305.259 9的碎片離子，該碎片離子進一步脫去側鏈的基團后可生成m/z分別為187.148 6，215.142 0的碎片離子，但豐度均較少，其二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖2。

圖2 非那雄胺[M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.2 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and fragmentation pathway of finasteride

2.2.2 雜質13

在HPLC-UV-Q-TOF-MS中，雜質13的液相保留時間、紫外光譜圖、準分子離子(m/z為371.269 1)及二級質譜均與雜質C對照品一致，因此確證雜質13為雜質C。

雜質C為非那雄胺合成過程的中間產物。雜質C的裂解方式與非那雄胺類似，側鏈斷裂后可形成m/z分別為315.206 3，298.184 5，270.185 3，280.169 6的碎片離子，母核結構中的氮雜環(huán)開環(huán)后脫去C4H4O后可形成m/z為303.247 3的碎片離子。母核結構中的C5與C6為雙鍵，易脫去C上的甲基，形成具有共軛雙鍵的碎片結構，該碎片離子的m/z為355.236 9。雜質C二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖3。

圖3 雜質13 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.3 Impurity 13 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.3 雜質10

雜質10的液相保留時間、紫外光譜圖均與《歐洲藥典》10.0版收載的雜質A對照品一致。在HPLC-UV-Q-TOF-MS中該雜質的準分子離子(m/z為375.301 7)及其二級質譜中各子離子的質荷比、豐度也與雜質A對照品基本一致，因此確認雜質10為雜質A。

雜質A的裂解方式與非那雄胺類似，側鏈斷裂后形成的碎片離子以及母核結構中的氮雜環(huán)開環(huán)后形成碎片離子。雜質A二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖4。

圖4 雜質10 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.4 Impurity 10 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.4 雜質1

雜質1在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為389.282 1，較非那雄胺的準分子離子質荷比約多16，推測為多一個氧原子，其二級譜圖中出現(xiàn)了較母離子少72的碎片離子，推測非那雄胺結構中的叔丁基氧化為叔丁醇。雜質1的裂解方式與非那雄胺類似，二級圖譜中有側鏈斷裂后形成的碎片離子以及母核結構中的氮雜環(huán)開環(huán)后形成碎片離子，此處不再贅述。雜質1二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖5。

圖5 雜質1 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.5 Impurity 1 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.5 雜質2

雜質2在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為391.297 2，與非那雄胺的m/z相差約18，且其二級質譜出現(xiàn)M+H-56的碎片峰，推測該雜質為非那雄胺的氮雜環(huán)水解開環(huán)后生成的雜質。其二級質譜出現(xiàn)m/z為373.288 2的碎片為羧酸與氨基重新環(huán)合生成的。雜質2二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖6。

圖6 雜質2 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.6 Impurity 2 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.6 雜質3

雜質3在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為387.264 4，與非那雄胺的m/z相差約14，推測可能的分子式為C23H34N2O3，其二級質譜出現(xiàn)M+H-54、M+H-68的碎片峰，未出現(xiàn)M+H-56的碎片峰，因此推測雜質3具有與非那雄胺相同的氮雜環(huán)，而側鏈部分結構發(fā)生改變。另外，雜質3二級質譜中的碎片離子與非那雄胺均不一致，推測其母環(huán)結構與非那雄胺不同，根據現(xiàn)有的信息無法推測碎片離子的組成，因此未能推斷其結構。

2.2.7 雜質4

雜質4在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為389.278 8，與非那雄胺的m/z相差約16，推測可能的分子式為C23H36N2O3，其二級質譜出現(xiàn)M+H-56的碎片峰，未出現(xiàn)M+H-68的碎片峰，因此推測雜質4母核結構與非那雄胺不一致。根據現(xiàn)有的信息無法推測碎片離子的組成，因此未能推斷其結構。

2.2.8 雜質5

雜質5在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為387.264 4，與非那雄胺的m/z相差約14，其二級質譜出現(xiàn)M+H-56、M+H-68碎片峰，未出現(xiàn)M+H-73的碎片峰，而出現(xiàn)了M+H-87，因此雜質5側鏈上的叔丁基結構未變，而N上多一個甲基。雜質5二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖7。

圖7 雜質5 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.7 Impurity 5 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.9 雜質6

雜質6在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為391.297 9，與非那雄胺的m/z相差約18。雜質6二級質譜出現(xiàn)M+H-56、M+H-73碎片峰，未出現(xiàn)M+H-68的碎片峰，因此推測雜質6為非那雄胺母核氮雜環(huán)發(fā)生了變化。雜質6二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖8。

圖8 雜質6 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.8 Impurity 6 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.10 雜質8

雜質8在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為389.280 5，與非那雄胺的m/z相差約16。雜質8二級質譜出現(xiàn)M+H-56、M+H-68碎片峰，而其他碎片離子均與非那雄胺不一致，由于N原子可能會被氧化，因此推測雜質8為非那雄胺母核氮雜環(huán)形成了氮氧化物。雜質8二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖9。

圖9 雜質8 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.9 Impurity 8 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.11 雜質9

雜質9在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為389.279 2，與非那雄胺的m/z相差約16。雜質6二級質譜出現(xiàn)M+H-56的碎片峰，未出現(xiàn)M+H-68的碎片峰，因此推測雜質9為非那雄胺母核氮雜環(huán)發(fā)生了變化，可能為雙鍵氧化成酮基。雜質9二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖10。

圖10 雜質9 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.10 Impurity 9 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.12 雜質11

雜質11在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為371.270 0，與非那雄胺雜質C的分子量一致。雜質11的二級質譜與雜質C部分一致，都出現(xiàn)m/z分別為298，280，270的碎片峰，因此推測雜質11為非那雄胺母核碳碳雙鍵位置不同，已有信息無法判斷雙鍵的位置，因此未能推斷其結構。

2.2.13 雜質14

雜質14在HPLC-UV-Q-TOF-MS中的準分子離子m/z為387.301 5，與非那雄胺的m/z相差約14。雜質6二級質譜出現(xiàn)M+H-68、M+H-70的碎片峰，未出現(xiàn)M+H-56的碎片峰，因此推測雜質14為非那雄胺側鏈N原子被2-甲基丁基取代。雜質14二級掃描質譜圖及裂解途徑見圖11。

圖11 雜質14 [M+H]+二級掃描質譜圖及裂解途徑Fig.11 Impurity 14 [M+H]+ secondary scanning mass spectrum and its fragmentation pathway

2.2.14 其他雜質

雜質7，12和15由于峰響應較低，未能推斷其結構。

3 結論

本文采用HPLC-TOF-MS對兩家非那雄胺原料生產企業(yè)的產品進行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩家生產的非那雄胺其雜質的種類及含量存在一定差異；鑒定出8種雜質的結構，并推測了部分雜質的來源，可為非那雄胺雜質控制和工藝優(yōu)化提供參考依據。