塔吉克斯坦地區(qū)自然發(fā)酵牛乳中乳酸菌的分離鑒定及多樣性分析

劉琛，叢琳，劉文俊，張和平*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 呼和浩特0100182 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018 3 乳酸菌與發(fā)酵乳制品省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 呼和浩特 010018）

塔吉克斯坦坐落于中亞，地處北溫帶（北緯36°40' 至41°05'），其境內(nèi)多山地高原，為典型的內(nèi)陸高山國家[1]。其國內(nèi)氣候溫和，雨水量充足，水草肥美，良好的氣候環(huán)境造就了天然牧場(chǎng)，農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展占據(jù)了主導(dǎo)地位，而居民生活多為半定居、半游牧，沿襲著古老而傳統(tǒng)的生產(chǎn)、生活方式。良好的氣候環(huán)境和原生態(tài)生活方式使得酸牛乳、奶疙瘩、奶皮子等傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品在當(dāng)?shù)厝艘蝗杖椭姓贾匾壤齕2-3]。事實(shí)上，每個(gè)國家都有自己獨(dú)特的飲食習(xí)俗以及特有的食品種類和制作方法[4-5]。不同地區(qū)的發(fā)酵乳制品都具有悠久的歷史，像是一個(gè)個(gè)“天然的菌種寶庫”，成為研究不同地域飲食中微生物多樣性的良好材料。

乳酸菌分類鑒定的方法分為傳統(tǒng)純培養(yǎng)生理生化分類鑒定法和非培養(yǎng)分子生物學(xué)鑒定法。傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法通過生理及表型鑒定，所得研究結(jié)果準(zhǔn)確性較低，誤差較難避免，而且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。而非傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法可以提取樣品中微生物宏基因組，利用菌株基因組序列之間的特異性對(duì)菌群結(jié)構(gòu)、豐度、多樣性進(jìn)行研究。由于其可高效、快速、全面再現(xiàn)生境中微生物菌群等優(yōu)勢(shì)，因此基于宏基因測(cè)序的方法在乳酸菌分類鑒定中廣泛應(yīng)用[6-7]。通過純培養(yǎng)的方法分離純化得到樣品中微生物并作鑒定，然后利用非培養(yǎng)的方法分析其多樣性，兩者相互補(bǔ)充，是分析微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的科學(xué)方法。

塔吉克斯坦地理?xiàng)l件和氣候條件獨(dú)特，乳制品資源豐富。當(dāng)?shù)氐挠文撩褡彘L期飲用的發(fā)酵牛乳是以新鮮牛乳為原料自然發(fā)酵而成的。其發(fā)酵過程大都不需添加商品發(fā)酵劑，而是用前1 d 的酸乳作為“引子”[8]。由于保持了相對(duì)原始的發(fā)酵過程，樣品中乳酸菌的生物學(xué)特性和菌種的多樣性得到很好地留存，這些豐富的乳酸菌資源有待于開發(fā)和利用。

本研究采用實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)方法結(jié)合16S rRNA 基因序列分析，對(duì)塔吉克斯坦地區(qū)自然發(fā)酵牛乳中的乳酸菌進(jìn)行分離純化及鑒定，為優(yōu)良菌株的篩選提供資源。應(yīng)用PacBio SMRT 測(cè)序技術(shù)揭示自然發(fā)酵牛乳中的細(xì)菌群落組成，研究該地區(qū)自然發(fā)酵牛乳中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

7 份自然發(fā)酵牛乳樣品均采自塔吉克斯坦地區(qū)牧民家庭，編號(hào)為TJ1～TJ7。每個(gè)樣品采集一式兩份，均使用50 mL 無酶無菌管，每個(gè)樣品采集20 mL，一份加入樣品保護(hù)劑（無菌的碳酸鈣0.1 g和淀粉5 g ），另一份加入15 mL DNA 保護(hù)劑（TaKaRa），樣品混勻后封緊管口，立即置于低溫冰箱（4 ℃）中，送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 主要試劑及儀器

MRS 和M17 培養(yǎng)基，英國Qxoid 公司；瓊脂，北京康倍斯公司；TIANamp Bacteria DNA Kit（細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒），天根生化科技有限公司；Dneasy Power Food Kit Dneasy（能量食品試劑盒），德國QIAGEN 公司；KAPA HiFi Hot-StartReadyMix PCR Kit（卡帕高通量聚合酶鏈試反應(yīng)試劑盒），美國KAPA 公司；PCR 所用試劑，上海派森諾生物科技有限公司。

微量紫外分光光度計(jì)，美國Nanodrop 公司；PCR 儀（PTC-200 型），美國Life Technologies 公司；顯微鏡（CX33），日本OLYMPUS 公司；電泳儀（DYY-12 型），北京六一儀器廠；凝膠成像分析儀（CDS8000 型），美國UVP公司；三代測(cè)序儀（PacBio RS II），美國Pacific Biosciences 公司。

1.3 乳酸菌的分離與鑒定

將樣品充分混合均勻后采用十倍梯度稀釋法[9]。吸取10-5，10-6，10-73 個(gè)稀釋梯度的稀釋液，7個(gè)樣品3 個(gè)梯度各200 μL 均勻涂布于MRS 和M17 固體培養(yǎng)基（瓊脂1.2 g/100 mL）上，將固體培養(yǎng)基平板倒置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。菌落形成后，觀察所有菌落的形態(tài)，如菌落顏色、大小、邊緣狀態(tài)等并詳細(xì)記錄，挑取形態(tài)特征不同的單個(gè)菌落于相應(yīng)的MRS 和M17 固體培養(yǎng)基上，采用平板劃線法依據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行2～3 次劃線純化[10]。當(dāng)平板上出現(xiàn)單個(gè)菌落后，使用無菌接種環(huán)挑取菌落分別接種到MRS 和M17 的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件如上文所述。對(duì)所有菌株進(jìn)行過氧化氫酶活性檢測(cè)，以及將菌株革蘭氏染色后顯微鏡觀察，對(duì)結(jié)果為過氧化氫陰性（無氣泡產(chǎn)生）且革蘭氏染色陽性（顯微鏡觀察菌株呈現(xiàn)紫色）的菌株進(jìn)行再培養(yǎng)，并冷凍干燥保藏，以備進(jìn)一步鑒定。

采用試劑盒法提取菌株DNA，先加入溶菌酶（質(zhì)量濃度50 mg/mL）菌株進(jìn)行細(xì)胞壁破壁處理，后續(xù)的裂解、漂洗、裂解等DNA 提取步驟均參考細(xì)菌基因組DNA 提取試劑（離心柱型）盒說明書。獲得菌株的基因組DNA 后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，濃度、純度均符合要求后方可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

使用細(xì)菌通用擴(kuò)增引物，正向引物和方向引物【正向：27F（5＇-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇），反向：1492R（5＇-ACCTTGTTACGACTT-3＇）】，將DNA 作為擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL 的PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增條件是：預(yù)變性5 min（94 ℃）；變性1 min（94 ℃，30 個(gè)循環(huán)），退火1 min（58 ℃，30 個(gè)循環(huán)），延伸2 min（72 ℃，30 個(gè)循環(huán)）；末端延伸10 min（72 ℃）[11]。將電泳條帶明亮，且無拖尾現(xiàn)象的PCR 產(chǎn)物在低溫條件下送往上海派森諾生物公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)序，測(cè)序得到的序列在NCBI 網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上和已公布的菌株序列進(jìn)行同源性比對(duì)，運(yùn)用MEGA7.0 軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建菌株進(jìn)化樹。

1.4 酸牛乳中細(xì)菌宏基因組DNA 的提取

使用Dneasy 能量食品試劑盒，2 mL tubes（100）抽提樣品宏基因組DNA，其步驟參照試劑盒說明書[12]。用ND-1000 紫外分光光度計(jì)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取DNA 的濃度、純度與完整度，將符合條件的DNA 置低溫冰箱（-20 ℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)菌16S rRNA 基因序列全長擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增所需的試劑盒為KAPA HiFi Hot-Start Ready Mix PCR Kit，擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）：10 μmol/L 16S rRNA 基因序列通用引物（同上述1.3 節(jié)）各1.5 μL，DNA 模板1.5 μL，KAPA Mix 4 種堿基混合液25.0 μL，ddH2O 20.5 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性20 s（30 個(gè)循環(huán)），60 ℃退火15 s（30 個(gè)循環(huán)），72 ℃延伸30 s（30 個(gè)循環(huán)）；72 ℃末端延伸2 min[13]。

1.6 PacBio SMRT 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，采用SMRT portal（v2.7）中RS ReadsOfinsert.1，測(cè)序時(shí)DNA 插入片段應(yīng)在1 400～1 800 nt 之間。將滿足要求的高質(zhì)量序列根據(jù)每個(gè)樣品的Barcode 信息做去除Barcode 處理，用QIIME 平臺(tái)對(duì)符合要求的高質(zhì)量序列進(jìn)行微生物組分析。同時(shí)，吉爾吉斯斯坦和摩洛哥的自然發(fā)酵酸牛乳數(shù)據(jù)集也做相同的處理。利用PyNAST 軟件[14]對(duì)齊序列，通過UCLUST 軟件[15]以100%的相似度劃分序列，建立可操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）。利用FastTree 軟件[16]繪制基于OTU 代表序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算分析后，用Mann-Whitny/Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)不同地區(qū)酸牛乳菌落結(jié)構(gòu)的差異性，應(yīng)用R 軟件和Origin2017 等軟件對(duì)QIIME 分析的微生物組數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 塔吉克斯坦酸牛乳中乳酸菌的分離及鑒定

從塔吉克斯坦采集的7 份酸牛乳樣品中共分離得到93 株菌，根據(jù)過氧化氫酶陰性（觀察到無氧氣氣泡產(chǎn)生）和革蘭氏陽性（顯微鏡中菌株呈紫色）的表型結(jié)果，篩選得到疑似乳酸菌92 株。

通過16S rRNA 基因測(cè)序和BLAST 比對(duì)，從種水平上對(duì)分離株進(jìn)行鑒定，確認(rèn)92 株分離菌株為乳酸菌。使用MEGA7.0 軟件將部分分離株與模式株的16S rRNA 基因序列繪制成乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖1）。經(jīng)鑒定，93 株分離菌株；乳桿菌屬有德氏乳桿菌（83 株），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（3 株），短乳桿菌（Lactobacillus brevis）（1 株），腸球菌屬有糞腸球菌（Enterococcus faecium）（3 株），耐久腸球菌（Enterococcus duran）（1 株）和屎腸球菌（Enterococcus faecalis）（1 株），葡萄球?qū)賰H1 株人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）（1 株）。

圖1 部分菌株16S rRNA 基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic relationship of 16S rRNA gene sequences of partial isolates

2.2 塔吉克斯坦酸牛乳的細(xì)菌多樣性

應(yīng)用PacBio SMRT 三代測(cè)序技術(shù)，對(duì)7 份塔吉克斯坦酸牛乳樣品進(jìn)行測(cè)序，最后共獲得25 164 條高質(zhì)量完整的基因序列，平均每個(gè)樣品高質(zhì)量序列3 595 條。經(jīng)97%的相似度劃分OTU，對(duì)獲得的1 838 個(gè)OTU 進(jìn)行分析，平均每個(gè)樣品的OTU 數(shù)量為262 個(gè)，其中序列最多的樣品為TJ3（5 008 個(gè)），序列最少的樣品為TJ7（915個(gè)）。各樣品具體序列數(shù)和OTU 數(shù)量見表1。

表1 自然發(fā)酵乳樣品的測(cè)序信息Table 1 Sequences information of naturally fermented milk samples

圖2a 中稀疏曲線表示未達(dá)到平衡仍呈上升趨勢(shì)，測(cè)序深度會(huì)繼續(xù)增加，同時(shí)樣品中的物種數(shù)也會(huì)增加，說明隨著測(cè)序深度的增加還會(huì)有新的物種被發(fā)現(xiàn)。圖2b 中香農(nóng)曲線達(dá)到平衡，香農(nóng)多樣性指數(shù)達(dá)飽和，表明此深度下測(cè)序，樣品中的細(xì)菌的多樣性已充分展現(xiàn)。本研究的測(cè)序深度已滿足后續(xù)分析要求。

圖2 香農(nóng)多樣性圖（a）和稀疏曲線圖（b）Fig.2 Shannon diversity index curves（a）and rarefaction curves（b）

2.3 塔吉克斯坦酸牛乳的細(xì)菌組成

利用PacBio SMRT 技術(shù)對(duì)塔吉克斯坦地區(qū)酸牛乳樣品進(jìn)行測(cè)序，采用RPD 和Greengenes 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果共鑒定到6 個(gè)細(xì)菌屬和15 個(gè)細(xì)菌種。在屬水平上鑒定到的6 個(gè)細(xì)菌屬，分別是芽孢桿菌屬（Bacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳球菌屬（Lactococcu）。不同樣品細(xì)菌屬水平群落組成如圖3 所示。其中，酸牛乳樣品中相對(duì)含量較高的為乳桿菌屬，含量91.7%，其次為鏈球菌屬，含量8.1%，其中乳球菌屬極少，含量?jī)H0.01%。7 份所測(cè)樣品中，TJ4 樣品菌種豐富度高，所有6 個(gè)菌屬均檢測(cè)到；乳桿菌屬和鏈球菌屬在所有樣品中均可檢出，其含量均在70%以上；鏈球菌屬僅在TJ2 和TJ4 樣品中檢出，含量未達(dá)到1%。

圖3 自然發(fā)酵乳在屬水平上的相對(duì)豐富度和多樣性Fig.3 Relative abundances and bacterial diversity of the microbiota of naturally fermented milk at the genus levels

在種水平上鑒定到15 個(gè)細(xì)菌種，包含7 個(gè)鏈球菌，4 個(gè)乳桿菌，耐久腸球菌等。不同樣品細(xì)菌種水平群落組成如圖4 所示。德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）和瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）在7 份樣品中均有檢出；德氏乳桿菌相對(duì)含量高達(dá)82%，并且在每份樣品中占比均在47%以上，是所測(cè)樣品的主要細(xì)菌群落，可視其為優(yōu)勢(shì)菌種；嗜熱鏈球菌相對(duì)含量為7.36%，是含量第二高的菌種；瑞士乳桿菌的相對(duì)含量為6.62%；萊士曼氏乳桿菌（Lactobacillus leichmannii）占比為2.05%；其余11 種菌種含量極少，小于0.5%。不同酸牛乳樣品的菌種分布及占比并不相同，TJ1 樣品中德氏乳桿菌占比47.87%，瑞士乳桿菌占比44.87%，兩者均為該樣品的優(yōu)勢(shì)菌種。在TJ7 樣品中嗜熱鏈球菌占比26.88%，是該樣品中含量第二高的菌種；TJ2 在7 份樣品中菌種較為單一，并且只有德氏乳桿菌含量最高（97.75%）。

圖4 自然發(fā)酵乳在種水平上的相對(duì)豐富度和多樣性Fig.4 Relative abundances and bacterial diversity of the microbiota of naturally fermented milk at the species levels

2.4 不同地區(qū)酸牛乳細(xì)菌多樣性比較

為了比較不同地域自然發(fā)酵牛乳微生物多樣性，從公共平臺(tái)上檢索到摩洛哥和吉爾吉斯斯坦自然發(fā)酵牛乳的微生物多樣性數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較分析。首先對(duì)3 個(gè)地區(qū)樣品中微生物的多樣性和豐富度進(jìn)行分析，使用α 多樣性的4 個(gè)指數(shù)來評(píng)估。如圖5 所示，吉爾吉斯斯坦和塔吉克斯坦地區(qū)酸牛乳樣品的chao1 指數(shù)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)比摩洛哥地區(qū)高，說明吉爾吉斯斯坦和塔吉克斯坦地區(qū)樣品的細(xì)菌豐富度高于摩洛哥地區(qū)；另外，摩洛哥地區(qū)酸牛乳樣品的香農(nóng)指數(shù)指數(shù)和辛普森指數(shù)與其余兩地區(qū)的樣品相比較高，說明該地區(qū)酸牛乳樣品的細(xì)菌多樣性較高。各地區(qū)酸牛乳樣品α 多樣性指數(shù)詳見表2。

表2 塔吉克斯坦酸牛乳序列數(shù)和OTUs，微生物多樣性和豐富度指數(shù)Table 2 Number of sequences and OTUs，microbial diversity and richness indexes of Tajikistan naturally fermented milk

利用β 多樣性對(duì)3 個(gè)地區(qū)自然發(fā)酵牛乳樣品的多樣性進(jìn)行分析。通過加權(quán)和非加權(quán)UniFrac距離的主成分分析，顯示3 個(gè)地區(qū)微生物群落的差異?；诩訖?quán)的UniFrac 距離來分析，可以顯示物種豐度的不同，而非加權(quán)的UniFrac 距離考慮的是各樣品序列間是否有顯著的微生物群落差異[17]。以第1 主成分和第2 主成分來分析3 個(gè)地區(qū)樣品微生物落群的多樣性，結(jié)果見圖5。圖5a為UniFrac 加權(quán)距離，其第1 主坐標(biāo)和第2 主坐標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為64.06%和19.30%，圖5b 為UniFrac 非加權(quán)距離，第1 主坐標(biāo)和第2 主坐標(biāo)的貢獻(xiàn)率分別為19.53%和8.75%。由圖5 可知，摩洛哥地區(qū)樣品與塔吉克斯坦和吉爾吉斯斯坦地區(qū)樣品能夠較好地區(qū)分，說明摩洛哥和兩地區(qū)微生物組成結(jié)構(gòu)存在一定差異；而塔吉克斯坦和吉爾吉斯斯坦樣品呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，說明兩地區(qū)的樣品微生物菌群結(jié)構(gòu)組成相似度高。圖中摩洛哥和吉爾吉斯斯坦的樣品存在部分交疊的現(xiàn)象，說明兩個(gè)地區(qū)樣品的微生物結(jié)構(gòu)在一定程度上存在相似性。

圖5 自然發(fā)酵酸牛乳樣品中α 多樣性指數(shù)的箱型圖Fig.5 Boxplots of α-diversity indexes of naturally fermented milk samples

進(jìn)一步分析3 個(gè)地區(qū)酸牛乳樣品微生物群落結(jié)構(gòu)差異。一般來說，一個(gè)菌株有一條序列，序列數(shù)量龐大難以比對(duì)，因此以序列相似度來劃分OTU，了解樣品中的菌種和菌屬情況[18]。統(tǒng)計(jì)3 個(gè)地區(qū)的OTU 數(shù)，共有10 497 個(gè)OTU，每個(gè)地區(qū)的樣品都存在特有的OTU。從圖6 來看，3 個(gè)地區(qū)酸牛乳樣品的優(yōu)勢(shì)菌種組成存在差異，摩洛哥地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌株為嗜熱鏈球菌、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和瑞士乳桿菌，其次馬乳酒樣乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）也較多；而塔吉克斯坦和吉爾吉斯斯坦地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌種為德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌，這兩地區(qū)的菌群有細(xì)微的差別。吉爾吉斯斯坦樣品中存在乳酸乳球菌、哈爾濱乳桿菌（Lactobacillus harbinensis）、食二酸乳桿菌（Lactobacillus diolivorans）、類谷糠乳桿菌（Lactobacillus parafarraginis）等菌株，然而豐度較小，在塔吉克斯坦樣品中未檢出。上述結(jié)果表明3 個(gè)地區(qū)的樣品雖然微生物群落的多樣性差異較小，在微生物群落結(jié)構(gòu)上具有相似性，但是樣品優(yōu)勢(shì)菌種的組成不同。

圖6 基于主成分1 和2 的加權(quán)（a）和未加權(quán)（b）UniFrac 主成分分析（PCoA）得分圖Fig.6 Weighted（a）and unweighted（b）UniFrac principal component analysis（PCoA）score plots based on principal components 1 and 2

圖7 3 個(gè)地區(qū)自然發(fā)酵乳中菌種豐度氣泡圖Fig.7 Bubble chart of the abundance of bacteria in natural fermented milk in three regions

3 討論

純培養(yǎng)的方法是最直接、有效地獲得乳酸菌菌種資源的方法，要深入全面獲取樣品中微生物多樣性的信息，需結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，克服純培養(yǎng)的局限性[19]。本研究結(jié)合兩種方法對(duì)塔吉克斯坦地區(qū)自然發(fā)酵乳中乳酸菌多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，德氏乳桿菌為該樣品的優(yōu)勢(shì)菌種，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，然而，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在嗜熱鏈球菌和瑞士乳桿菌等菌株，而分離鑒定并未發(fā)現(xiàn)。以往研究者對(duì)酸牛乳中菌群結(jié)構(gòu)的研究顯示，新疆喀什地區(qū)傳統(tǒng)酸乳中德氏乳桿菌是優(yōu)勢(shì)菌種，同時(shí)也可分離得到瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilu）、屎腸球菌等菌種[20]。同樣，俄羅斯地區(qū)采集的自然發(fā)酵乳中，乳桿菌屬是最豐富的菌屬[21]，上述研究與本研究結(jié)果相近。通過測(cè)序分析，一些痕量微生物被檢出，然而，受某些因素的限制，許多微生物較難分離培養(yǎng)。分子生物學(xué)技術(shù)雖可檢測(cè)到更為豐富的微生物，但無法保留菌種資源。將二者結(jié)合來研究微生物多樣性，具有開發(fā)乳酸菌資源的優(yōu)勢(shì)。

不同地區(qū)酸牛乳的微生物多樣性存在差異。將吉爾吉斯斯坦和摩洛哥與塔吉克斯坦地區(qū)數(shù)據(jù)對(duì)比，結(jié)果顯示，3 個(gè)地區(qū)的微生物菌群組成不同。吉爾吉斯斯坦和塔吉克斯坦地區(qū)群落組成差異較小，可能是兩國地處中亞相鄰而立，空間上地理位置接近，歷史文化和飲食習(xí)慣相似。而摩洛哥位于非洲西北部地區(qū)，與兩國相距較遠(yuǎn)，氣候也相差甚遠(yuǎn)，因此微生物群落結(jié)構(gòu)和其它兩國存在差異。Sun 等[22]研究的蒙古國地區(qū)自然發(fā)酵酸牛乳中發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）和瑞士乳桿菌是優(yōu)勢(shì)菌種，而Liu 等[23]研究的中國內(nèi)蒙古地區(qū)發(fā)酵酸牛乳中乳酸乳球菌、瑞士乳桿菌是優(yōu)勢(shì)菌種。傳統(tǒng)自然發(fā)酵乳制品具有不同的地域特色，因不同的制作工藝及地域環(huán)境，而使得其中蘊(yùn)含的微生物資源差異較大。Zhong 等[24]研究表明：地理來源和樣品類型塑造了天然發(fā)酵乳的微生物多樣性，地理位置不僅代表著空間上的距離，也代表著溫度、濕度、海拔等條件對(duì)微生物多樣性的影響。綜上，自然環(huán)境、氣候等因素造就了豐富多樣的乳酸菌資源。

4 結(jié)論

運(yùn)用純培養(yǎng)方法和PacBio SMRT 三代測(cè)序技術(shù)對(duì)塔吉克斯坦地區(qū)自然發(fā)酵酸牛乳中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)，特別是乳酸菌菌群組成進(jìn)行綜合分析。分離鑒定出92 株乳酸菌，獲得珍貴的乳酸菌資源。對(duì)不同地區(qū)發(fā)酵酸牛乳微生物群落組成分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的自然發(fā)酵乳樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)具有差異，地理位置是引起差異的一個(gè)因素。本研究結(jié)果可為具有區(qū)域特色的乳酸菌資源開發(fā)利用提供參考。