黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊的制備及其表征

李海龍，馬子龍，米帥，李軍，杜彬，朱鳳妹

（河北科技師范學(xué)院 食品科技學(xué)院 河北昌黎 066600）

黑果花楸（Sorbus melanocarpa），薔薇科，花楸屬灌木，耐寒，喜潮濕環(huán)境、喜陽光。果實(shí)為紫黑色，球狀，黑色果肉，味苦澀，含有膳食纖維、蛋白質(zhì)、多酚等營養(yǎng)物質(zhì)[1]，是廣泛用于食品、保健品、藥品開發(fā)及天然色素提取的原料[2]。在國外，黑果腺肋花楸已產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，花楸被制成各種商品，如果酒、果醬等，甚至作為觀賞性植物，獲得了巨大的經(jīng)濟(jì)效益，而在我國鮮為人知，花楸商品更是屈指可數(shù)，其中的功能性成分更是未被利用?；ㄉ兆鳛槠渲械闹饕δ苄晕镔|(zhì)，屬黃酮類物質(zhì)，是一種天然色素，具有抗氧化[3]、降血脂[4]、抗衰老等多種功效[5]。花色苷為眾多漿果的主要功效成分，不僅是天然色素，還具有多種保健作用[6]，如抗炎、抗癌等。研究表明，天然植物成分花青素可以抑制MLK3 的激活及其下游的JNK 和p38MAPK 信號(hào)級(jí)聯(lián)；可以通過下調(diào)Th2 細(xì)胞因子、促炎細(xì)胞因子和COX-2 來減輕哮喘的發(fā)展；花色苷還可以通過與絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB 信號(hào)通路相互作用而激活NRF2，從而調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡，顯著抑制高糖引起的內(nèi)皮細(xì)胞中ROS 的升高，同時(shí)抑制抗氧化活性酶的降低。然而，花色苷易降解，且脂溶性差[7]，使其應(yīng)用受限[8-9]。在人體消化時(shí)，因無法通過磷脂雙分子層被細(xì)胞吸收，故生物利用度也不高[10]。上述缺點(diǎn)極大地影響花色苷在食品、藥品等領(lǐng)域的開發(fā)利用。這些問題亟待解決。

納米微膠囊技術(shù)是對(duì)囊核物質(zhì)進(jìn)行納米級(jí)包裹的新型技術(shù)[11]。納米微膠囊粒子能夠達(dá)到納米水平，一般在1～1 000 nm，其顆粒微小，易于分散，溶解度及穩(wěn)定性等性能均比普通膠囊更加優(yōu)越[12]。利用納米微膠囊技術(shù)對(duì)花色苷進(jìn)行包封，能夠顯著提高其穩(wěn)定性。壁材的選擇對(duì)納米微膠囊有極大的影響。殼聚糖又被稱為乙酰甲殼素，具有優(yōu)良的生物可接受性、生物可降解性[13]，無毒、安全性等特點(diǎn)[14]。γ－聚谷氨酸是一種具有較好的吸附性、保水性和生物相容性及可降解等特點(diǎn)的綠色環(huán)保型陰離子天然聚合材料[15]，經(jīng)pH 驅(qū)動(dòng)可與殼聚糖形成納米粒[16]。如潘飛等[17]用殼聚糖和γ-聚谷氨酸對(duì)黑米花色苷進(jìn)行包埋，制備納米粒，結(jié)果表明包埋后緩釋性增強(qiáng)。賀博[18]采用殼聚糖包埋藍(lán)莓花色苷，穩(wěn)定性顯著提高，釋放率明顯降低。Mudasir 等[19]采用淀粉基納米顆粒進(jìn)行納米封裝，可保護(hù)兒茶素免受惡劣胃環(huán)境的影響，并有助于在體外消化過程中保持其生物活性。Shori 等[20]用海藻酸鈉代替益生菌，用殼聚糖封裝，提高了其在低酸環(huán)境下的穩(wěn)定性，有助于益生菌菌株在酸性環(huán)境中的存活率。

本文從黑果腺肋花楸中提取花色苷，通過大孔樹脂吸附純化，冷凍干燥制備花色苷。以殼聚糖和γ－聚谷氨酸為壁材，對(duì)花楸花色苷進(jìn)行納米微膠囊化，使用pH 示差法分析花色苷含量。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定納米微膠囊的最佳制備條件。對(duì)花色苷納米粒粒徑、Zeta 電位及微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸凍果，遼寧省海城市。殼聚糖（脫乙酰度≥95%），上海源葉生物科技有限公司；γ-聚谷氨酸（分子量>700 000），上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；吐溫80，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；冰乙酸（99.5%），天津福晨化學(xué)試劑有限公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

MS204S/01 型電子天平，梅特勒-托利多儀器（瑞士）有限公司；可見分光光度計(jì)（V-5100），武漢高精密科學(xué)儀器有限公司；酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；激光衍射粒度分析儀（LA-920型），北京掘場匯博隆精密儀器有限公司；Zeta 電位分析儀，麥克默瑞提克（上海）儀器有限公司；熱電磁力攪拌器，上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DB 型），昆山市超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，日本Koki 控股有限公司；EYELA 真空冷凍干燥機(jī)（FDU-1200），北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊的制備分別稱取5，10，15，20 mg 和25 mg 殼聚糖（Chitosan，CS）溶化在10 mL 1%冰醋酸水溶解液中，攪動(dòng)2 h 使其充分溶解至無沉淀，精密吸取20 mL殼聚糖溶解液于燒杯中，加入花色苷和20 mL 的吐溫80 乳化劑，攪動(dòng)1 h，用1 mol/L Na（OH）調(diào)節(jié)溶液pH 值至4.5，加入20 mL 聚谷氨酸（Polyglutamic acid，PGA）溶液，調(diào)整CS ∶PGA 比例為1 ∶1，2∶1，3∶1，4∶1 和5 ∶1，滴加完畢后適當(dāng)攪拌（此過程需在避光環(huán)境下操作）。

1.3.2 花色苷提取率的測定 采用pH 示差法測定提取率，吸取1 mL 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到的濃縮液樣品，加入提前配好的pH 1.0 的氯化鉀緩沖液和pH 4.5 的無水乙酸鈉緩沖溶液，然后，將該樣品溶液稀釋200 倍，用分光光度計(jì)測定A510nm和A700nm?；ㄉ蘸坑?jì)算公式：

式中：ΔA=（A510nm-A700nm）pH1.0-（A510nm-A700nm）pH4.5；V——花色苷樣品體積，mL；F——稀釋倍數(shù)；——平均消光系數(shù)，為98.2；m——花楸樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 包埋率的計(jì)算 將制備的花色苷納米懸浮液12 000 r/min 離心30 min，收集上清。根據(jù)內(nèi)源乳化法[21]測定包埋前、后分離液的吸光度，花色苷包埋率計(jì)算公式：

式中：A1——包埋前分離液的吸光度；A2——包埋后分離液的吸光度。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn) 為考察單一因素對(duì)黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊包埋率的影響，在其它條件相同的情況下，分別選擇不同添加量（25，30，35，40，45 mg）的花色苷提取物，不同殼聚糖質(zhì)量濃度（0.5，1，2，3，4 mg/mL），不同CS ∶PGA 質(zhì)量比（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1）和不同攪拌時(shí)間（15，30，45，60，75 min）進(jìn)行研究。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)分析（spss22.0），選取對(duì)納米微膠囊包埋率影響較大的因素——花色苷添加量（A）、殼聚糖濃度（B）和攪拌時(shí)間（C），進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)條件優(yōu)化設(shè)計(jì)，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface test factor level design

1.4 結(jié)構(gòu)表征

1.4.1 粒徑及分布情況測定 用LA-920 激光粒度分析儀分析黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊粒徑和分布。

1.4.2 Zeta 電位分析 取定量稀釋至一定倍數(shù)的黑果腺肋花楸花色苷納米懸浮液，采用Zeta 電位分析儀測定25 ℃溶液狀態(tài)下納米粒的表面電位（Zeta），測定3 次，取平均值。

1.4.3 掃描電鏡觀察 通過掃描電鏡觀察黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊的形貌。先將樣品干燥處理，然后置導(dǎo)電膠上，噴金，加速電壓為240 kV，于400 倍鏡下拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 花色苷添加量對(duì)納米微膠囊包埋率的影響

由圖1 可知，花色苷添加量在25～35 mg 時(shí)，包埋率呈上升趨勢；花色苷添加量大于35 mg 時(shí)包埋率開始降低，其峰值為35 mg，此時(shí)包埋率為53.3%。當(dāng)花色苷添加量低于35 mg 時(shí)，芯材與壁材比例較小，未達(dá)到飽和，造成壁材的浪費(fèi)；當(dāng)花色苷添加量過大時(shí)，其包埋率呈下降趨勢。這可能是受提取物中電解質(zhì)的影響，隨著花色苷濃度的增大，電解質(zhì)雜質(zhì)增多，電解質(zhì)的靜態(tài)介電常數(shù)降低，離子間的靜電相互作用隨濃度的增加而增加，促進(jìn)了離子聚集體的形成，不利于花色苷的均勻分散，導(dǎo)致包埋率降低[18]。最終選擇35 mg 為最佳花色苷添加量。

圖1 花色苷添加量對(duì)包埋率的影響Fig.1 The effect of the amount of anthocyanin extract on the embedding rate

2.1.2 殼聚糖濃度對(duì)納米微膠囊包埋率的影響由圖2 可知，殼聚糖質(zhì)量濃度在0.5～2.5 mg/mL 之間，隨濃度的增大包埋率先升后降，當(dāng)殼聚糖濃度為1.5 mg/mL 時(shí)包埋率達(dá)到最大值50.2%。隨著壁材殼聚糖濃度的增大，有利于芯材的包埋，可以適當(dāng)增大包埋率。但當(dāng)濃度過大時(shí)用于包埋芯材的凝膠狀結(jié)構(gòu)的空間體積會(huì)被殼聚糖侵占，而且過量的殼聚糖在溶液中可能會(huì)發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，形成絮狀沉淀，因此會(huì)伴隨著粒徑增大、包埋率降低等問題的出現(xiàn)[22]。因此最佳的殼聚糖質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL。

圖2 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)包埋率的影響Fig.2 The effect of chitosan concentration on the embedding rate

2.1.3 殼聚糖∶聚谷氨酸（CS∶PGA）質(zhì)量比對(duì)納米微膠囊包埋率的影響 CS ∶PGA 質(zhì)量比對(duì)包埋率影響見圖3，當(dāng)CS∶PGA 質(zhì)量比為2∶1 時(shí)包埋率達(dá)到最大值47.8%，整體呈先升后降的趨勢，這與殼聚糖濃度的影響相同。納米微膠囊是帶正電的殼聚糖陽離子與帶負(fù)電的γ-聚谷氨酸陰離子在適宜的pH 下形成穩(wěn)定的納米粒，兩種離子交聯(lián)的強(qiáng)度對(duì)微膠囊的形成具有十分重要的影響，合適的CS ∶PGA 質(zhì)量比不僅能提高其交聯(lián)強(qiáng)度，還能提高體系的穩(wěn)定性，對(duì)包封率和性能造成直接影響[23]。最優(yōu)的CS∶PGA 質(zhì)量比為2∶1。

圖3 CS∶PGA 質(zhì)量比對(duì)包埋率的影響Fig.3 The influence of CS∶PGA quality ratio on the embedding rate

2.1.4 攪拌時(shí)間對(duì)花楸花色苷納米微膠囊包埋率的影響 由圖4 可知，攪拌初期包埋率增大，后期開始下降，在60 min 時(shí)出現(xiàn)峰值。這是因?yàn)楸诓呐c芯材的包埋是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，溶質(zhì)的分散程度對(duì)包埋率和粒徑有重要影響。溶質(zhì)的分散可以通過攪拌來實(shí)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)臄嚢钑r(shí)間有利于花色苷的包埋，這是因?yàn)閿嚢枋谷芤褐械娜苜|(zhì)分散均勻，形成的納米粒粒徑較為均一。如攪拌時(shí)間過短，溶質(zhì)不能均勻分散，造成包埋率較低。如攪拌時(shí)間過長時(shí)，可能因碰撞和聚集等行為破壞已成型的納米粒結(jié)構(gòu)，造成芯材的泄露。選擇最優(yōu)的攪拌時(shí)間為60 min。

圖4 攪拌時(shí)間對(duì)包埋率的影響Fig.4 The influence of mixing time on the embedding rate

綜上，從4 個(gè)單因素來看，CS∶PGA 質(zhì)量比對(duì)包埋率的影響相對(duì)較小，而花色苷添加量、殼聚糖濃度和攪拌時(shí)間對(duì)包埋率影響顯著。后續(xù)試驗(yàn)將CS∶PGA 質(zhì)量比2∶1 作為固定參數(shù)，對(duì)其包埋條件進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果與分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以花色苷添加量（A）、殼聚糖濃度（B）、攪拌時(shí)間（C）為自變量，包埋率（Y）為因變量做響應(yīng)面試驗(yàn)。利用Design-Expert 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

采用Design Expert 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到花色苷添加量、殼聚糖濃度和攪拌時(shí)間與包埋率的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

Y ＝58.09+2.13A-2.15B-0.25C-0.55AB-1.09AC-1.82BC-7.93A2-2.95B2-4.77C2。

由表3 可知，回歸模型差異極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)P 值為0.5243，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明擬合充分。R2=0.9509，表明模型擬合程度好，能預(yù)測其響應(yīng)值，可用該方程預(yù)測包埋率，該試驗(yàn)的變異系數(shù)和信噪比均符合要求。一次項(xiàng)A、B 對(duì)包封率影響顯著（P＜0.05），一次項(xiàng)C 對(duì)包埋率影響不顯著（P＞0.05）；二次項(xiàng)中A2、B2、C23 個(gè)均顯著，且A2極顯著（P＜0.01）；交互相AB、AC、BC 3 個(gè)均不顯著（P＞0.05）?？梢钥闯鲞@些因素對(duì)納米微膠囊包埋率的影響程度不同，其中二次項(xiàng)A2對(duì)納米微膠囊包埋率影響較大。通過條件優(yōu)化可生產(chǎn)出粒徑小而包埋率高的納米微膠囊。工藝參數(shù)對(duì)粒徑和包封率影響大小排序?yàn)锳>B＞C。

表3 獨(dú)立變量響應(yīng)面模型方差分析Table 3 Variance analysis of independent variable response surface model

（續(xù)表3）

采用Design-Expert 8.0 軟件，繪制3 個(gè)因素對(duì)黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊包埋率影響的等高線和響應(yīng)面分析圖（圖5）。

圖5a 是AB 交互作用的關(guān)系圖，從等高線的變化規(guī)律也可看出，在花色苷提取物的添加量和殼聚糖濃度均處于較高水平時(shí)包埋率最大，而當(dāng)一個(gè)因素保持在水平的較小值時(shí)，增加另一個(gè)變量也能使包埋率提高。

圖5b 是AC 交互作用的關(guān)系圖，可以看出當(dāng)花色苷添加量接近34 mg，攪拌時(shí)間接近57 min時(shí)，黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊的包埋率最高，隨著這兩個(gè)參數(shù)的增大，坡度變緩，且等高線圖呈圓形，表明響應(yīng)值對(duì)此交互作用不敏感，這與表3 分析一致，兩者的交互作用不顯著。

圖5c 是BC 交互作用的相關(guān)圖形，與其它兩個(gè)圖相比，其坡度最為陡峭，黑果腺肋花楸花色苷包埋率的變化區(qū)間較小，說明這兩者間的交互作用最為強(qiáng)烈。

圖5 花色苷添加量（a）、殼聚糖濃度（b）、攪拌時(shí)間（c）交互作用對(duì)黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊包埋率影響的等高線及響應(yīng)曲面Fig.5 Contour lines and response surface of the effect of the interaction of the amount of anthocyanin extract（a），chitosan concentration（b），and stirring time（c）on the embedding rate of Sorbus melanocarpa anthocyanin nanocapsules

曲面圖越陡，相互作用越強(qiáng)；越平坦，相互作用越弱。從響應(yīng)面圖可以看出。黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊的包封率隨靠近響應(yīng)曲線中點(diǎn)而逐漸升高，當(dāng)超過中點(diǎn)時(shí)，包埋率開始降低。

2.2.2 響應(yīng)面模型驗(yàn)證 通過Design-Expert 8.0軟件得到黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊的最佳制備條件為：花色苷添加量35.73 mg，殼聚糖質(zhì)量濃度1.31 mg/mL，攪拌時(shí)間60.48 min，在此工藝下黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊的包埋率理論值58.66%。在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，根據(jù)儀器、設(shè)備的精度和操作的可行性，將工藝調(diào)整為花色苷添加量36 mg，殼聚糖質(zhì)量濃度1.3 mg/mL，攪拌時(shí)間60 min。按此條件重復(fù)3 次，取平均值，得包埋率為59.54%，誤差在5%內(nèi)，這說明響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果具有可信度，響應(yīng)面回歸模型可以準(zhǔn)確預(yù)測花色苷納米微膠囊的包埋率。

2.3 表征分析

2.3.1 花色苷納米微膠囊的粒度 在理想情況下，納米微膠囊具有較小的粒徑[24]。通過激光粒度儀分析花色苷納米微膠囊溶液顆粒的散射光強(qiáng)，可以看出納米微膠囊粒度及分布規(guī)律。如圖6 所示，黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊的粒徑分布較為均勻，平均粒徑為317.5 nm。

圖6 花色苷納米微膠囊的粒徑分布圖Fig.6 Particle size distribution diagram of anthocyanin nanocapsules

2.3.2 花色苷納米微膠囊的電位 Zeta 電位的意義在于它的數(shù)值與分子穩(wěn)定性有關(guān)，若溶液中納米微膠囊的Zeta 電位的絕對(duì)值較大，說明微膠囊凝膠狀態(tài)較穩(wěn)定；反之，說明微膠囊分散性較差，易發(fā)生凝結(jié)或凝聚。在最優(yōu)條件即花色苷添加量36 mg，殼聚糖質(zhì)量濃度1.3 mg/mL，攪拌時(shí)間60 min 下制備，微膠囊表面電位呈正電性，平均電位值36.7 mV，具有較好的穩(wěn)定性。

圖7 花色苷納米微膠囊電位分析圖Fig.7 Potential analysis diagram of anthocyanin nanocapsule

2.3.3 花色苷納米微膠囊的掃描電鏡分析 用掃描電鏡觀察處理后的花色苷納米粒表面，在低放大倍數(shù)下能夠觀察到其形態(tài)和分散狀態(tài)，而在高分辨率下能夠觀察到其結(jié)構(gòu)和形貌特征，結(jié)果如圖8 所示。由8a 可看出花色苷納米粒的結(jié)構(gòu)大多為規(guī)則的球形，分散較不均勻，這可能是因粒子間發(fā)生碰撞而引起的凝聚現(xiàn)象[27]。由8b 可知，納米微膠囊是CS 與PGA 通過離子凝膠作用形成，其表面平整，無凹陷和褶皺。在制備過程中，納米微膠囊容易粘連在一起，因此電鏡下的粒徑看上去較大。此外，離子交聯(lián)是個(gè)動(dòng)態(tài)過程，部分花色苷可能吸附在一起，導(dǎo)致納米微膠囊呈現(xiàn)表面光滑、分散不均勻的較規(guī)則球狀，這表明負(fù)載黑果腺肋花楸花色苷的納米粒已經(jīng)形成。

圖8 花色苷納米微膠囊的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron micrograph of anthocyanin nanocapsules

3 結(jié)論

以殼聚糖和聚谷氨酸為復(fù)合壁材制備納米微膠囊。通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化了制備花色苷納米微膠囊的工藝條件，最優(yōu)工藝是：花色苷添加量36 mg、殼聚糖質(zhì)量濃度1.3 mg/mL、攪拌時(shí)間60 min、殼聚糖∶聚谷氨酸質(zhì)量比2∶1、pH 4.5。在此條件下花色苷納米微膠囊包埋率達(dá)59.54%。此包埋率雖在納米微膠囊中屬于較好，但與微米級(jí)膠囊的包埋率一般在90%以上相比，包埋率較低。對(duì)制備的納米微膠囊進(jìn)行表征，激光粒度儀顯示納米微膠囊的粒徑分布較為均勻，平均粒徑為317.5 nm。Zeta 電位儀顯示納米微膠囊表面電位呈正電性，平均電位值為36.7 mV。掃描電鏡觀察黑果腺肋花楸花色苷納米微膠囊外表光滑，呈規(guī)則的球狀。上述結(jié)果表明：所制備的納米粒粒徑較小，穩(wěn)定性較好，具有較好的應(yīng)用前景。后續(xù)可利用紅外光譜儀分析其分子結(jié)構(gòu)和包埋效果。