北方稻蟹共作模式下中華絨螯蟹產(chǎn)地的判別

白淑艷，王鵬，陳中祥，吳松，郝其睿，高磊，杜寧寧，覃東立*

（1 中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 哈爾濱1500702 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（哈爾濱），哈爾濱 150070）

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹，因獨特的風味和富含多種礦質(zhì)元素[1]，而深受消費者喜愛，現(xiàn)已成為我國主要的水產(chǎn)品養(yǎng)殖品種。中華絨螯蟹自然群體主要分布在我國的長江、黃河和遼河流域及河口等水域[2]，目前以養(yǎng)殖群體為主，其中，稻田養(yǎng)蟹作為一種可持續(xù)的水稻生態(tài)種養(yǎng)模式，是中國北方稻作區(qū)一種重要的種養(yǎng)模式[3-4]。如遼寧省盤錦市是我國北方最大的河蟹養(yǎng)殖基地。稻田養(yǎng)殖的魚、蝦、蟹等品質(zhì)優(yōu)良，味道鮮美，深受廣大消費者歡迎[5]。目前，申請國家地理標志產(chǎn)品保護的中華絨螯蟹品牌有20 多個，包括遼寧東港、陽澄湖、洪澤湖、黃河口等。然而，由于品牌蟹具有較高的商業(yè)價值，貼錯標簽和摻假等問題時有發(fā)生，嚴重擾亂了水產(chǎn)品市場。研究鑒別中華絨螯蟹產(chǎn)地的溯源方法，對規(guī)范生產(chǎn)，維護市場秩序，加強監(jiān)管具有重要意義。

食品產(chǎn)地溯源有許多不同的生物和化學方法，如利用色譜、質(zhì)譜和光譜學原理分析食品中的有機（DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖和代謝物）和無機（元素、同位素比例）組分的差異性來進行辨別[6-7]。隨著分析檢測技術(shù)的發(fā)展，礦物元素指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學計量學分析在食品產(chǎn)地溯源方面得到廣泛的應(yīng)用，例如在谷物[8-10]、牛羊肉[11-13]、葡萄酒[14-16]等食品溯源中的應(yīng)用。也有學者基于多元素指紋結(jié)合化學計量學方法對水產(chǎn)品進行產(chǎn)地溯。例如：郭利攀[17]利用電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀（ICPMS）測定東海3 個地區(qū)經(jīng)濟魚類的25 種金屬元素，結(jié)合偏最小二乘判別分析（PLS-DA）進行產(chǎn)地判別，實現(xiàn)了97.92%的正確分類。張政權(quán)等[18]通過測定肌肉組織 中K、Ca、Na、Mg、Mn、Zn、Cu、Fe 8種礦物元素含量和碳、氮穩(wěn)定同位素豐度，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法建立了針對來自崇明、陽澄湖和興化3 個地區(qū)的中華絨螯蟹的產(chǎn)地判別模型，判別準確率達98.3%。駱仁軍等[19]結(jié)合礦質(zhì)元素和穩(wěn)定同位素技術(shù)對黃河和遼河3 個產(chǎn)地的中華絨螯蟹進行產(chǎn)地鑒別，結(jié)果表明穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素相結(jié)合或單獨利用礦質(zhì)元素的判別準確率均高于95%，且穩(wěn)定同位素和礦質(zhì)元素的結(jié)合具有更高的產(chǎn)地區(qū)分潛力。Marrà 等[20]、Kang 等[21]、Gopi等[22]、Li 等[23]采用ICP-MS 結(jié)合主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）、線性判別分析（LDA）、支持向量機（SVM）、逐步線性判別分析（S-LDA）等方法對鱸魚、海參及蝦等水產(chǎn)品進行產(chǎn)地溯源，判別效果較好。當前對中華絨鰲蟹的產(chǎn)地溯源研究多集中在長江、黃河水系，且以野生和池塘養(yǎng)殖為主[13-14，24]，缺乏北方地區(qū)以及稻蟹共作模式下中華絨螯蟹群體的鑒別，導致其在認證和可追溯體系中不全面。本研究以北方稻蟹共作養(yǎng)模式下中華絨螯蟹為樣本，采用ICP-MS對樣本進行礦質(zhì)元素指紋分析，結(jié)合方差分析、PCA、OPLS-DA 以及S-LDA 等方法進行產(chǎn)地溯源，以期為建立國家地理標志中華絨螯蟹的產(chǎn)地溯源體系提供基礎(chǔ)資料和方法參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

優(yōu)級純硝酸和鹽酸，德國Merck 公司；Li、Sc、Ge、Rh、In、Tb、Lu、Bi 內(nèi)標溶液質(zhì)量濃度為100 mg/L，Li、Y、Ce、Tl、Co 調(diào)諧液質(zhì)量濃度為10 mg/L，美國Agilent 公司；V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Mo、Ag、Cd、Ba、Pb 和U 標準溶液質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，國家標準物質(zhì)中心；高純氬氣、高純氦氣（純度≥99.999%）。

ICP-MS（7500cx），配置八級桿碰撞/反應(yīng)池系統(tǒng)（ORS），美國Agilent 公司；微波消解儀MARSX，美國CEM 公司；純水器，美國Millipore 公司。

1.2 樣本采集與制備

稻蟹共作模式下中華絨螯蟹樣本共計36 份，于2017 年9 月采集自遼寧省盤錦市，吉林省長春市、四平市和吉林市，黑龍江省佳木斯市、綏化市和虎林市。其中黑龍江省10 份，吉林省16 份，遼寧省10 份。所有樣本大小相似，雄性和雌性樣本數(shù)量相同。雌蟹體重68～130 g，雄蟹體重82～155 g。樣本采集后獨立密封包裝于樣本袋中，采用帶有冰盒的保溫箱盡快低溫運輸至實驗室。樣本制備前，用吸水紙去除樣本體表水分，去殼，取可食部分，混合并均質(zhì)，存于-20 ℃冰箱，備測。

1.3 樣本檢測

樣本檢測方法參考覃東立等[25]的方法。所用塑料瓶、錐形管等玻璃器皿均用濃HNO3浸泡24 h，超純水沖洗3 遍，烘干，備用。常溫下解凍樣本，用微波消解。每個樣本稱取0.5 g（濕重），放至2.5 mL 65%硝酸中，加入0.5 mL 37%鹽酸和7.0 mL超純水。微波消解的程序：微波功率1 600 W，爬升溫度185 ℃，升溫時間10.5 min，保持時間14.5 min。消解完成后，將消解液移至50 mL 容量瓶中，加入0.5 mL 100 μg/L 內(nèi)標溶液，定容50 mL。同時，做樣本空白溶液，消解后的中華絨螯蟹樣本和試劑空白用ICP-MS 檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0（美國IBM 公司）軟件進行相關(guān)性、差異性和主成分分析以及逐步線性判別分析；采用R 語言建立正交偏最小二乘判別模型；采用Origin9（美國Originlab）軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同省份中華絨螯蟹樣本中元素含量差異性及相關(guān)性分析

由表1 可看出，所有中華絨螯蟹樣本中Cd、Pb、As、Cr 和Cu 等重金屬含量范圍遠低于GB 2762-2017《食品中污染物限量》[26]對甲殼類水產(chǎn)品的限量標準。方差分析結(jié)果顯示：Cr、Mn 元素在3 個省份樣本中均存在顯著差異（P＜0.05），2 種元素平均含量水平在3 個省份樣本間的排序均為：吉林省＜遼寧?。己邶埥。质∑骄克阶畹?。吉林省V、Fe、Ba、Pb 4 種元素極顯著低于黑龍江省和遼寧?。≒＜0.01），而Ni、Mo、Cd、U 4種元素極顯著高于黑龍江省和遼寧?。≒＜0.01），As 元素顯著高于黑龍江省和遼寧?。≒＜0.05），以上9 種元素在黑龍江和遼寧省的樣品間無顯著差異（P＞0.05）。遼寧省樣本中Zn 元素的含量極顯著低于黑龍江省的，而黑龍江和吉林兩省樣本間無顯著差異。Co、Cu、Se、Ag 4 種元素含量在3 個省份樣本間均差異不顯著（P＞0.05）。3 省份樣本中元素含量存在地區(qū)性差異，利用這種差異對樣本進行產(chǎn)地鑒別具有可行性。

表1 3 個省份中華絨螯蟹樣本礦物元素含量及變異系數(shù)Table 1 Mineral element content and coefficient of variation of Eriocheir sinensis samples from three provinces

對16 種元素數(shù)據(jù)做標準化處理，然后進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。V、Cr、Mn、Fe、Ba 5 種元素與U 元素呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），而與Ba、Pb呈極顯著正相關(guān)，元素U 與Ni、As、Se、Mo、Cd 呈極顯著正相關(guān)，與Pb 呈極顯著負相關(guān)關(guān)系；元素Ba、Pb 與Ni、Mo、Cd 呈極顯著負相關(guān)；元素Mn 與Cd、Mo、As、U，Cd 與V、Cr、Fe，Mo 與V、Cr、Cu，Cu與Ni 均呈極顯著負相關(guān)；Cd 與Ni、Mo，Mo 與Ni、As，Se 與Cu、As，Ag 與Cu 均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，還有部分元素間呈顯著的相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，中華絨螯蟹樣品中大部分元素含量間存在密切的聯(lián)系，由于信息重疊，很難看出元素間整體的關(guān)聯(lián)性。作為統(tǒng)計分析的第1 步，采用無監(jiān)督主成分分析法將數(shù)據(jù)進行降維處理，找出元素間的關(guān)聯(lián)規(guī)律，并對樣本進行初步分類判別。

2.2 不同省份中華絨螯蟹樣本中元素含量的主成分分析（PCA）

將中華絨螯蟹樣本中的元素含量數(shù)據(jù)做標準化處理后進行主成分分析。結(jié)果表明，第1 主成分F1的特征值為2.70180，方差貢獻率為45.620%；第2 主成分F2特征值為1.65770，方差貢獻率為17.180%；第3～5 主成分F3～F5的方差貢獻率分別為9.615%，8.283%，7.404%（表3）。前5 個主成分累計方差貢獻率為88.101%（大于85%），說明前5 個主成分能夠解釋全部樣本的16 個元素指標的絕大部分信息。

表3 主成分的方差貢獻率Table 3 Eigenvalues and contribution rates to total variance of principal components

由主成分載荷網(wǎng)絡(luò)圖可以看出（圖1），F(xiàn)1主要綜合了樣本中V、Cr、Mn、Fe、Pb 含量信息，F(xiàn)2主要綜合了樣本中Cu 含量信息，F(xiàn)3主要綜合了樣本中Co 含量信息，F(xiàn)4主要綜合了樣本中Ag 含量信息，F(xiàn)5主要綜合了樣本中Zn 含量信息。結(jié)合以上結(jié)果，V、Cr、Mn、Fe、Pb、Cu、Co、Ag、Zn 等9 種元素是不同省份中華絨螯蟹的特征元素。

圖1 主成分載荷網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Principal component load network diagram

根據(jù)主成分分析的結(jié)果，將全部樣本的前2個主成分得分作二維散點圖（圖2），對樣本初步分類?？梢钥闯?，吉林省樣本分布雖較分散但仍可被歸為一類，而黑龍江省和吉林省樣本有部分重疊。可能是因為前2 個主成分的累計方差貢獻率只有62.80%，原始信息代表度不高。無監(jiān)督PCA雖然在視覺上對中華絨螯蟹的地理來源進行模糊分類，但是需要建立判別模型對3 個省份樣本做準確判別。

圖2 不同省份中華絨螯蟹礦物元素含量在前2 個主成分得分的散點圖Fig.2 Scatterplots of the first 2 principal components of mineral elements in Eriocheir sinensis from different provinces

2.3 不同省份中華絨螯蟹樣本中礦物元素含量的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

為了實現(xiàn)對不同省份中華絨螯蟹的產(chǎn)地判別，對樣本的16 種礦質(zhì)元素含量進行OPLS-DA分析，構(gòu)建溯源模型，其擬合參數(shù)R2X=0.572，R2Y=0.75，即57.2%的變量可以解釋75%的組間差異，經(jīng)七折交叉驗證后，估計模型的預測能力為71.4%，證明該模型具有較好的預測能力（R2 和Q2 均大于0.5）。由圖3看出3 個省份的樣本達到明顯的聚類，表明不同省份中華絨螯蟹樣本的元素含量具有一定的特征性，使各省份樣本得到有效的分類。變量投影影響指數(shù)（variable importance for the projection，VIP）顯示（圖4），Zn、Cr、Mn、Pb、V、Mo、Fe、U 的VIP 值均大于1，一般情況下VIP 值可量化各變量對樣本分類的貢獻，VIP 值越大（＞1），對產(chǎn)地判別的差異性越顯著[27]，表明Zn 等8 種礦質(zhì)元素含量對3 個省份中華絨螯蟹樣本的產(chǎn)地判別貢獻率較大，尤其是Zn、Cr、Mn 的VIP 值分別為1.796，1.227，1.223，表明這3 個元素可作為3 個產(chǎn)區(qū)樣本鑒別的特征元素。

圖3 3 個省份中華絨螯蟹的OPLS-DAFig.3 OPLS-DA plot of Eriocheir sinensis from the three provinces

圖4 OPLS-DA 模型下的變量投影影響指數(shù)（VIP）值Fig.4 Variable importance in the projection（VIP）obtained from the OPLS-DA mode

2.4 不同省份中華絨螯蟹中礦物元素含量的逐步線性判別分析（SLDA）

LDA 是一種有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分類方法，可以在假設(shè)樣本分類的前提下將已知樣本作為訓練集，利用不同類別樣本之間的相關(guān)性建立判別模型，再用判別模型對未知樣本進行判別歸類。采用“留一法”進行交叉驗證，即把訓練集中除某個樣本之外的其余樣本作為訓練集，建立相關(guān)的判別函數(shù)，進而對該樣本進行判別。像這樣，將每個樣本作為一個測試集，來驗證由剩余其它樣本所建立的判別函數(shù)，從而檢驗判別模型的穩(wěn)定性。采用逐步判別分析（S-LDA）方法，按照中華絨螯蟹樣本中各元素含量在判別分析過程中的重要性，由大到小逐步選為判別變量，

建立中華絨螯蟹分類判別函數(shù)。各省份中華絨螯蟹的產(chǎn)地判別公式如下：

由此可見，Cr、Zn、Mo、Ag、Pb、U6 種元素的含量作為特征因子被引入判別函數(shù)中，將6 種元素含量數(shù)值分別帶入上式，可計算出3 個函數(shù)值。選取其中函數(shù)值最大的判別函數(shù)所對應(yīng)的省份作為該個體的產(chǎn)地，對觀測樣本進行預測分類。結(jié)果表明，各省份判別結(jié)果的正確率均為100%（表4）。采用“留一法”進行交叉驗證，結(jié)果顯示：黑龍江省的1 個樣本被誤判為遼寧省，另兩個省份實現(xiàn)了全部100%的預測分類，其總體的交叉驗證判別正確率為97.2%。

表4 判別函數(shù)的預測分類及判別準確率Table 4 The predicted classification and accuracy of discriminant function

本次判別分析采用礦質(zhì)元素建立兩個典型判別式函數(shù)（Fuction1、Fuction2），其中Fuction1 的方差貢獻率為 97.1%，F(xiàn)uction2 的方差貢獻率為2.9%，將Fuction1、Fuction2 分別做橫坐標和縱坐標建立坐標系，得到3 個省份樣本的散點圖5?？梢灾庇^看出3 個省份的所有樣本均被分為3 個區(qū)域，說明建立的判別函數(shù)對這3 個省份的樣本具有很好的分類效果。

圖5 典型判別式函數(shù)分類圖Fig.5 Classification diagram of typical discriminant functions

3 討論

多種化學計量學方法結(jié)合多元素指紋技術(shù)在對水產(chǎn)品產(chǎn)地判別中發(fā)揮重要作用[20-23]。本研究中不同地區(qū)的中華絨螯蟹樣本大部分元素含量存在顯著差異，單憑一個變量是不可能確定其產(chǎn)地的。本文采用3 種分析方法（PCA、OPLS-DA 和SLDA）結(jié)合礦物元素含量數(shù)據(jù)，對北方稻蟹共作模式下中華絨螯蟹進行產(chǎn)地判別。在此過程中，無監(jiān)督PCA 僅提供部分不同地理來源的中華絨螯蟹樣本的模糊視覺分類。這是因為原始數(shù)據(jù)中的很多信息在降維過程中丟失了，前兩個主成分總共解釋約62.8%的數(shù)據(jù)變化。然而，PCA 作為統(tǒng)計分析中的第1 步，找到元素之間的關(guān)聯(lián)規(guī)律對于初步數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)可視化是必要的。監(jiān)督LDA 和OPLS-DA 方法是鑒別中華絨螯蟹樣品本地理來源的有效方法。在3 個省樣品的判別分析中，SLDA 和OPLS-DA 模型能夠?qū)崿F(xiàn)100%的正確分類。綜上，多元素含量結(jié)合LDA 和OPLS-DA 可以實現(xiàn)中華絨螯蟹的產(chǎn)地鑒別。

本研究中，3 種分類方法（PCA、OPLS-DA 和S-LDA）篩選出的特征元素均包含元素Zn、Cr、Pb，可見，這3 種元素在3 個省份中華絨螯蟹產(chǎn)地判別中具有一定的地域表征性，可作為潛在的鑒別標記變量。本研究中，所有中華絨螯蟹樣本中Cd、Pb、As、Cr 和Cu 等重金屬含量范圍遠低于GB 2762-2017《食品中污染物限量》[26]對甲殼類水產(chǎn)品的限量標準。重金屬是典型的累積性污染物，污染具有持久性，被水產(chǎn)動物攝食后，經(jīng)食物鏈逐級傳遞、富集，可與有機物結(jié)合成毒性更大的化合物[28-29]。例如，Cd 危害性極大，會使動物體內(nèi)鈣大量流失，引起病體骨質(zhì)疏松、萎縮，與含羥基、巰基的蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制酶系統(tǒng)的正常功能，被機體吸收的鎘很少能排除體內(nèi)[28，30]。在地殼中，Pb 作為重金屬里含量最多的元素，進入動物體內(nèi)后，會隨血液分布，儲存于器官中，引起神經(jīng)炎等各種疾病[31]。然而，有研究表明，Pb、Cr 等重金屬在甲殼綱十足目水產(chǎn)動物組織內(nèi)具有特殊的生物學意義，它們儲存在甲殼動物體內(nèi)可滿足動物的生理需求[31]。也有研究指出Pb、Cd、As、Hg 等重金屬元素的含量可能與環(huán)境污染有關(guān)[32]。黑龍江省、遼寧省與吉林省稻田養(yǎng)殖河蟹中Cr 含量的差異與本地區(qū)土壤中Cr 含量的差異相關(guān)聯(lián)[25]，可進一步研究重金屬的來源，以確定Pb、Cd 等元素指紋在中華絨螯蟹產(chǎn)地判別中的地域表征性。

與池塘養(yǎng)殖或野生[18-19，24]的中華絨螯蟹樣本元素含量相比，北方稻蟹共作模式下的中華絨螯蟹樣本中Zn 的含量更低。養(yǎng)殖螃蟹可捕食自然食物來源，主要攝食魚類、貝類和商業(yè)顆粒飼料等外源飼料[33]。由于飼料配方中使用的原料不同，添加特定的宏量或微量礦物元素（富含Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Cr 和Mg），以及飼料成分中可能存在的污染物，導致魚類飼料中的礦物元素含量水平差異極大[34]。北方稻蟹共作模式下的中華絨鰲蟹多以當?shù)赜衩诪轱暳?，其元素含量更多地反映地域環(huán)境的信息，而受顆粒飼料等外源飼料影響較小?？傊?，中華絨螯蟹元素含量指紋特征是養(yǎng)殖水環(huán)境、底泥、飼料等多方面因素綜合影響的結(jié)果，需進一步探究其形成原因。

4 結(jié)論

采用ICP-MS 測定了黑龍江、吉林省和遼寧省共36 個中華絨螯蟹樣本中的V、Cr、Mn 等16種元素含量，結(jié)果顯示：3 個省份間中華絨螯蟹樣本 中V、Cr、Ni、Mn、Zn、Ba、Fe、Mo、Cd、As、Pb 和U元素的含量差異顯著（P＜0.05），其中，大部分元素之間表現(xiàn)出極顯著的相關(guān)關(guān)系。利用礦物元素含量特征，結(jié)合PCA、OPLS-DA 和S-LDA 等方法，對中華絨螯蟹樣本進行產(chǎn)地判別。由于數(shù)據(jù)信息損失較大，PCA 方法在區(qū)分地理來源方面效果不佳。S-LDA 和OPLS-DA 方法初始判別正確率均為100%，交叉驗證結(jié)果顯示OPLS-DA 預測能力為71.4%，S-LDA 判別準確率高達97.2%。此外，基于3 種分類方法，確定了Zn、Cr、Pb 元素含量是3 個省份中華絨螯蟹產(chǎn)地鑒別的關(guān)鍵特征因子。然而，地理來源、水環(huán)境及飼料種類等對中華絨螯蟹元素含量的影響還有待深入研究。因本研究的樣品數(shù)量和產(chǎn)地來源較少，故使試驗結(jié)果存在局限性。今后需擴大采樣量和采樣地區(qū)，優(yōu)化統(tǒng)計方法，篩選并建立更有效的溯源指標體系和判別模型。