雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理對蘆葦酶解效果的影響

徐 佳，張智強，王穎賽，李 園，馮昆鵬，周生飛

(雄安創(chuàng)新研究院，河北雄安新區(qū) 071700)

蘆葦是一種多年生草本植物，廣泛分布在湖泊和濕地等非耕地環(huán)境中，生長速度快，廉價易得。特別是作為中國四大蘆葦產(chǎn)地之一的河北省白洋淀地區(qū)，蘆葦分布面積約6 000 hm2[1]，伴隨社會發(fā)展其逐漸失去了原有的經(jīng)濟價值，開發(fā)一種蘆葦資源化利用的新模式具有重要意義。蘆葦秸稈含有大量的纖維素和半纖維素，但其復(fù)雜的交聯(lián)結(jié)構(gòu)限制了酶解轉(zhuǎn)化效率。預(yù)處理用于打破蘆葦纖維的結(jié)構(gòu)屏障，增大孔隙率和去除木質(zhì)素，使纖維更容易轉(zhuǎn)化為單糖。盡管人們已經(jīng)對蘆葦?shù)念A(yù)處理方法進行了相關(guān)研究，包括酸、堿、水熱、有機溶劑等，但這些方法酶解得率較低[2-4]，且存在一些缺點，例如：水熱處理中的高需水量和能耗，酸處理中對設(shè)備的高要求，溶劑法所用試劑的昂貴等，使其在工業(yè)化應(yīng)用中受到限制。

雙螺桿擠壓是一種連續(xù)的預(yù)處理過程，具有反應(yīng)條件溫和、混合能力強、剪切力高和成本低等特點，近些年人們采用該方法進行了小麥秸稈[5]、玉米秸稈[6]、水稻秸稈[7]和甘蔗渣[8]等不同生物質(zhì)制備可發(fā)酵糖的應(yīng)用研究。采用雙螺桿擠壓可以破裂木質(zhì)纖維素的頑固結(jié)構(gòu)，增加水解時的反應(yīng)面積，提高酶解效率[9]。目前，其在蘆葦預(yù)處理技術(shù)中的應(yīng)用案例尚未見報道。

本研究對蘆葦進行了雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理的相關(guān)實驗驗證，考察雙螺桿螺紋元件、螺桿轉(zhuǎn)速、堿用量、處理溫度和保溫時間對蘆葦酶解效果的影響，對比不同預(yù)處理前后蘆葦纖維結(jié)構(gòu)和化學組成的變化，并通過對預(yù)處理后蘆葦?shù)哪媪飨礈旃に噧?yōu)化，建立一種低能耗、水耗和酶用量的蘆葦預(yù)處理工藝方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

蘆葦，取自河北省雄安新區(qū)白洋淀，除去灰塵和雜質(zhì)并晾干后將其切割至5 cm左右碎段；氫氧化鉀、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、檸檬酸、檸檬酸鈉等，均為分析純；葡萄糖、木糖和阿拉伯糖(Sigma)；纖維素酶(Cellic CTec3，Novozymes)。

TSP120雙螺桿擠壓浸漬機，江蘇金沃機械有限公司提供；UV-1800紫外分光光度計，上海菁華公司提供；LC-40D高效液相色譜儀，日本島津公司提供；TM4000 Plus掃描電子顯微鏡，日本日立公司提供；Spectrum 3紅外光譜儀，美國鉑金埃爾默公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理蘆葦

稱取定量蘆葦，按照進料濃度25%加至雙螺桿擠壓浸漬機中，設(shè)計不同的螺紋元件組合1(30 mm+28 mm+24 mm+22 mm)和組合2(24 mm+22 mm+16 mm+14 mm)以及螺桿轉(zhuǎn)速150，200，250 r/min進行處理，擠壓后將試樣進行堿處理，處理條件：KOH用量4%(質(zhì)量分數(shù)，下同)、處理溫度90 ℃、保溫時間3 h，預(yù)處理后試樣經(jīng)水洗至中性進行酶解實驗。

取雙螺桿擠壓處理后的物料，設(shè)計不同KOH用量1%，2%，3%，4%和5%，處理溫度為50，60，70，80，90 ℃，保溫時間為0.5，1，2，3，4 h，預(yù)處理后將試樣水洗至中性進行酶解實驗。

1.2.2 蘆葦?shù)幕瘜W組分測定

蘆葦預(yù)處理前后纖維素、半纖維和木質(zhì)素的含量按照美國國家可再生能源實驗室(NREL)方法進行測定[10]。

1.2.3 蘆葦酶水解

雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理工藝優(yōu)化與不同預(yù)處理方式的蘆葦酶解效果評價，均采用以下條件進行。控制底物濃度為10%(底物質(zhì)量以絕干物料計)，用0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值為4.8，纖維素酶(Cellic CTec 3)的添加量為10 FPU/g底物，低于已報道蘆葦酶水解研究中的15～30 FPU/g底物的用量[11-13]。在50 ℃條件下，于150 r/min水浴恒溫振蕩48 h，酶水解液用沸水浴處理10 min后，12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[14]測定還原糖濃度來評估酶解效果，總糖得率(RS)按式(1)計算：

式中：C為還原糖質(zhì)量濃度，g/L；V為酶水解液體積，L；m1為預(yù)處理后蘆葦干重，g；m2為預(yù)處理前蘆葦干重，g。

圖1 蘆葦酶解制糖工藝流程 Fig.1 Process of sugar production by reed enzyme hydrolysis

1.2.4 掃描電子顯微鏡觀察

蘆葦預(yù)處理前后的試樣經(jīng)壓片、噴金處理后，采用掃描電子顯微鏡在15 kV加速電壓下觀察蘆葦纖維的結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)測定

蘆葦預(yù)處理前后的試樣經(jīng)研磨后，采用傅里葉變換紅外光譜儀進行分析，波數(shù)范圍為500～4 000 cm-1，分辨率為1 cm-1。

1.2.6 逆流洗滌

蘆葦經(jīng)雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理后，按照圖1中洗滌模式進行清洗，設(shè)計用水量分別為固液比為1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，物料經(jīng)逆流洗滌后，分別取第1至第4次洗滌液測定電導率，洗滌后的物料用H2SO4調(diào)節(jié)pH值為4.8，進行酶解實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理對蘆葦酶解的影響

2.1.1 螺紋元件組合

雙螺桿擠壓機的螺桿上配置了4套螺紋元件。第1套用于切割，減少纖維長度；第2套用于破碎，使蘆葦?shù)耐獗砻胬w維化；第3套用于混合和脫水，從蘆葦中除去部分水分；第4套用于撕裂和壓縮，使蘆葦內(nèi)部纖維化。如圖2所示，采用螺紋元件組合2的螺桿配置，蘆葦經(jīng)擠壓處理后纖維細化程度更高，具有較優(yōu)的破碎和剪切效果。實驗結(jié)果表明，組合2還原糖產(chǎn)量和總糖得率比組合1分別提高了12.0%和9.7%(見表1)，組合2的螺紋元件配置更適合用于雙螺桿擠壓處理蘆葦。

圖2 不同螺紋元件擠壓處理蘆葦效果Fig.2 Effect of extrusion pretreatment of reed with different thread elements

表1 不同螺紋元件組合對蘆葦酶解效果的影響Tab.1 Effect of different thread element combinations on the enzymatic hydrolysis of reeds

表2 不同螺桿轉(zhuǎn)速對蘆葦酶解效果的影響Tab.2 Effect of different screw speeds on the enzymatic hydrolysis of reeds

2.1.2 螺桿轉(zhuǎn)速

隨著雙螺桿擠壓機的螺桿轉(zhuǎn)速從150 r/min增加到250 r/min，蘆葦預(yù)處理試樣經(jīng)酶水解后的總糖得率從45.40%下降至43.78%(見表2)。這主要是由于隨著螺桿速度的提高，蘆葦在擠壓機中的停留時間從70 s減少到40 s，在不顯著影響生產(chǎn)效率的前提下，150 r/min的螺桿轉(zhuǎn)速有助于提高蘆葦物理結(jié)構(gòu)的破壞程度，降低纖維素的結(jié)晶度，增加酶作用的表面積。

2.1.3 堿用量

圖3 不同KOH用量對蘆葦酶解效果的影響 Fig.3 Effect of different potassium hydroxide dosages on the enzymatic hydrolysis of reeds

選取雙螺桿擠壓機的螺紋元件配置為組合2、螺桿轉(zhuǎn)速為150 r/min作為擠壓處理的工藝參數(shù)開展后續(xù)實驗研究。如圖3所示，在不同堿用量、處理溫度90 ℃、保溫時間3 h的條件下，當KOH用量增加時，預(yù)處理后蘆葦酶水解的還原糖產(chǎn)量逐漸提高。這主要是由于蘆葦中的半纖維素和木質(zhì)素在堿催化下發(fā)生一定程度的水解，從緊密的結(jié)構(gòu)中溶出，打破了纖維素周圍圍繞的物理屏障，減少了對纖維素酶的無效吸附[15]。但是堿添加量從4%進一步增加時，隨著纖維素和半纖維素降解導致的損失，以及因細小纖維增加造成洗滌后固體回收率的降低，使總糖得率由46.30%下降至45.21%，因而4%的KOH添加量對雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理蘆葦較為適宜。

2.1.4 處理溫度

圖4 不同處理溫度對蘆葦酶解效果的影響 Fig.4 Effect of different processing temperature on the enzymatic hydrolysis of reeds

在預(yù)處理過程中，升高溫度可以增加化學反應(yīng)速率，提升纖維的化學組分脫除率，使蘆葦纖維內(nèi)部形成疏松多孔的結(jié)構(gòu)，多糖組分更容易與酶進行反應(yīng)。圖4為蘆葦經(jīng)擠壓處理、KOH用量為4%、在不同處理溫度下維持3 h后酶水解的還原糖產(chǎn)量和總糖得率情況。由圖4可以看出，隨著處理溫度的升高，預(yù)處理后蘆葦?shù)拿附庑Ч忻黠@提升，常壓條件下在90 ℃時達到最大值，考慮到工業(yè)化實施的設(shè)備需求性、經(jīng)濟可行性和預(yù)處理效率，處理溫度為90 ℃較為適宜。

2.1.5 保溫時間

在KOH用量為4%、處理溫度為90 ℃的條件下，考察不同保溫時間對預(yù)處理后蘆葦酶解效果的影響，結(jié)果見圖5。蘆葦中的蠟質(zhì)和纖維化學組分在堿性條件下的降解過程需要時間積累，不能夠在瞬間完成，因而保溫處理對提高蘆葦酶解總糖得率是必要的。從圖5中可以看出，隨著保溫時間的延長，導致有機化合物、灰分、木質(zhì)素、半纖維素和纖維素等逐漸水解或溶出，提高了纖維素的可及性，還原糖產(chǎn)量增加，當保溫時間從2 h繼續(xù)增加時，總糖得率反而有一定程度的下降。這是因為當反應(yīng)進行到一定時間后，木質(zhì)素的脫除率將不再顯著增加，而纖維素和半纖維素的降解率逐漸提升，造成纖維中多糖組分的絕對含量減少，所以選擇2 h的保溫時間作為最適宜工藝條件。

2.2 不同預(yù)處理方式對蘆葦化學組分的影響

圖6顯示的是蘆葦未處理(UT)、雙螺桿擠壓處理(SE，螺紋元件組合2+螺桿轉(zhuǎn)速150 r/min)、堿處理(AL，KOH用量為4%，90 ℃，保溫2 h)和雙螺桿擠壓耦合堿處理(SE-AL，螺紋元件組合2+螺桿轉(zhuǎn)速150 r/min，KOH用量為4%，90 ℃，保溫2 h)的化學組分變化情況。結(jié)果表明，與未處理蘆葦相比，雙螺桿擠壓處理通過物理剪切和摩擦對蘆葦?shù)睦w維結(jié)構(gòu)進行破壞，導致細胞壁結(jié)構(gòu)破裂，更多纖維素表面暴露出來，但其化學組分無明顯變化；KOH可以破壞纖維素與半纖維素之間的氫鍵和半纖維素與木質(zhì)素之間的酯鍵[16]，使木質(zhì)素和部分半纖維素在處理過程中降解溶于堿液中，提升了預(yù)處理后蘆葦?shù)睦w維素組分，木質(zhì)素組分大幅降低；而與單一堿處理相比，經(jīng)雙螺桿擠壓打破了蘆葦纖維的致密結(jié)構(gòu)，耦合堿處理后增加了堿液的接觸面積，從而使木質(zhì)素的脫除率較單一堿處理提高9.8%，同時提高了纖維素的溶脹效果，促進了纖維素結(jié)晶度的降低。

圖5 不同保溫時間對蘆葦酶解效果的影響 Fig.5 Effect of different holding time on the enzymatic hydrolysis of reeds

圖6 蘆葦不同預(yù)處理方式的化學組分變化 Fig.6 Changes in chemical composition of differentpretreatment methods of reeds

2.3 不同預(yù)處理方式對蘆葦酶解效果的影響

圖7 蘆葦不同預(yù)處理方式的酶解效果 Fig.7 Enzymatic hydrolysis effect of different pretreatment methods of reeds

從圖7可以看出，蘆葦采用雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理效果明顯優(yōu)于其他方法，經(jīng)酶水解后的還原糖產(chǎn)量可達到77.31 g/L，總糖得率比未處理蘆葦提高1.64倍。結(jié)果表明，雙螺桿擠壓預(yù)處理通過物理作用將蘆葦切碎并撕裂，降低了物料粒徑，使纖維細化，提高了比表面積，由于蘆葦表面蠟質(zhì)和木質(zhì)素未能脫除，導致酶水解效率難以有效提升。堿處理可以使蘆葦中的蠟質(zhì)溶出，打斷木質(zhì)素與半纖維素化學交聯(lián)鍵，脫除木質(zhì)素和半纖維素，使纖維素結(jié)晶區(qū)裸露出來，從而顯著提升酶解得率。而雙螺桿擠壓與堿結(jié)合預(yù)處理蘆葦，兼具了兩者的處理效果，并有協(xié)同增效作用，擠壓使蘆葦纖維的結(jié)構(gòu)破裂，提升了堿對木質(zhì)素、半纖維素和蠟質(zhì)溶解去除率，增加了纖維素的可及度，纖維孔徑、孔隙率和表面積進一步增大，雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理蘆葦?shù)拿附饪偺堑寐时入p螺桿擠壓和堿處理分別提高73.5%和36.8%。此外，雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理蘆葦酶解后獲得總糖得率比報道的其他預(yù)處理方法要高。例如：CHEN等[17]采用水熱結(jié)合乳酸預(yù)處理蘆葦，ZHANG等[18]采用DES預(yù)處理蘆葦，總糖得率分別為0.39 g/g干蘆葦和0.30 g/g干蘆葦。而COIMBRA等[19]采用堿擠壓處理小麥秸稈，在NaOH用量為10%、溫度為70 ℃的條件下，使用42 FPU/g干物料較高酶負荷水解后，總糖得率為0.41 g/g干小麥秸稈。另一項研究中，ZHANG等[20]對玉米秸稈進行了雙螺桿擠壓聯(lián)合堿處理，在NaOH用量為4%、溫度為140 ℃的條件下，使用0.028 g/g干秸稈的纖維素酶對預(yù)處理后的物料水解后，總糖得率為0.44 g/g干玉米秸稈。因此，實驗得出的雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理最佳工藝，條件溫和，成本低，酶負荷用量少，酶解效率高，是一種具有大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用前景的技術(shù)。

2.4 掃描電子顯微鏡分析

從圖8不同方法預(yù)處理后蘆葦?shù)膾呙桦娮语@微鏡照片中可以觀察到，未處理蘆葦樣品的細胞壁結(jié)構(gòu)整齊有序，表面光滑緊密；經(jīng)擠壓處理后的蘆葦，在螺桿剪切和揉搓作用下纖維結(jié)構(gòu)被切斷打亂，使纖維從細胞壁中暴露出；堿處理可以使蘆葦中一些組分溶出，導致表面變得粗糙松散，且留有狹長的縫隙，增加了孔隙率和比表面積；而雙螺桿擠壓耦合堿處理進一步改善了蘆葦?shù)念A(yù)處理效果，在聯(lián)合作用下蘆葦纖維更加纖細，并分絲帚化，解離成單獨的纖維和纖維束，表面褶皺并出現(xiàn)斷裂，纖維的比表面積增加，有利于酶的吸附，因而雙螺桿擠壓和堿的耦合作用提升了酶的水解效果。

圖8 蘆葦不同預(yù)處理前后掃描電子顯微鏡圖片(×500倍)Fig.8 SEM images of reed before and after different pretreatments(×500 times)

2.5 傅里葉變化紅外光譜分析

圖9 不同預(yù)處理方式前后蘆葦?shù)募t外光譜圖 Fig.9 FTIR images of reed before and after different pretreatments

圖9為蘆葦不同預(yù)處理方式的紅外光譜圖，3 380 cm-1處為纖維素分子內(nèi)—OH伸縮振動吸收峰[21]，經(jīng)預(yù)處理后該吸收峰強度減弱，表明纖維素的氫鍵被破壞；2 917 cm-1和2 850 cm-1處分別為木質(zhì)素和脂肪族化合物中—CH3和—CH2的C—H鍵的反對稱伸縮振動吸收峰和對稱伸縮振動吸收峰[22]，經(jīng)堿處理和雙螺桿擠壓耦合堿處理后，兩處吸收峰強度明顯減弱，說明蘆葦中的木質(zhì)素和蠟質(zhì)均不同程度被去除；1 731 cm-1處為木質(zhì)素和半纖維素中—C=O的伸縮振動吸收峰，該處吸收峰強度在經(jīng)堿處理和雙螺桿擠壓耦合堿處理后減弱，說明預(yù)處理導致木質(zhì)素和半纖維素之間酯鍵的斷裂；1 600～1 460 cm-1處為芳香族苯環(huán)骨架振動吸收峰，屬于木質(zhì)素的特征吸收峰[23]，此處吸收峰強度的減弱說明堿處理對木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞從而被脫除，雙螺桿擠壓耦合堿處理對木質(zhì)素的去除有增效作用；1 030 cm-1處為Si—O—Si鍵的反對稱吸收峰[24]，預(yù)處理后吸收峰強度減弱，說明蘆葦中SiO2有不同程度的去除。

2.6 逆流洗滌用水量對蘆葦酶解的影響

蘆葦采用雙螺桿擠壓耦合KOH預(yù)處理后，脫除的木質(zhì)素及蠟質(zhì)和產(chǎn)生的有機酸與酚醛等如不清洗會殘留在物料中，影響酶解效率[25-26]。采用逆流洗滌方式可以在有效去除酶解抑制物的基礎(chǔ)上，減少用水量，避免廢水排放。如圖10所示，預(yù)處理后蘆葦在逆流洗滌模式下清洗，洗滌廢液的電導率顯著下降，最低可降至0.4 mS/cm以下。由圖11可知，與預(yù)處理后未經(jīng)洗滌的蘆葦相比，逆流洗滌后試樣的酶解效果明顯改善，在固液比為1∶8用水量逆流洗滌處理，樣品經(jīng)酶解后總糖得率最大達到45.61%。

圖10 不同用水量逆流洗滌后洗液電導率變化Fig.10 Changes of conductivity after countercurrent washing with different water consumption

圖11 不同用水量的逆流洗滌對蘆葦酶解效果Fig.11 Effect of enzymatic hydrolysis reed after countercurrentwashing with different water consumption

3 結(jié) 語

為了解決雄安新區(qū)白洋淀蘆葦秸稈等廢棄物資源高值化利用問題，提出了一種雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理蘆葦制備可發(fā)酵糖的工藝方案，研究了雙螺桿擠壓處理條件、堿用量、處理溫度、時間等過程參數(shù)對蘆葦酶解的影響，分析了預(yù)處理前后蘆葦化學組分和纖維結(jié)構(gòu)的變化，得到以下結(jié)論。

1)在雙螺桿擠壓螺紋元件配置為24 mm+22 mm+16 mm+14 mm，螺桿轉(zhuǎn)速為150 r/min，KOH用量為4%、處理溫度為90 ℃、保溫時間為2 h的條件下，蘆葦預(yù)處理效果最好，酶解后還原糖產(chǎn)量可達到77.31 g/L，總糖得率比未處理蘆葦提高1.64倍。該工藝可用于蘆葦生產(chǎn)木質(zhì)纖維素糖，為規(guī)模化生物制造提供原料。

2)雙螺桿擠壓與堿預(yù)處理的耦合導致協(xié)同效應(yīng)，改變了蘆葦?shù)睦w維結(jié)構(gòu)和化學組分，部分氫鍵被破壞，部分酯鍵發(fā)生皂化反應(yīng)，去除了木質(zhì)素和蠟質(zhì)等雜質(zhì)，木質(zhì)素脫除率達到72%，增加了纖維素酶作用的可及性，提高了酶解效率。

3)預(yù)處理后蘆葦采用逆流洗滌模式在固液比為1∶8、清洗4次的條件下，使用較低的纖維素酶用量對預(yù)處理后的蘆葦酶解，總糖得率可達到0.45 g/g干蘆葦，該洗滌方法水耗低，還可以有效去除酶解抑制物。

4)預(yù)處理后的廢液和酶解后的廢渣可用于制作富含黃腐酸鉀的有機肥[27]，使整個工藝過程不產(chǎn)生廢水和廢渣，可為白洋淀地區(qū)蘆葦資源化利用提供一種綠色可行的工業(yè)化途徑。

雙螺桿擠壓耦合堿預(yù)處理蘆葦?shù)姆椒ǚ磻?yīng)條件適宜，能耗、水耗低，過程無廢物排放，酶解效率高，適宜工業(yè)化放大應(yīng)用。但是，關(guān)于蠟質(zhì)和木質(zhì)素對蘆葦酶水解影響的作用機理和預(yù)處理后蘆葦酶解過程的調(diào)控還有待深入分析。因此，未來還需針對蘆葦預(yù)處理及酶水解過程中的共性規(guī)律與調(diào)控機制開展進一步的研究。