百里香酚納米復(fù)合誘導(dǎo)大豆蛋白自組裝凝膠及機(jī)制

陳飛平，戴凡煒，陳于隴，葉明強(qiáng)，王玲，戚英偉，羅政，吳繼軍

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510610）

百里香酚（Thymol，C10H14O）已被歐盟（EU）和美國食品藥品管理局（FDA）列入食品添加劑GRAS（一般公認(rèn)安全）名單，也是我國允許使用的食品添加劑。它是一種疏水性酚類物質(zhì)，可導(dǎo)致病原菌細(xì)胞膜損傷，產(chǎn)生抑菌作用[1]，且抑菌活性優(yōu)于香芹酚、丁香酚等其他植物精油[2]。然而，疏水特性使它難以在食品體系中均勻分散，當(dāng)使用濃度高于溶解度（0.074%[3]）時(shí)，百里香酚會導(dǎo)致溶液渾濁、沉淀而損害食品的外觀品質(zhì)，并且其強(qiáng)烈的芳香氣味也會對食品香氣產(chǎn)生負(fù)影響。事實(shí)上，在牛奶、胡蘿卜汁等食品中百里香酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)往往高于0.1%才能對食物源致病菌產(chǎn)生有效的抑制作用[4,5]，因此百里香酚的溶解性差問題是其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用亟待解決的問題。

蛋白質(zhì)是天然高分子，以蛋白質(zhì)作為基料構(gòu)建活性物質(zhì)輸送載體是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，主要形式包括乳液、膠囊、分子復(fù)合物、凝膠、核心-外殼顆粒、膠束等，其中凝膠基輸送載體是蛋白分子經(jīng)物理或化學(xué)交聯(lián)后形成的三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，是生物活性物質(zhì)包埋緩釋的良好輸送載體[6,7]。大豆蛋白是豆油加工的副產(chǎn)物，具有降膽固醇等功效，在結(jié)構(gòu)上含有極性和非極性基團(tuán)并且氨基酸組成合理，具有優(yōu)越的與小分子活性物質(zhì)結(jié)合的能力，是近年來活性物質(zhì)輸送載體的研究熱點(diǎn)[8,9]。大豆蛋白凝膠的形成往往需要熱變性及交聯(lián)劑或凝固劑的輔助[10]，基于小分子活性物質(zhì)復(fù)合直接誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠的研究還鮮見報(bào)道。前期研究發(fā)現(xiàn)，在pH 偏移處理?xiàng)l件下，百里香酚復(fù)合在非熱條件下可促進(jìn)大豆蛋白形成凝膠結(jié)構(gòu)，但兩者共組裝凝膠的調(diào)控手段及機(jī)制仍不明確。

pH 偏移處理已被證明是一種有效的蛋白質(zhì)功能修飾方法，該處理可提高蛋白質(zhì)的凝膠特性及其對多酚的結(jié)合能力[11,12]。另外，在pH 偏移處理?xiàng)l件下，多酚復(fù)合可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)成膠。例如，添加茶多酚可促進(jìn)堿誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，促進(jìn)蛋清蛋白鈣離子交聯(lián)凝膠[13]和熱致凝膠的形成[14]；添加沒食子酸或蘆丁可改善明膠水凝膠的理化特性[15]。但這些研究主要針對動物蛋白，而對pH 偏移處理協(xié)同疏水性多酚復(fù)合誘導(dǎo)植物蛋白凝膠的研究還較少。Guo 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，親水性多酚單寧酸通過共價(jià)結(jié)合可誘導(dǎo)大豆蛋白在堿性條件下形成凝膠。

前期研究發(fā)現(xiàn)，百里香酚與大豆蛋白形成納米復(fù)合物后，其抑菌活性提高[17]，而且對百香果具有防腐保鮮作用[18]。鑒于此我們推斷由百里香酚復(fù)合誘導(dǎo)的大豆蛋白凝膠具有抑菌功能活性，可作為基料應(yīng)用于功能性食品生產(chǎn)中。因此，本文的研究目的是探索百里香酚納米復(fù)合誘導(dǎo)大豆蛋白自組裝凝膠的途徑及其機(jī)制，同時(shí)探索百里香酚在食品工業(yè)中應(yīng)用能否同時(shí)發(fā)揮抑菌劑和膠凝劑雙重功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

百里香酚（純度＞98%，分析純），上海阿拉丁公司；大豆分離蛋白（干基蛋白含量為91.5%），實(shí)驗(yàn)室自制；硫黃素T（ThT）、尿素（分析純），美國Sigma公司；DL-二硫蘇糖醇（DTT，分析純），江蘇綠葉生物有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

UV-1900i 紫外分光光度計(jì)，日本SHIMADZU 公司；Nano ZS90 納米粒度分析儀，英國Malver 公司；5810R 高速離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；Millrock 冷凍干燥機(jī)，德國Millrock 公司；Cary Eclipse 熒光光譜儀，美國Varian 公司；TH2-82A 數(shù)顯恒溫震蕩儀，常州澳華儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物制備

稱取一定量的大豆分離蛋白粉末溶解于去離子水中，配置成質(zhì)量濃度為50～100 mg/mL 的大豆蛋白溶液，磁力攪拌2 h 后，置于4 ℃冰箱中水化過夜，之后取出恢復(fù)至室溫后，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至9.0～12.0，加入質(zhì)量為0.033～0.40 g/g 蛋白的百里香酚晶體，在40 ℃條件下磁力攪拌3 h，并用1 mol/L NaOH 溶液維持體系pH 值為初始值，5 000 r/min 離心10 min，取上清即為大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物溶液。

1.3.2 大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠制備

大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物冷致凝膠的制備參考Zhang 等[19]的方法，并有所調(diào)整。大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物溶液制備之后，使用1 mol/L HCl 溶液將其pH 調(diào)節(jié)至中性，之后放置于4 ℃、18 h 使之形成凝膠。

1.3.2.1 蛋白濃度的影響

在固定百里香酚添加量0.04 g/g 蛋白、初始pH 值11.0、終止pH 值7.0 條件下，研究不同蛋白濃度（50、75 和100 mg/mL）對大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠的影響。

1.3.2.2 百里香酚添加量的影響

在固定蛋白濃度75 mg/mL、初始pH 值11.0、終止pH 值7.0 條件下，研究不同百里香酚添加量（0.033、0.067、0.08、0.10、0.133、0.20 和0.40 g/g 蛋白）對大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠的影響。

1.3.2.3 反應(yīng)初始pH 值的影響

在固定蛋白濃度75 mg/mL、百里香酚添加量為0.133 g/g 蛋白、終止pH 值7.0 條件下，研究了反應(yīng)初始pH 值（9.0、10.0、11.0 和12.0）對大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠的影響。

1.3.2.4 反應(yīng)終止pH 值的影響

在固定蛋白濃度75 mg/mL、百里香酚添加量為0.133 g/g 蛋白、初始pH 值11.0 條件下，研究了不同終止pH 值（6.0、7.0 和8.0）對大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠的影響。

1.3.3 復(fù)合物表征

1.3.3.1 荷載效率

將制備的納米復(fù)合物溶液用去離子水稀釋100 倍后，取1 mL 加入4 mL 乙酸乙酯中，渦旋混勻萃取，室內(nèi)避光放置30 min 分層后，取上清液測定276 nm 處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算百里香酚的濃度，然后按照以下公式計(jì)算荷載率（Encapsulation Efficiency，EE，%）和荷載量（Load Amount，LA，mg/mg 蛋白）。

式中：

m1——復(fù)合物中百里香酚含量，mg；

mt——總加入百里香酚含量，mg；

mp——總大豆蛋白質(zhì)量，mg。

1.3.3.2 顆粒分布和平均粒徑

大豆蛋白溶液及復(fù)合物溶液中顆粒的分布和平均粒徑測定采用動態(tài)光散射（DLS）技術(shù)，溶液樣品用經(jīng)0.22 μm 膜過濾的、與樣品pH 相同的磷酸鹽緩沖液（PBS、10 mmol/L）稀釋至蛋白質(zhì)濃度為0.5 mg/mL，之后用Malvern Nano ZS 儀器分析，設(shè)備參數(shù)為：激光器He-Ne（633 nm）、散射角173 °、測試溫度25 ℃。

1.3.4 復(fù)合物自組裝凝膠機(jī)制

1.3.4.1 濁度分析

復(fù)合物溶液濁度（τ）分析采用分光光度法，參考陳楠楠的方法，并有所調(diào)整[20]。復(fù)合物溶液用pH 值相同的磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L）稀釋至3 mg/mL 后，取3.0 mL 的樣品溶液置于寬度為1 cm 的比色皿中。樣品池溫度使用恒溫儀控制在（20±0.2）℃。用分光光度計(jì)測量在500 nm，溶液的濁度隨時(shí)間的變化。用以下公式計(jì)算：

式中：

A——500 nm 處的吸光度（×稀釋倍數(shù)）；

L——光程長度（1 cm）。

1.3.4.2 Th T 熒光

蛋白質(zhì)淀粉樣纖維化采用Th T 熒光法分析，參考Koscielska 等[21]的方法。取8 mg Th T 溶于10 mL 磷酸緩沖液（10 mmol/L、pH 值7.0）中制得Th T 濃縮液，待其充分溶解后用0.22 μm 濾膜去除不溶性顆粒。Th T儲液用金屬箔密封避光保存，置于4 ℃的冰箱中保存。每次使用前用上述磷酸緩沖液將濃縮液以1:50 比例稀釋后制得Th T 工作液。取50 μL 待測樣品（預(yù)先稀釋至蛋白濃度10 mg/mL）加入5 mL Th T 工作液，震蕩混勻至少1 min 以保證測量結(jié)果準(zhǔn)確性。使用熒光分光光譜儀進(jìn)行Th T 熒光測量。儀器參數(shù)設(shè)置如下：激發(fā)波長和發(fā)射波長分別是460 nm 和490 nm，激發(fā)波長的狹縫間隙10 nm，發(fā)射波長的狹縫間隙5 nm，掃描速率240 nm/min，掃描波長范圍為470～600 nm，電壓700 V。實(shí)驗(yàn)中記錄在488 nm 左右出現(xiàn)最大吸收峰的高度值（Height）。

1.3.4.3 凝膠作用力分析

凝膠網(wǎng)絡(luò)形成的分子間作用力通過分析凝膠在不同溶劑中的濁度來確定，參考Tang 等[22]以及Zhao 等[23]的方法，并有所調(diào)整。取0.2 g 凝膠樣品加入3 mL 變性劑中，磁力攪拌1 h 后，1 000 r/min 離心15 min，上清液測定500 nm 下的吸光值，之后根據(jù)1.3.3.1 計(jì)算濁度。濁度降低，表明該變性劑代表的作用力較強(qiáng)。選用的變性劑為：6 mol/L 尿素-10 mmol/L 磷酸緩沖液（分析氫鍵作用力和疏水相互作用力）、10 mmol/L DTT-10 mmol/L 磷酸緩沖液（分析二硫鍵作用力）、0.6 mol/L NaCl-10 mmol/L 磷酸緩沖液（分析靜電作用力），對照為10 mmol/L 磷酸緩沖液（PBS），所選用的緩沖液pH 值與樣品的pH 值保持一致。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Excel 2010 處理數(shù)據(jù)和Origin軟件作圖，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同蛋白濃度的影響

蛋白濃度是影響蛋白質(zhì)凝膠的重要因素，通常認(rèn)為大豆蛋白凝膠所需的蛋白質(zhì)量濃度為10%（m/V）[24]以上。如表1 所示，在百里香酚添加量較低情況下，大豆蛋白能將其完全荷載，荷載率均達(dá)到100%左右，荷載量為0.04 mg/mg 蛋白左右。與前人的研究相符，在低百里香酚結(jié)合條件下，大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠的臨界蛋白質(zhì)量濃度為10%（100 mg/mL）[24]，該質(zhì)量濃度明顯低于單寧酸誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠所需蛋白質(zhì)量濃度（12%）[16]，表明百里香酚是一種較好的大豆蛋白膠凝劑。

表1 蛋白質(zhì)量濃度對大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物的荷載效果及形態(tài)的影響Table 1 Effects of protein concentration on the loading efficiency and appearance of soy protein-thymol nanocomplexes

2.2 不同百里香酚添加量的影響

大豆蛋白構(gòu)象中含有疏水位點(diǎn)和疏水區(qū)域，主要通過疏水相互作用結(jié)合生物活性物質(zhì)，如百里香酚、姜黃素等，在一定的構(gòu)象條件下，隨著活性物質(zhì)增加，大豆蛋白的結(jié)合位點(diǎn)會趨于飽和[17,25,26]。如表2 所示，隨著百里香酚添加量增加，大豆蛋白對百里香酚的荷載量增加，在百里香酚添加量不超過0.20 g/g 蛋白時(shí)，大豆蛋白的荷載率達(dá)到100%（表2），當(dāng)添加量繼續(xù)增加時(shí)，荷載率降低，說明此時(shí)大豆蛋白的結(jié)合位點(diǎn)已經(jīng)飽和，大豆蛋白對百里香酚的最高荷載量達(dá)到0.33 mg/mg（33%）。將復(fù)合物溶液置于4 ℃條件下18 h，發(fā)現(xiàn)百里香酚添加量大于0.08 g/g 蛋白時(shí)，復(fù)合物開始凝膠化，從溶膠逐漸形成凝膠，但添加量大于0.20 g/g 蛋白之后，復(fù)合物不能形成凝膠，說明在蛋白濃度75 mg/mL、反應(yīng)初始pH 值11.0、反應(yīng)終止pH 值為7.0 條件下，大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠的臨界百里香酚濃度為0.08 g/g 蛋白，在0.08～0.20 g/g 蛋白添加量范圍內(nèi)，百里香酚濃度增加有利于大豆蛋白的膠凝特性，這結(jié)果與單寧酸誘導(dǎo)大豆蛋白自組裝凝膠類似，隨著單寧酸濃度增加，所形成大豆蛋白凝膠的硬度增加[16]。但百里香酚荷載量過高可能會誘導(dǎo)蛋白分子間相互作用，產(chǎn)生聚集體，從而影響凝膠的形成。

表2 百里香酚添加量對大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物的荷載效果及形態(tài)的影響Table 2 Effects of thymol adding amount on the loading efficiency and appearance of soy protein-thymol nanocomplexes

另外，很有趣的是，當(dāng)復(fù)合物中百里香酚荷載量增加時(shí)，大豆蛋白冷致凝膠所需的蛋白濃度降低（75 mg/mL），表明百里香酚復(fù)合具有促進(jìn)大豆蛋白自組裝凝膠作用。該結(jié)果與Zhong 等[27]的研究報(bào)道相符，該研究發(fā)現(xiàn)高濃度葛根素結(jié)合會促進(jìn)乳清蛋白熱致凝膠的形成，隨著葛根素添加量增加，乳清蛋白凝膠的強(qiáng)度提高。

2.3 不同反應(yīng)初始pH 值的影響

pH 值偏移處理是一種可改善蛋白質(zhì)的功能特性的技術(shù)[28]，已被證實(shí)可提高大豆蛋白熱致凝膠性能[11]?？紤]到百里香酚在堿性條件下溶解性較好，本研究選擇遠(yuǎn)高于等電點(diǎn)的pH 值環(huán)境處理大豆蛋白。如表3 所示，隨著pH 值增加，大豆蛋白對百里香酚的荷載量提高，表明pH 值偏移處理可提高大豆蛋白對百里香酚的結(jié)合能力。該結(jié)果與前人研究結(jié)果相符[12,29]，可能與pH 值偏移處理誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)解離和重組裝有關(guān)[30]。然而當(dāng)體系pH 值達(dá)到12.0 時(shí)，荷載量反而下降（表3），可能是因?yàn)樵跇O端pH 值條件下，大豆蛋白結(jié)構(gòu)展開，構(gòu)象和表面特性發(fā)生嚴(yán)重變化，不利于百里香酚的結(jié)合。在四種pH 值條件下制備的大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物均能凝膠化，且隨著pH 值提高，復(fù)合物溶液從溶膠逐漸轉(zhuǎn)變成凝膠，且凝膠的形變逐漸減少（圖1）。pH 值大于10.5 可誘導(dǎo)蛋清蛋白溶液形成凝膠[13]，而本文大豆蛋白在pH 值大于9 即可自組裝形成冷致凝膠，表明百里香酚復(fù)合對pH 值偏移處理誘導(dǎo)大豆蛋白自組裝凝膠有促進(jìn)作用?？紤]到pH 值12.0 時(shí)大豆蛋白嚴(yán)重變性產(chǎn)生異味，故選擇pH 值11.0 作為最適宜的反應(yīng)初始pH 值。

表3 反應(yīng)初始pH 對大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物的荷載效果及形態(tài)的影響Table 3 Effects of initial reaction pH on the loading efficiency and appearance of soy protein-thymol nanocomplexes

2.4 不同反應(yīng)終止pH 值的影響

蛋白質(zhì)凝膠是分子間相互作用形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的結(jié)果，在堿性條件下，由于蛋白質(zhì)的羧基（COOH）去質(zhì)子化成COO-，產(chǎn)生高度負(fù)電荷結(jié)構(gòu)，分子間靜電排斥力大，不利于凝膠的形成，因此在反應(yīng)結(jié)束后需要調(diào)低體系的pH。如圖1 所示，最終體系為弱酸性或弱堿性均不利于大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠的形成，在pH 值為7.0 和8.0 時(shí)，復(fù)合物能自組裝成凝膠和溶膠，在pH 值為6.0 時(shí)，復(fù)合物保持溶液狀態(tài)，甚至在貯藏半個(gè)月之后有分層現(xiàn)象。

圖1 反應(yīng)初始pH 值（左）和終止pH 值（右）對大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠的影響Fig.1 Effects of initial reaction pH and reaction ending pH on the self-assembly gelation of soy protein-thymol nanocomplexes

2.5 大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠機(jī)制

以不同反應(yīng)終止pH 制備的復(fù)合物為對象研究大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠機(jī)制。從外觀分析可知，在pH 值8.0～6.0 條件下，沒有百里香酚的純蛋白溶液均保持溶液狀態(tài)，而復(fù)合百里香酚后，pH值8.0 和7.0 體系的蛋白能形成溶膠和凝膠（表4）。

表4 不同終止pH 值條件下制備的大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物的形態(tài)、濁度和Th T 熒光強(qiáng)度Table 4 Effects of reaction ending pH on the appearance,turbidity and Th T fluorescence intensity of soy protein-thymol nanocomplexes

從溶液粒徑分布和平均粒徑分析可知，隨著pH 值降低，大豆蛋白的平均粒徑增加，顆粒的粒徑逐漸趨勢大顆粒范圍分布（表4、圖2）。在沒有百里香酚存在的純蛋白體系中，在pH 值8.0～6.0 環(huán)境下，蛋白分子主要以納米顆粒形式存在，pH 值降低會誘導(dǎo)部分蛋白分子發(fā)生局部聚集，形成較大的聚集體。在大豆蛋白-百里香酚復(fù)合物體系中，百里香酚的結(jié)合會進(jìn)一步誘導(dǎo)蛋白分子聚集，平均粒徑增加16.21%～268.94%，并且在pH 值6.0 條件下，絕大部分復(fù)合物以微米級別大小顆粒存在。很有趣的是，在沒有百里香酚的體系，蛋白適度聚集并不能誘導(dǎo)自組裝凝膠的發(fā)生，但在百里香酚存在的體系，pH 值和百里香酚協(xié)同誘導(dǎo)大豆蛋白聚集化，并且適度聚集可進(jìn)一步誘導(dǎo)自組裝凝膠的發(fā)生，過低或過度聚集都會破壞復(fù)合物的自組裝凝膠特性。在pH 值7.0 條件下制備的復(fù)合物以粒徑小于1 000 nm 的顆粒存在，因此由大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝制備的凝膠為納米凝膠。

圖2 不同反應(yīng)終止pH 值條件下制備的大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物溶液的粒徑分布圖Fig.2 Typical particle size distribution profiles of soy protein-thymol nanocomplexes prepared with different reaction ending pH

球蛋白自組裝纖維化的顯著特點(diǎn)之一就是形成了具有β-折疊結(jié)構(gòu)的淀粉樣纖維，硫黃素T（Th T）是一種陽離子苯并噻唑染料，能與淀粉樣纖維結(jié)合后使熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)[31]，因此可通過Th T 熒光強(qiáng)度的變化來表征大豆蛋白自組裝纖維化情況。從圖3 可知在弱酸性和弱堿性條件下，大豆蛋白（7.5%，m/m）能夠自組裝纖維化，形成一定程度的纖維結(jié)構(gòu)。通常認(rèn)為大豆蛋白纖維化是蛋白先水解成多肽，之后多肽自組裝成有序的纖維結(jié)構(gòu)的過程，一般在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值、加熱及低濃度蛋白條件下進(jìn)行，水解反應(yīng)是蛋白纖維化的主要限速條件，而高濃度蛋白（7.5%～8.0%，m/m）可增加初始蛋白的聚集速率[32]。這可能就是本研究大豆蛋白在弱酸和弱堿條件下纖維化的原因，大豆蛋白適度水解后自組裝形成“蠕蟲狀”的聚集體。在中性條件下，蛋白自身纖維化程度最低，但百里香酚結(jié)合可促進(jìn)大豆蛋白纖維化，Th T 的熒光強(qiáng)度提高93.78%，且纖維化程度與pH 值6.0 弱酸誘導(dǎo)大豆蛋白纖維化程度相當(dāng)。另外，在弱酸和弱堿條件下，百里香酚結(jié)合對大豆蛋白纖維化的促進(jìn)作用不明顯。結(jié)合大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠化結(jié)果（圖1），可推斷百里香酚結(jié)合誘導(dǎo)的大豆蛋白纖維性能可能與酸誘導(dǎo)的大豆蛋白纖維性能不同。Xu 等[33]報(bào)道，沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）復(fù)合可裂解大豆蛋白纖維的剛性結(jié)構(gòu)，形成柔韌性的纖維，從而誘導(dǎo)大豆蛋白纖維自組裝成凝膠結(jié)構(gòu)。

圖3 不同反應(yīng)終止pH 值條件下制備的大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物溶液的Th T 熒光強(qiáng)度Fig.3 Th T fluorescence intensity of soy protein-thymol nanocomplexes prepared with different reaction ending pH

動態(tài)光散射度檢測蛋白質(zhì)溶液中的微小聚集顆粒十分靈敏，一旦溶液中出現(xiàn)大于單體分子的顆粒，掃描光波就會發(fā)生很大的變化，因此可使用動態(tài)光散射測量溶液中的光散射強(qiáng)度的變化來表征蛋白自組裝纖維化過程[34]。從圖4 可知，大豆蛋白在弱酸性條件下光散射強(qiáng)度明顯高于中性和弱堿性，說明其酸性條件可誘導(dǎo)大豆蛋白自組裝纖維，在中性和堿性條件下，大豆蛋白自組裝纖維能力較弱。然而，在中性條件下，百里香酚結(jié)合能顯著增加大豆蛋白的光散射強(qiáng)度（154.67%），表明百里香酚結(jié)合可誘導(dǎo)大豆蛋白自組裝纖維。

圖4 不同反應(yīng)終止pH 值條件下制備的大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物溶液的光散射強(qiáng)度Fig.4 Light scattering intensity of soy protein-thymol nanocomplexes prepared with different reaction ending pH

綜上所述，百里香酚結(jié)合可誘導(dǎo)大豆蛋白纖維化聚集，繼而誘導(dǎo)凝膠的形成，但復(fù)合物的纖維化程度要保持在適度范圍，過高或過低都不利于大豆蛋白自組裝凝膠的發(fā)生。

2.6 大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠網(wǎng)絡(luò)分子間作用力分析

典型的蛋白質(zhì)凝膠是由非共價(jià)和共價(jià)作用力穩(wěn)定的。Tang 等[22]認(rèn)為可通過不同化學(xué)變性劑對相互作用力的破壞來推斷凝膠形成的分子間作用力。Jiang 等[35]認(rèn)為在蛋白質(zhì)凝膠中添加一定化學(xué)變性劑，可以溶解凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的結(jié)合蛋白，因此可通過蛋白質(zhì)溶解性的改變來推斷凝膠網(wǎng)絡(luò)的分子作用力。

尿素是一種中性變性劑，可以弱化疏水相互作用和抑制氫鍵作用。如圖5 所示，所有大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠在尿素中的濁度均顯著低于對照，表明尿素處理增加了凝膠中大豆蛋白的溶解性，因此氫鍵作用和疏水相互作用是大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的主要作用力。這與Gulseren 等[36]的研究結(jié)果相符，該研究表明盡管大豆蛋白功能的影響因素眾多，氫鍵和疏水相互作用在強(qiáng)化其凝膠特性中發(fā)揮重要作用，從而使大豆蛋白凝膠結(jié)構(gòu)致密性增加。

DTT 也是一種變性劑，可通過還原蛋白質(zhì)的二硫鍵從而阻止半胱氨酸殘基之間相互作用形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。如圖5 所示，大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠在DTT 溶液中的溶解度高于對照，但顯著低于尿素溶液。DTT 可以破壞二硫鍵從而使原本連接這些共價(jià)鍵的蛋白溶解，因此可推斷二硫鍵對于大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠網(wǎng)絡(luò)形成發(fā)揮一定的作用，但貢獻(xiàn)率低于氫鍵和疏水相互作用。該結(jié)果與大豆蛋白熱致凝膠不一致，Zhao 等[23]報(bào)道形成大豆蛋白熱致凝膠網(wǎng)絡(luò)的分子作用力主要為二硫鍵、氫鍵和疏水相互作用，表明百里香酚結(jié)合誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠機(jī)制與熱變性誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠機(jī)制不同，百里香酚結(jié)合后會阻止蛋白分子間二硫鍵的形成，但會通過自身分子間形成氫鍵或促進(jìn)蛋白分子間氫鍵的形成。

盡管KCl 不是一種變性劑，但通常被用于研究凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的靜電相互作用。如圖5 所示，所有大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠在KCl 溶液中的溶解度顯著低于對照，表明靜電相互作用并不是大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠網(wǎng)絡(luò)形成的主要作用力。

圖5 不同反應(yīng)體系pH 值條件下制備的大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠的分子間相互作用力分析Fig.5 Intermolecular interaction forces of soy protein-thymol nanocomplexes hydrogels prepared with different reaction pH

從上述分析，可推斷大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成主要依賴氫鍵和疏水相互作用力，其次是二硫鍵作用力，靜電相互作用力不參與該過程。

考慮到在堿性條件下，蛋白三級結(jié)構(gòu)展開，疏水位點(diǎn)暴露[11]，百里香酚質(zhì)子化在水中溶解性提高[37]，百里香酚分子結(jié)合到蛋白疏水位點(diǎn)，較高荷載的百里香酚分子間相互作用形成橋聯(lián)，促進(jìn)蛋白分子間纖維化聚集，形成適度尺度的聚集體[26]。結(jié)合以上分析，可推斷大豆蛋白-百里香酚納米復(fù)合物自組裝凝膠的機(jī)制為：在堿性條件下，百里香酚分子結(jié)合到大豆蛋白疏水區(qū)域，之后體系pH 值調(diào)節(jié)至中性，蛋白結(jié)構(gòu)重疊，蛋白分子間、百里香酚分子間相互作用增加，誘導(dǎo)纖維化聚集體發(fā)生，聚集體之間通過氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵等作用力形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出凝膠狀態(tài)。

3 結(jié)論

本研究分析了蛋白濃度、百里香酚添加量、反應(yīng)初始pH 值和反應(yīng)終止pH 值對大豆蛋白與百里香酚相互作用及其自組裝凝膠的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四者協(xié)同影響復(fù)合物自組裝凝膠進(jìn)程，一個(gè)較佳的條件是：蛋白濃度75 mg/mL、百里香酚添加量為0.133 g/g 蛋白、反應(yīng)體系初始和終止pH 值分別為11.0 和7.0。高載量的百里香酚復(fù)合可誘導(dǎo)大豆蛋白產(chǎn)生適度的纖維化聚集，聚集體之間通過氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵等作用力形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，百里香酚可作為抑菌劑和膠凝劑在食品工業(yè)中應(yīng)用，發(fā)揮雙重作用，所構(gòu)筑的大豆蛋白冷致凝膠可作為生物活性物質(zhì)遞送載體，應(yīng)用于功能食品開發(fā)中。