黑果腺肋花楸汁對(duì)便秘小鼠腸道功能的改善作用

唐曉姝，陳雪梅，胡博，張白曦

（1 江南大學(xué)國(guó)家功能食品工程技術(shù)研究中心 江蘇無(wú)錫214000 2 江南大學(xué)食品學(xué)院 江蘇無(wú)錫 214000）

黑果腺肋花楸（aronia melanocarpa）又稱野櫻莓，富含大量的多酚、花青素、綠原酸、槲皮素等，具有較高的抗氧化性，是植物活性物質(zhì)的主要來(lái)源之一。Jamar 等[1]研究了花青素通過(guò)改善腸道微生物組成來(lái)控制肥胖。也有文獻(xiàn)[2-3]發(fā)現(xiàn)，在腸道微生物代謝過(guò)程中，多酚可分解為具有生物活性的代謝物，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和活性，改善腸道菌群失調(diào)，增加有益菌群和有害菌群的比例，如乳酸菌、變形菌等，從而對(duì)人體產(chǎn)生潛在的生理影響。此外，多酚可以改變腸道菌群的組成，使其朝著對(duì)某些慢性疾病有益的特定微生物種類發(fā)展[4-5]。Yu 等[6]發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸的花青素可以顯著增加擬桿菌屬的相對(duì)豐度，對(duì)腸道菌群有正向調(diào)節(jié)作用。Pei 等[7-8]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，食用黑果腺肋花楸后可通過(guò)抑制炎癥因子來(lái)改善胃腸道健康。Kong 等[9]研究黑果腺肋花楸的多酚對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠肝臟疾病的腸道菌的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸多酚提取物組通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群降低大鼠的體重和肝臟指數(shù)。

本文研究黑果腺肋花楸汁對(duì)小鼠便秘和腸道菌群的改善作用，包括首粒黑便排出時(shí)間、小腸推進(jìn)率和小腸蠕動(dòng)功能等指標(biāo)的改善效果。采用ELASA 試劑盒測(cè)定黑果腺肋花楸汁對(duì)便秘小鼠血清中興奮性遞質(zhì)和抑制性遞質(zhì)分泌量的影響，同時(shí)引入16S r RNA 技術(shù)評(píng)價(jià)其對(duì)便秘前、后小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，從腸道激素含量和腸道菌群角度探明黑果腺肋花楸汁改善小鼠便秘的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品及藥品：黑果腺肋花楸，吉林遼源市；鹽酸洛哌丁胺≥98.0%、活性炭粉10～100 目，上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；阿拉伯樹(shù)膠，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃動(dòng)素測(cè)試盒、胃泌素試劑盒、P物質(zhì)試劑盒、內(nèi)皮素-1 測(cè)試盒、血管活性腸肽試劑盒、生長(zhǎng)抑素測(cè)試盒，南京森貝伽生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無(wú)特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)BALB/c 的雄性小鼠，18～22 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

環(huán)境及飼料：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障設(shè)施中飼養(yǎng)；維持飼料、墊料，江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME3002E 電子天平，梅特勒-托利多公司；DYCP-31DN 型瓊脂糖水平電泳儀，北京六一生物科技有限公司；ND2000 光度計(jì)，賽默飛世爾科技公司；ABI GeneAmp9700 型PCR 儀，愛(ài)普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Quantus TM 高靈敏熒光計(jì)，美國(guó)普洛麥格（Promega）公司；NovaSeq 6000 測(cè)序平臺(tái)，美國(guó)Illumina 公司；5424R 高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 黑果腺肋花楸，棄腐爛、破損的果實(shí)，用純水洗凈、晾干。將其用膠體磨破碎制成果漿，包裹在紗布中，擠壓，過(guò)200 目篩，離心（3 200 g/min，5 min）得到黑果腺肋花楸汁，4 ℃儲(chǔ)存。

1.3.2 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)周期 實(shí)驗(yàn)設(shè)為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、黑果腺肋花楸汁低、中、高劑量組，每組10 只動(dòng)物。黑果腺肋花楸汁低、中、高劑量組小鼠分別給予劑量為5，10 mL/kg BW 和20 mL/kg BW，換算成60 kg 成人服用量約為60 mL/d 的5，10 倍和20 倍。受試樣品、飲用水均經(jīng)口灌胃，連續(xù)14 d。

本實(shí)驗(yàn)28 d，前7 d 為適應(yīng)期，后21 d 為干預(yù)期。第7 天隨機(jī)收集未干預(yù)的小鼠糞便10 份（灌胃前空白組BBL）；第21 天分別收集干預(yù)后造便秘模型前的小鼠糞便（灌胃后空白組ABL，灌胃后低劑量組AL，灌胃后中劑量組AM，灌胃后高劑量組AH）及造便秘模型模后的小鼠糞便（灌胃后模型空白組AMBL，灌胃后模型中劑量組AMM，灌胃后模型高劑量組AMH），每組糞便5 份，快速放入-80℃冰箱保存。第21 天做排便實(shí)驗(yàn)；第28 天做小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 排便和小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) 參照本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的文獻(xiàn)[10]中小腸運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、排便實(shí)驗(yàn)方法。

1.3.4 便秘小鼠血清中胃腸調(diào)節(jié)肽的測(cè)定 取小鼠眼球血1.5 mL，4 ℃、3 500 r/min 離心10 min，取血清，用ELISA 試劑盒測(cè)定血清中胃腸調(diào)節(jié)肽的含量，按照說(shuō)明書中的操作步驟操作。對(duì)小鼠血清中Gas、MTL、SP、ET-1、SS 和VIP 的線性回歸方程R2均大于0.99。

1.3.5 便秘前、后小鼠糞便菌群的測(cè)定 采集小鼠糞便后封存于干燥、無(wú)菌的收集管中，在干冰冷凍條件下送至上海唯那生物科技有限公司進(jìn)行微生物總DNA 的抽提、質(zhì)檢。取適量質(zhì)控合格的總DNA，使用 338F（5' -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG -3'）引物和 806R（5' -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物進(jìn)行16S rDNA V3～V4 區(qū)域目標(biāo)片段的PCR 擴(kuò)增。根據(jù)Illumina NovaSeq 6000 平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 250 文庫(kù)并進(jìn)行雙末端測(cè)序。下機(jī)的fastq 數(shù)據(jù)經(jīng)fastp 軟件（version 0.21.0）質(zhì)控后，使用QIIME 軟件流程進(jìn)行OTU 聚類、α 多樣性分析、β 多樣性分析以及菌群變化差異分析等。測(cè)序數(shù)據(jù)雙末端拼接后，根據(jù)分類置信度為0.7 的閾值進(jìn)行聚類，序列相似度大于等于97%的被認(rèn)為是同一種OTU，從中挑選出最長(zhǎng)的序列，作為OTU 的代表序列。核酸處理、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序工作由上海唯那生物科技公司完成。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 測(cè)序部分?jǐn)?shù)據(jù)通過(guò)LEfSe 分析對(duì)樣品的物種組成做差異顯著性檢驗(yàn)，并用STAMP 軟件比較組間的功能差異。其它數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS（statistics 20）軟件做方差齊性檢驗(yàn)，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各類統(tǒng)計(jì)圖的繪制使用R 語(yǔ)言（version 4.0.3）、Origin8.0 和Excel 完成。除特別說(shuō)明外，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果腺肋花楸汁對(duì)便秘小鼠排便參數(shù)的影響

用鹽酸洛哌丁胺進(jìn)行便秘小鼠造模，鹽酸洛哌丁胺會(huì)抑制腸道平滑肌收縮，減少腸蠕動(dòng)，模擬胃腸動(dòng)力障礙，從而引起便秘[11]。由表1 可知，與ABL 組比較，AMBL 組小鼠給予洛哌丁胺后，首粒黑便排便時(shí)間明顯延長(zhǎng)，5 h 內(nèi)排黑便粒數(shù)明顯減少，黑便質(zhì)量降低，表明小鼠便秘模型建立成功。

表1 黑果腺肋花楸汁對(duì)小鼠排便實(shí)驗(yàn)的影響Table 1 Effect of aronia melanocarpa juice on the relaxing the bowels experiment

與AMBL 組相比，黑果腺肋花楸汁的AML、AMM、AMH 3 個(gè)劑量組均不同程度地縮短便秘小鼠的首粒黑便排便時(shí)間，增加5 h 內(nèi)排黑便粒數(shù)。除AML 組外，AMM、AMH 組5 h 內(nèi)排便質(zhì)量也顯著增加。黑果腺肋花楸劑量組的糞便軟硬度適中，成形性良好，表明其較好地改善便秘小鼠的潤(rùn)腸通便情況，小鼠狀態(tài)與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異。

2.2 黑果腺肋花楸汁對(duì)便秘小鼠小腸推進(jìn)率的影響

測(cè)量和計(jì)算小鼠的小腸推進(jìn)率，如表2 所示。與ABL 組比較，AMBL 組小鼠給予洛哌丁胺后，小腸的墨汁推進(jìn)率顯著降低，提示小鼠便秘模型建模成功。與AMBL 組比較，黑果腺肋花楸汁劑量組小鼠的小腸推進(jìn)率均有不同程度地提高，其中AML、AMH 組小腸推進(jìn)率提高了40%以上，差異性達(dá)極顯著水平，說(shuō)明黑果腺肋花楸汁通過(guò)促進(jìn)便秘小鼠小腸蠕動(dòng)，緩解便秘癥狀。

表2 黑果腺肋花楸汁對(duì)小鼠小腸推進(jìn)率的影響Table 2 Effect of aronia melanocarpa juice on the intestine pushing rate experiment

2.3 黑果腺肋花楸汁對(duì)調(diào)節(jié)便秘小鼠血清胃腸激素的影響

便秘相關(guān)的胃腸激素分布在胃腸黏膜細(xì)胞之間，是胃腸道黏膜層和胰腺的內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)，可調(diào)控胃腸道運(yùn)動(dòng)，具有興奮和抑制兩種作用[12]。其中MTL、Gas、SP 為興奮性遞質(zhì)，它們能促進(jìn)胃的收縮，加速腸道傳輸時(shí)間，促進(jìn)胃腸內(nèi)容物運(yùn)行，對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)起興奮作用；ET-1、SS、VIP 為抑制性遞質(zhì)，可以抑制胃腸激素的釋放，減緩小腸通過(guò)時(shí)間，抑制胃腸排空等[13-14]。

圖1 中，便秘小鼠AMBL 組的血清興奮性遞質(zhì)（GAS、MTL 和SP）的分泌量顯著低于ABL 組，給予黑果腺肋花楸汁的AML、AMM、AMH 3 個(gè)劑量組便秘小鼠的興奮性遞質(zhì)分泌量均有一定的回升，MTL中的AMM 組，GAS中的AMM 和AMH組和SP 中的AMH 組，與便秘模型組AMBL 比較，均有顯著性差異。便秘小鼠AMBL 血清抑制性遞質(zhì)（SS、ET-1 和VIP）的分泌量顯著高于BBL組，給予黑果腺肋花楸汁的AML、AMM、AMH 3個(gè)劑量組便秘小鼠的抑制性遞質(zhì)分泌量均有顯著的回落，說(shuō)明黑果腺肋花楸汁能顯著促進(jìn)小鼠興奮性遞質(zhì)的分泌量，降低抑制性遞質(zhì)的分泌量，并具有一定的劑量相關(guān)性。

圖1 黑果腺肋花楸汁對(duì)調(diào)節(jié)便秘小鼠血清中胃腸肽含量的影響Fig.1 Effect of aronia melanocarpa juice on the content of gastrointestinal hormones in serum of constipated mice

2.4 黑果腺肋花楸汁對(duì)便秘前、后小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 對(duì)便秘前、后小鼠腸道菌群多樣性的影響

物種多樣性（Alpha diversity）指單個(gè)樣品中物種多樣性，包括Chao 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson指數(shù)等。Chao 指數(shù)反映樣品中菌落的豐富度，即簡(jiǎn)單指群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個(gè)物種的豐富情況，它能夠估計(jì)樣品群落包含的物種總數(shù)，同時(shí)反映群落中低豐度物種的存在情況，是常用的計(jì)算菌群豐富的指數(shù)之一[15]。圖2a 所示，與BBL 組和ABL 組比較，黑果腺肋花楸汁組（AM 組和AH 組）的Chao 指數(shù)顯著升高，推測(cè)黑果腺肋花楸汁增加了小鼠腸道菌群的物種總數(shù)。

Shannon 和Simpson 指數(shù)反映群落的多樣性。通常群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數(shù)越大；若一個(gè)群落中優(yōu)勢(shì)菌種占得多，其它非優(yōu)勢(shì)菌種占比減少，則該物質(zhì)的Simpson 指數(shù)數(shù)值越大[15]。圖2b、2c 中，與BBL 組和ABL 組比較，黑果腺肋花楸汁組（AM 組和AH 組）的Shannon和Simpson 指數(shù)分別顯著上升和下降，表明黑果腺肋花楸汁可以增加小鼠腸道群落的多樣性，使菌群種類分布得更均勻。

圖2 各組腸道菌群的Alpha 多樣性指數(shù)Fig.2 Alpha-diversity indexes of gut microbiotas in each group

Coverage 指數(shù)反映測(cè)序深度，數(shù)值越高，樣本中序列越易被測(cè)出。由圖2d 可知，各組的Coverage 指數(shù)均大于0.99，表明此次測(cè)序深度基本達(dá)到樣品中的所有物種。

基于QIIME 軟件計(jì)算Beta 多樣性，通過(guò)Beta多樣性指數(shù)比較各組微生物組成的差異?；跇颖局形锓N的組成結(jié)構(gòu)和豐度信息在OTU 水平上，進(jìn)行主坐標(biāo)分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）。采用unweightedUniFrac 距離算法，選取貢獻(xiàn)率最大的主坐標(biāo)組合作圖（圖3），圖中各點(diǎn)距離越近，樣品的物種組成越相似。在OUT 分類水平上，各組中的組內(nèi)平行樣本都能較好地聚在一起，說(shuō)明組內(nèi)樣本間具有較高的一致性。給予受試物后的6 個(gè)組與BBL 組距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明經(jīng)14 d的喂養(yǎng)，小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)分布有明顯改變；與ABL 組相比，AM、AH 組微生物群落沿第2 主坐標(biāo)（PC2）正向偏移，說(shuō)明受試黑果腺肋花楸汁的小鼠腸道菌群的物種組成結(jié)構(gòu)有顯著變化；與AMBL組相比，AMM、AMH 組微生物群落沿第1 主坐標(biāo)（PC1）遠(yuǎn)離模型AMBL 組，更接近AM、AH 組，推測(cè)中、高劑量的便秘小鼠能夠通過(guò)受試黑果腺肋花楸汁改變腸道菌群的分布，改善腸道菌群失調(diào)，緩解便秘。

圖3 各組腸道菌群結(jié)構(gòu)PCoA 分析Fig.3 PCoA analysis of intestinal flora structure in in each group

2.4.2 門水平分類下各組物種組成情況 在門分類水平下，分析各組腸道菌群群落組成的相對(duì)豐度，由圖4a 所示：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）均為優(yōu)勢(shì)菌門，是各組小鼠腸道菌群的主要組成部分，平均占比在90%以上。其次為脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、變形菌門（Proteobacteria）、脫鐵乳桿菌（Deferribacterota）、疣 微菌門（Verrucomicroblota）等。

厚壁菌門與擬桿菌門相對(duì)豐度比值（F/B）可在一定程度上作為反映腸道菌群紊亂的重要指標(biāo)[16]。高脂飲食會(huì)使F/B 的比值增加[17]。肥胖個(gè)體中F/B 的比值較高，體重減輕與F/B 降低有關(guān)[18-19]。在肥胖模型中，F(xiàn)/B 改變可能與腸道微生物的代謝潛力相關(guān)，F(xiàn)/B 降低可能會(huì)提高微生物從膳食中獲取能量的能力，有利于控制肥胖[20-21]。

分析黑果腺肋花楸汁受試前、后小鼠腸道中F/B（圖4b），與ABL 組比較，給予14 d 黑果腺肋花楸汁的AH、AM 組的F/B 平均值均顯著減小，說(shuō)明飲用富含大量多酚類活性物質(zhì)的黑果腺肋花楸，對(duì)改善腸道微生物，調(diào)節(jié)體重等有一定的幫助，具體機(jī)制需進(jìn)一步驗(yàn)證。

大多數(shù)變形菌門是致病性革蘭氏陰性菌，細(xì)菌中最大的一門，包括很多病原菌，當(dāng)它們超過(guò)正常水平時(shí)，與炎癥疾病有關(guān)。通常，變形菌門作為腸道菌群紊亂和潛在疾病的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)數(shù)量處于較低水平時(shí)，表示腸道環(huán)境健康良好[15，22]。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示（圖4c），經(jīng)14 d 的喂養(yǎng)，ABL 組的變形菌門豐度顯著增加；與ABL 組比，AH、AM 組的豐度顯著降低；造便秘模型后，AMBL 組、AMH 組和AMM 組的變形菌門富集程度大幅度提升，然而，與AMBL 組比較，受試物AMH、AMM 組的豐度顯著降低，說(shuō)明黑果腺肋花楸汁可以降低便秘前、后小鼠腸道中的變形菌門豐度，使小鼠的腸道環(huán)境向更健康的方向發(fā)展。

圖4 “門”水平下黑果腺肋花楸汁對(duì)小鼠腸道菌群群落的影響Fig.4 Effects of aroniamelanocarpa juiceon intestinal flora of mice at portal level

2.4.3 屬水平分類下各組物種組成情況 基于注釋出來(lái)的物種組成信息表，使用R 語(yǔ)言程序包繪制不同組別的小鼠糞便樣品屬水平菌群組成分布圖（圖5a）。乳桿菌屬（Lactobacillus）是一種存在于體內(nèi)的乳桿菌屬益生菌，可將碳水化合物發(fā)酵成乳酸，有助于人體腸道健康。圖5b 可看出，與BBL組比較，14 d 后ABL、AM 和AH 組中乳桿菌屬豐度顯著性增加。其中ABL 組中的乳桿菌屬占40.8%，而AM 和AH 組的乳桿菌屬雖僅占12.8%，16.5%，但其它菌屬豐度均變得豐富。造便秘模型后AMBL 組中乳桿菌屬豐度顯著下降，AMM 和AMH 組對(duì)比AM 和AH 組略有下降，未有顯著性。推測(cè)黑果腺肋花楸汁可以調(diào)節(jié)便秘小鼠腸道中有益菌乳桿菌屬的含量，緩解便秘癥狀。

在革蘭氏陽(yáng)性菌中，葡萄球菌屬（Staphylococcus）是最常見(jiàn)的化膿性球菌，是導(dǎo)致醫(yī)院交叉感染的主要致病菌[23]。圖5c 中，BBL 組的葡萄球菌屬占近50%，經(jīng)14 d 的喂養(yǎng)，葡萄球菌屬豐度顯著降低（ABL、AM、AH 組），造便秘模型后的AMBL 組中葡萄球菌屬豐度又顯著增加，而造便秘模型后一直給予黑果腺肋花楸汁受試物的AMM、AMH 組中葡萄球菌屬豐度相比AMBL 組顯著降低，且呈量效關(guān)系。表明經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的喂養(yǎng)，原腸道菌群中葡萄球菌屬得以改善，推測(cè)便秘會(huì)導(dǎo)致小鼠腸道菌群中葡萄球菌屬的豐度會(huì)增加，而受試黑果腺肋花楸汁樣品后可改善葡萄球菌屬的豐度。

圖5 “屬”水平下黑果腺肋花楸汁對(duì)小鼠腸道菌群群落的影響Fig.5 Effects of aroniamelanocarpa juice on intestinal flora of mice at genera level

3 結(jié)論

用鹽酸洛哌丁胺進(jìn)行便秘小鼠造模成功，通過(guò)小腸推進(jìn)率、首粒黑便排出時(shí)間、小腸蠕動(dòng)功能等指標(biāo)評(píng)價(jià)小鼠的通便功能。為探究黑果腺肋花楸汁改善便秘的原因，對(duì)小鼠血液中的胃腸激素含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸汁通過(guò)增加興奮性遞質(zhì)，降低抑制性遞質(zhì)而促進(jìn)小鼠通便。高通量測(cè)序結(jié)果表明，黑果腺肋花楸汁可以增加小鼠腸道菌群的多樣性，使腸道菌更加豐富、均勻，并可改善菌群分布，改善腸道菌群失調(diào)。在門水平上，黑果腺肋花楸汁可使厚壁菌門與擬桿菌門豐度比值顯著下降，并改善便秘前、后變形菌門的豐度。在屬水平上，黑果腺肋花楸汁可顯著增加便秘后小鼠乳酸桿菌屬的豐度，降低便秘前、后小鼠的葡萄球菌屬豐度。

綜上所述，黑果腺肋花楸汁對(duì)便秘小鼠具有較好的通便功能。推測(cè)每日飲用60 mL 的黑果腺肋花楸汁，可以調(diào)節(jié)胃腸激素含量，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加腸道中的有益菌，降低致病菌。黑果腺肋花楸汁在改善便秘、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)方面具有一定潛力，本研究結(jié)果為黑果腺肋花楸汁制備相關(guān)的功能性食品提供了理論依據(jù)。