細胞培養(yǎng)肉支架材料與組織成型研究進展

劉東紅，利婕，牛瑞浩，忻啟譜，朱青青，徐恩波

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 杭州310058 2 浙江大學(xué) 智能食品加工技術(shù)與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室 杭州310058 3 浙江大學(xué) 長三角智慧綠洲創(chuàng)新中心 浙江嘉興314102 4 浙江大學(xué) 南方果蔬保鮮技術(shù)集成科研基地 杭州310058 5 浙江大學(xué)馥莉食品研究院 杭州 310058）

全球肉類消費需求量增長與肉制品生產(chǎn)力限制的不平衡問題日益凸顯。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）預(yù)測，到2050 年，全球肉類需求將達到4.55 億t；對比2018—2020 年，未來10 年全球肉類蛋白質(zhì)消費量將增長14%[1]?，F(xiàn)有肉類生產(chǎn)供應(yīng)鏈存在諸多隱患，如人畜共患病（如尼帕病毒、甲型流感）擴大風(fēng)險，COVID-19 疫情爆發(fā)影響肉類加工廠等[2]。此外，畜牧業(yè)產(chǎn)生的甲烷（動物腸道和糞便發(fā)酵）和一氧化二氮是最主要的溫室氣體，前者對全球變暖的影響比二氧化碳高28 倍[3]。而到2025 年，世界人口預(yù)計超過90 億，這意味著食物、水、耕地需求將持續(xù)過載[4]。與動物肉相比，細胞培養(yǎng)肉有助于人類在解決饑餓問題的同時，保護水源、土地和能源。因此，細胞培養(yǎng)肉作為替代蛋白來源之一，被賦予解決當(dāng)前肉業(yè)生產(chǎn)效能不足以及公共衛(wèi)生、環(huán)境退化和動物福利等諸多社會問題的新使命。

細胞培養(yǎng)肉也稱人造肉，是一種通過組織工程技術(shù)生產(chǎn)的仿真模擬肉類，最初依賴于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域干細胞生物學(xué)和組織工程學(xué)基礎(chǔ)（如誘導(dǎo)性多能干細胞、體外骨骼肌移植等），并通過交叉技術(shù)迭代實現(xiàn)可食用肉類組織的細胞培養(yǎng)發(fā)展。細胞培養(yǎng)肉的歷史可追溯到1999 年，被譽為“細胞培養(yǎng)肉教父”的威廉·范·埃倫（Willem van Eelen）申請了第1 項細胞培養(yǎng)肉專利。2013 年，馬斯特里赫特大學(xué)的Mark 教授展示了首個培養(yǎng)肉漢堡，85 g 造價卻高達330 000 美元[5]。之后，細胞培養(yǎng)肉產(chǎn)業(yè)開始蓬勃發(fā)展，其生產(chǎn)流程也逐漸明確并主要涉及4 個部分：1）肌肉、脂肪細胞（或內(nèi)皮細胞）的分離和培養(yǎng)；2）增殖和分化培養(yǎng)基配方的研制；3）支架材料的篩選和優(yōu)化；4）組織化成型方式的設(shè)計。如今，越來越多商業(yè)公司為畜禽肉類（如豬肉、牛肉、雞肉等）和海洋食品的肉類替代物提供了開發(fā)方案，學(xué)術(shù)界也對此迸發(fā)出強烈的研究熱情，致力于高密度、批量化以及營養(yǎng)全面、質(zhì)構(gòu)風(fēng)味近似的培養(yǎng)肉科學(xué)基礎(chǔ)研究。

然而，我國細胞培養(yǎng)肉研發(fā)仍處于起步階段，有不少重大技術(shù)挑戰(zhàn)尚未解決，如高傳代及永生化細胞系建立、多階段生長培養(yǎng)基優(yōu)化、高通量生物反應(yīng)器設(shè)計、仿生細胞支架構(gòu)建等技術(shù)[6]。其中，培養(yǎng)肉細胞支架旨在支持自然組織中細胞結(jié)構(gòu)和功能的細胞外基質(zhì)（ECM）的結(jié)構(gòu)模擬，在一定程度上模仿其生化特征，并促進其形成具有肉類力學(xué)特性組織[7]。細胞培養(yǎng)肉支架技術(shù)更新發(fā)展迅速，各種新型的組織成型方法不斷涌現(xiàn)。本文介紹培養(yǎng)肉三維培養(yǎng)的各種支架材料及細胞感知機制，探討細胞肉組織成型的最新技術(shù)及所面臨的挑戰(zhàn)，為培養(yǎng)肉的支架選擇和組織成型技術(shù)提供科學(xué)參考。

1 細胞感知與三維培養(yǎng)

1.1 三維培養(yǎng)細胞的力學(xué)感知

細胞體外三維培養(yǎng)（3D culture）是組織工程和類器官制造的基礎(chǔ)，也是細胞培養(yǎng)肉形成具有一定力學(xué)性質(zhì)的支撐性結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，其體外三維培養(yǎng)模型中細胞的生長環(huán)境更加接近真實組織內(nèi)的微環(huán)境。在傳統(tǒng)二維培養(yǎng)（2D）過程中，單層細胞一般在平坦的固體表面生長，然而，細胞的接觸抑制行為，很難在孔板平面上形成復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，并且二維平面的硬度大于胞外基質(zhì)硬度，貼壁后的細胞被過度拉伸后會導(dǎo)致細胞基因與蛋白質(zhì)的異常表達，使其形態(tài)差別于組織中真實細胞形態(tài)[8]。三維培養(yǎng)時細胞支架充當(dāng)了體內(nèi)細胞外基質(zhì)的角色，其首要作用是為三維空間中的細胞黏附提供一定的力學(xué)支撐，從而促進三維組織的形成。

三維環(huán)境中細胞感知支架強度，進而著床并分化為不同組織的過程被稱為 “機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制”（如圖1 所示）[9]。機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制能夠使細胞感知機械刺激并作出反應(yīng)，從而調(diào)整胞內(nèi)成分以滿足不同胞外微環(huán)境硬度需求。細胞外基質(zhì)蛋白與細胞膜上的特異性序列結(jié)合，進而與細胞核建立物理連接，并啟動從細胞骨架到細胞核的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。細胞膜表面機械受體即整聯(lián)蛋白[10]，通過ECM中常見的RDG 序列（由精氨酸、甘氨酸和天冬氨組合而成）[11]來感知ECM 硬度（壓/拉伸應(yīng)力誘導(dǎo)的ECM 形變）和流體流動（間質(zhì)流體的剪切應(yīng)力）的變化。為了平衡膜黏附蛋白與微絲、微管之間的錯位力，細胞激活肌動球蛋白介導(dǎo)的收縮并重新排列細胞骨架。在機械轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，細胞骨架網(wǎng)絡(luò)充當(dāng)“橋梁”的作用，將細胞-胞外基質(zhì)界面產(chǎn)生的機械張力傳導(dǎo)到細胞核。

圖1 細胞中的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制示意圖[9]Fig.1 Schematic representation of mechanotransduction mechanisms in cells[9]

1.2 支架結(jié)構(gòu)與細胞行為

細胞支架除為細胞黏附提供一定的力學(xué)支撐外，還為細胞提供足夠的生長空間以及物質(zhì)交換通道。雖然支架的組成和表面化學(xué)性質(zhì)決定其細胞生物相容性，但是支架的結(jié)構(gòu)特征如孔徑、形態(tài)和孔隙度等，對細胞的黏附、增殖、遷移和分化能力也起著重要的調(diào)節(jié)作用[12]。除了允許細胞穿透外，支架結(jié)構(gòu)還將允許營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣流入，并利于去除細胞產(chǎn)生的廢物以增加細胞存活率。Griffon 等[13]發(fā)現(xiàn)較小的孔徑（＜100 μm）使細胞最大程度黏附，播種3 d 后觀察到較多的細胞數(shù)量。中等尺寸的孔徑（100～300 μm）更有利于細胞增殖分化，長期培養(yǎng)后細胞數(shù)量增多且檢測到更多的分化標(biāo)志物。然而，孔徑過大反而會導(dǎo)致細胞數(shù)量減少。Lee 等[14]向500 μm 孔徑支架中播種細胞，在7d 后幾乎觀察不到細胞，這說明在靜態(tài)播種條件下，大孔徑雖然會增加細胞在空間中的穿透能力，但是也相應(yīng)地減小了細胞和支架間的相互作用，導(dǎo)致細胞難以附著。此外，支架的孔隙形態(tài)同樣會對細胞行為造成影響，如Caliari 等[15]使用馬肌腱細胞，通過定向凝固膠原蛋白-糖胺聚糖支架重建了三維的肌腱組織平臺。在此定向孔支架上培養(yǎng)肌腱細胞，可觀察到更強的細胞附著、代謝活性和排列能力。這可能是由于定向孔中的細胞更具流動性，能為細胞擴散和增殖提供更大空間，同時保持均勻的營養(yǎng)供應(yīng)，進而增強細胞活性。與此相反，孔隙率較小的支架不能為細胞提供充足空間使細胞遷移和增殖，從而導(dǎo)致細胞聚集并因此呈現(xiàn)較低的活性。

從生物學(xué)的角度來看，大孔隙率的支架結(jié)構(gòu)在細胞穿透并防止細胞溢出方面起著關(guān)鍵作用。適當(dāng)?shù)奈⒖紫独跔I養(yǎng)物質(zhì)的交換，并能吸附充足的特定蛋白質(zhì)來滿足細胞的生長需求。然而，較大的孔隙率不利于保持機械性能，隨著孔隙率的增加，機械性能往往呈指數(shù)下降[16]?？傊?，對于細胞培養(yǎng)肉而言，因不同種動物的組織結(jié)構(gòu)及機械性質(zhì)差異，故滿足相應(yīng)種子細胞最適生長條件的三維支架制造仍需進行大量測試驗證。

2 細胞培養(yǎng)支架材料

2.1 支架材料選擇的一般性原則

術(shù)語“支架”最早出現(xiàn)在組織工程領(lǐng)域，指經(jīng)過加工的具有適當(dāng)形狀、尺寸、物理性質(zhì)的結(jié)構(gòu)材料，其與細胞、生長因子和其它生物活性分子結(jié)合，促進組織修復(fù)和再生[17]。因此，支架作為一種三維的細胞培養(yǎng)平臺，通過再現(xiàn)細胞的原生三維微環(huán)境，促進更自然的細胞行為和組織形成。作為組織形成的模板，支架材料通常模擬細胞外基質(zhì)，保證細胞的有效黏附、增殖和分化[18]。除生物相容性外，組織工程支架材料性能優(yōu)化通常還集中在生物降解性，以及包括孔隙率、材料強度、可變結(jié)構(gòu)與形態(tài)等[19]。

在細胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，由于肉類的主要成分是肌細胞形成的肌纖維組織及脂肪細胞形成的脂質(zhì)，因此培養(yǎng)肉的支架材料側(cè)重于通過多種細胞共培養(yǎng)和支架結(jié)構(gòu)適度支撐的方式來培養(yǎng)骨骼肌組織。這與再生醫(yī)學(xué)中生物人工肌肉研究領(lǐng)域有著類似的技術(shù)原則[20]。同時，支架材料也必須是多孔結(jié)構(gòu)，以滿足連續(xù)的介質(zhì)灌注要求，從而模擬自然組織的血管。此外，細胞培養(yǎng)肉的支架應(yīng)有助于產(chǎn)品形成的理想感官特性，并具備可食用安全性（尤其是支架作為最終產(chǎn)品的部分組織）。支架也可通過培養(yǎng)或后續(xù)加工中移除的方式，避免在最終產(chǎn)品中殘留[21]。綜上，細胞培養(yǎng)肉支架材料應(yīng)滿足多孔性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、適度的支架結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能、良好的加熱性質(zhì)等要求（圖2a）。而根據(jù)支架材料最終的應(yīng)用形態(tài)，可以分為水凝膠支架、脫細胞的組織或器官，以及包括三維多孔支架、纖維和微球支架在內(nèi)的其它預(yù)成型支架[22]。

2.2 水凝膠支架

水凝膠是一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚合物材料，可以容納大量的水分子。其制備方式包括共價鍵合、光化聚合、高溫凝膠、低溫凝膠以及其它方式如物理交聯(lián)、疏水相互作用、靜電作用、結(jié)晶或氫鍵結(jié)合等（圖2b）[23]。水凝膠材料通常具有生物相容性良好，機械性能可調(diào)節(jié)，降解率可預(yù)測等優(yōu)點[24-25]。同時，其與細胞外基質(zhì)含水量以及自然組織力學(xué)性能相似，可為種子細胞提供一個良好的遷移增殖分化平臺[26]。此外，水凝膠良好的親水性[27]，其物理空間封裝細胞的能力顯著，因而在干細胞三維培養(yǎng)領(lǐng)域有著廣泛的研究。例如，水凝膠用于脂肪源性干細胞的培養(yǎng)，目前已在成骨分化、肌肉再生、心臟分化、神經(jīng)分化、皮膚再生等領(lǐng)域發(fā)揮作用[23]。此外，F(xiàn)uruhashi 等[28]在水凝膠模塊中制造毫米厚的牛肌肉組織，其肌管沿長軸方向排列，可在電刺激的作用下收縮，具有適當(dāng)?shù)娜忸惿硖匦院褪澄锾匦浴?/p>

圖2 （a）培養(yǎng)肉支架的基本制造條件[21]；（b）細胞相容性水凝膠及其細胞界面復(fù)雜的化學(xué)相互作用[33]Fig.2 （a）General conditions of manufacturing cultured meat scaffolds[21]；（b）Multiple chemical interactions in the complexity of cytocompatible hydrogels and their cell interfaces[33]

天然水凝膠及其衍生材料包括明膠、膠原蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽、透明質(zhì)酸等，具有細胞信號傳導(dǎo)能力，可以在細胞間產(chǎn)生相互作用，然而，仍存在機械強度低，結(jié)構(gòu)降解不受控制，免疫原性未知等問題。膠原水凝膠可對同種或異種移植細胞進行保存和免疫保護[29]。海藻酸鹽水凝膠珠包裹的軟骨細胞顯示出高活力，軟骨基質(zhì)沉積，低水平的軟骨細胞肥大，在培養(yǎng)7 d 內(nèi)細胞增殖逐漸增加，并通過相應(yīng)的信號和激素刺激后模擬了天然生長板軟骨的組織結(jié)構(gòu)，建立了一種可調(diào)的體外系統(tǒng)[30]。

合成水凝膠材料包括聚乙二醇、聚乙烯醇等，這些材料降解性能和微觀結(jié)構(gòu)雖可控，但缺乏相應(yīng)的生物組分[31]。因此，天然材料和合成材料改性復(fù)配制備支架的方法引起廣泛的關(guān)注。甲基丙烯酸明膠水凝膠結(jié)合了天然和合成水凝膠的優(yōu)點，保留了明膠的大部分功能氨基酸基序，可以通過定制合成工藝或添加各種天然或化學(xué)合成的生物材料來滿足特定的生物功能和機械可調(diào)性要求，目前已可以保證誘導(dǎo)多能性干細胞、間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞等多種干細胞移植與組織修復(fù)時的活性[32]。然而，在細胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，甲基丙烯酸明膠水凝膠尚存在培養(yǎng)殘留與食用安全性問題。

2.3 脫細胞組織、器官支架

脫細胞的組織或器官是指通過化學(xué)（表面活性劑、酸、堿）或酶（如胰蛋白酶）或機械力（如凍融、攪拌、超聲、超臨界CO2、靜水壓力）等方式分離和移除細胞成分[34]，殘余骨架即天然細胞外基質(zhì)材料作為三維支架。動物來源的脫細胞組織的主要成分是膠原蛋白、層交連蛋白和纖維連接蛋白[35]；植物來源的主要成分則是纖維素骨架、果膠和半纖維素[36]。以上成分在其研究中均被證明具有細胞相容性。

由于肌肉組織生長的定向特性，細胞培養(yǎng)肉為了實現(xiàn)組織成型需要肌肉纖維的單向排列，研究表明在分化前對齊成肌細胞有利于生成排列的肌管[37]。而排列的方法包括用電或機械的主動刺激，以及被動調(diào)節(jié)支架力學(xué)性能，如改變剛度，引入促進細胞排列的表面路徑等[38，39]。如圖3a 所示，去細胞和脫鈣的魚鱗衍生支架表面存在徑向凹槽和環(huán)脊，可以模擬細胞培養(yǎng)的三維微環(huán)境，同時魚鱗主要成分是羥基磷灰石和Ⅰ型膠原纖維，與骨細胞外基質(zhì)相似，利于細胞擴散和增殖。結(jié)果表明，魚鱗具有較高的細胞相容性，可增強細胞黏附和增殖，并引導(dǎo)細胞沿脊通道遷移[40]。脫細胞植物葉保留了其自然的條紋形貌，可以支持成肌細胞的貼附、增殖、排列和分化；肌細胞單軸自排列，這一特征在分化成肌管后仍可保留，為骨骼肌和其它各向異性組織培養(yǎng)提供了一種廉價、可持續(xù)的支架制造方法[22]。

2.4 其它預(yù)成型功能支架

2.4.1 三維多孔支架 用水凝膠包覆肌細胞制備的培養(yǎng)肉，與傳統(tǒng)肉品質(zhì)相比還有一定差距[41]。具有特定形狀和相連孔徑結(jié)構(gòu)的三維多孔支架模型，不僅可以控制空間形狀，還可確保氣體、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的交換[42]，在制備高度結(jié)構(gòu)和有組織的肉類中具有極大優(yōu)勢。三維多孔支架可以通過冷凍干燥、靜電紡絲、3D 打印、熔融沉積、溶劑澆鑄等技術(shù)加工而成[21]。制備支架的材料可分為天然材料（如食品動物源和植物源的多糖及蛋白）、合成材料（如聚乳酸等聚合物以及體外重組蛋白等）[43]。例如，利用殼聚糖和海藻酸鈉靜電相互作用，通過冷凍干燥制備3D 可食用殼聚糖-海藻酸鈉-膠原/明膠支架。該支架具有外部多孔的蜂窩結(jié)構(gòu)，接種豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的蛋白和肌源性基因表達上調(diào)，誘導(dǎo)分化后可以形成細胞骨架[44]。再如用聚乳酸打印模具并進行反向鑄造，脫模制備的PDMS 模具用以混合膠原培養(yǎng)豬肌肉干細胞，結(jié)果顯示形成了結(jié)構(gòu)組織的肌管[45]。

植物蛋白具有類似肌肉的纖維結(jié)構(gòu)，通常用來制備模仿肉質(zhì)地的“素肉”。其應(yīng)用在細胞培養(yǎng)肉中，可以提供整體質(zhì)構(gòu)韌性。植物曾被認為缺乏動物細胞經(jīng)典黏附蛋白的真正同源物，而對細胞基質(zhì)黏附分子的研究揭示了動物、真菌和植物分子之間的序列相似性[24]。目前，有研究表明花生拉絲蛋白多孔支架可以用于豬平滑肌細胞的黏附和生長[46]，同時可以促進豬脂肪來源的間充質(zhì)干細胞表達PPARγ、FABP4、Plin1 基因和蛋白[47]。此外，有研究證明組織化大豆蛋白多孔支架可以支持細胞附著和增殖（如圖3b），并將其應(yīng)用于牛衛(wèi)星肌細胞、牛平滑肌細胞和牛內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)，從而創(chuàng)建了3D 工程化牛肌肉組織的培養(yǎng)模型[48]。

2.4.2 類纖維和微球支架 目前哺乳動物細胞肉大多是非結(jié)構(gòu)化的，為了模擬真正的肉組織，可以應(yīng)用各種組織工程技術(shù)如細胞薄片工程、細胞纖維工程、3D 打印等[49]。組織工程領(lǐng)域基于纖維調(diào)控的策略在體外創(chuàng)建三維復(fù)雜組織具有良好的發(fā)展前景（圖3c）。有研究證明，使用雙同軸層流的微流控裝置制造的水凝膠纖維包裹細胞外基質(zhì)蛋白和細胞，可以重建活組織的內(nèi)在形態(tài)和功能，同時還可通過編織和卷曲組裝成具有各種空間模式的宏觀結(jié)構(gòu)[50]。在細胞培養(yǎng)肉領(lǐng)域，擠壓明膠纖維可以促進牛主動脈平滑肌細胞和兔骨骼成肌細胞貼附增殖，同時短長度纖維促進細胞聚集，長纖維促進肌肉組織形成[51]。Kang 等[49]采用顆粒狀結(jié)冷膠浴和明膠浴的方法進行肌腱-凝膠集成生物打印，制備出3 種牛細胞纖維：肌肉、脂肪組織和毛細血管，3 種細胞在分化過程中可保持良好的纖維結(jié)構(gòu)并組裝形成類牛排樣組織。

圖3 （a）制備脫細胞和脫鈣魚鱗支架過程的示意圖[40]；（b）組織化大豆蛋白支架的微觀結(jié)構(gòu)及生物相容性[48]；（c）結(jié)冷膠、明膠支架運用于肌腱-凝膠支撐浴打印[49]Fig.3 （a）Schematic diagram of the process of preparing decellularized and decalcified fish scale scaffolds[40]；（b）Microstructure and biocompatibility of textured soybean protein scaffolds[48]；（c）Granular gellan gum bath and granular gelatin bath used in tendon-gel integrated bioprinting[49]

微載體是直徑為數(shù)百微米的微型三維培養(yǎng)支架，是一種高效、可伸縮的細胞擴張平臺。理想的微載體需具有比表面積大、細胞親和力高、生物降解性或可食用性等特點[52]。Zhang 等[53]將淀粉通過離子交換與DEAE 偶聯(lián)合成淀粉微球，適合貼壁哺乳動物單細胞的生長。在旋轉(zhuǎn)瓶中運用可食用的三維多孔明膠微載體培養(yǎng)豬骨骼肌衛(wèi)星細胞，結(jié)果表明細胞發(fā)生可伸縮擴張，并在沒有肌源性試劑的情況下觸發(fā)了自發(fā)肌生成。此外，Liu 等[54]利用3D 打印模具和TG 酶將微組織組裝成具有相似力學(xué)性能和高蛋白量的厘米級肉丸。

3 培養(yǎng)肉支架組織成型

細胞培養(yǎng)肉支架組織成型需要滿足一定的孔隙率，合適的孔徑或通道大小，適宜的支架尺寸和厚度，以及支撐細胞生長與支架成型的楊氏模量等結(jié)構(gòu)屬性，且與細胞的來源與生長要素差異有關(guān)。由于細胞大小、遷移要求和物質(zhì)運輸，孔徑的最低要求被認為是100 μm[55-56]，對于成肌細胞和成脂細胞需要的孔隙分別為50～150 μm 和40～400 μm[57]。一般而言，宏觀的工程化組織培養(yǎng)肉才能真正意義地被稱為“肉”，這不僅需要細胞能在支架材料上成功增殖與分化，還需要借助如微載體成型、靜電紡絲成型、生物3D 打印成型等一定的組織成型方法。

3.1 微載體成型

細胞微載體是用于細胞治療和組織工程等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細胞培養(yǎng)和物質(zhì)傳遞的微尺度聚合微粒[58]。Yang 等[59]報道了一種RGD 肽功能化殼聚糖微球支架用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）的快速增殖，使其在體外能夠形成組織化血管；Anton 等[60]制備了直徑571 μm 的殼聚糖微球支架，并能支持小鼠骨骼細胞C2C12 成肌細胞、兔平滑肌細胞、羊成肌纖維細胞等的黏附和快速增殖。在細胞培養(yǎng)肉方面，清華大學(xué)的研究人員利用可食用的多孔明膠微載體（如圖4a），結(jié)合攪拌式生物反應(yīng)器，在體外高效、規(guī)?；瘮U增出豬原代肌肉星形細胞（即豬骨骼肌干細胞），并誘導(dǎo)其分化和成熟；隨后，利用3D 打印肉球模具和食品級谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，將百微米尺度的豬肌肉微組織組裝成數(shù)厘米大小的人造豬肉丸[54]。

圖4 （a）模板微球成型的人造肉丸[54]；（b）靜電紡絲明膠成型的組織肌肉[61]；（c）生物3D 打印成型的類牛排組織[49]；（d）水凝膠堆疊成型的類牛肉組織[57]Fig.4 （a）Artificial meatballs formed by template microspheres[54]；（b）Engineered tissue muscles formed by electrospinning gelatin[61]；（c）Steak-like tissue with marble texture formed by 3D bioprinting[49]；（d）Beef-like tissue formed by stacking hydrogel[57]

3.2 靜電紡絲成型

靜電紡絲技術(shù)是一種簡單、經(jīng)濟、可調(diào)的工藝，將其用于組織成型時，能誘導(dǎo)植入的細胞對齊，促進肌肉細胞的伸長[62]和肌肉組織生成[63]，形成明顯的纖維結(jié)構(gòu)。Deng 等[64]報道了一種靜電紡絲制備的明膠/玉米醇溶蛋白納米纖維膜。哈佛大學(xué)的研究人員利用浸沒旋轉(zhuǎn)噴射紡紗（iRJS）紡制了食品級的明膠纖維（圖4b），并將兔肌肉細胞和牛平滑肌細胞植入其中生長，得到一個大小約4 cm3，1.5 mm 厚的成型肉，紋理剖面分析表明其更接近于絞碎的牛肉而非兔或牛肉的整塊肌肉。雖然肌肉纖維排列性良好，但是其結(jié)構(gòu)仍未達到傳統(tǒng)全切肉制品的組織結(jié)構(gòu)密集程度[61]。

3.3 3D 打印成型

三維打印技術(shù)也被稱為增材制造技術(shù)，作為一種可在各種尺度上定位細胞位置并可從多種材料中大規(guī)模生產(chǎn)復(fù)雜幾何結(jié)構(gòu)的工具，近年來受到廣泛關(guān)注。生物墨水的3D 打印可通過噴墨、激光輔助生物打印、投影式光固化和擠出等多種方式實現(xiàn)。其中，基于擠出的生物3D 打印操作簡單、成本低、加工安全，且易實現(xiàn)多種用途、商業(yè)化及應(yīng)用推廣，是目前食品領(lǐng)域最受歡迎的打印制造方式[65]。常用的擠出式生物3D 打印材料因需要具備剪切稀化的非牛頓流體特性，故以水凝膠基質(zhì)的生物墨水為主[66]。同時，擠出式生物3D 打印墨水還應(yīng)具備最小的巴勒斯效應(yīng)（Barus effect），以保證材料從噴嘴中擠出后不會過度膨脹[67]。Li 等[68]通過擠出式3D 打印和光固化打印細胞化的Gel-MA-20%絲素蛋白生物墨水，制備出具有多層的豬骨骼肌組織。Bolívar-Monsalve 等[69]通過連續(xù)共擠出方式打印海藻酸鹽和載有C2C112 明膠甲基丙烯酰-海藻酸鹽生物墨水生成含多層纖維骨骼肌微組織。

隨著研究人員對仿生結(jié)構(gòu)研究的深入，部分試驗驗通過3D 生物打印技術(shù)以模仿真實的排列方式，進而制備組織化的細胞培養(yǎng)肉。日本大阪大學(xué)的研究人員利用一種支撐浴3D 打印及肌腱-凝膠生物3D 打印技術(shù)（如圖4c），構(gòu)建了72 根細胞纖維（42 塊肌肉，28 個脂肪組織和2 條毛細血管），并仿照真實和牛細胞纖維染色后的圖像進行手工排列堆疊，最終得到直徑為5 mm、長度為10 mm 的具有大理石紋路的人造牛排[49]。浙江大學(xué)劉東紅團隊通過生物3D 打印技術(shù)模擬真實魚肉組織結(jié)構(gòu)，基于大黃魚成肌干細胞與脂肪干細胞的增殖分化構(gòu)建出類組織化的細胞培養(yǎng)魚片[70]。

3.4 其它成型方法

除上述的微載體成型、靜電紡絲成型和3D 打印成型方法外，還有一些如細胞片工程等方式可將細胞微組織組裝成型為厘米級或毫米級的組織化人造肉（圖4d）。Shahin-Shamsabadi 等[71]利用無血清細胞片工程培養(yǎng)C2C12 成肌細胞和3T3-L1前脂肪細胞，將18 片細胞片進行堆疊構(gòu)建出一個寬1 cm，厚1～2 mm 的組織化人造肉。Simsa 等[72]通過纖維蛋白凝膠中植入牛衛(wèi)星細胞，以血紅蛋白和肌紅蛋白構(gòu)建一個與熟牛肉顏色相似的13 mm×1.4 mm×2.3 mm 的工程化人造肉。Ben-Arye等[48]在多孔組織化大豆蛋白支架中植入牛衛(wèi)星細胞、內(nèi)皮和平滑肌細胞，培養(yǎng)4 d 后通過染色觀察到成型的肌管，制得一個寬6 mm，厚1～2 mm 的類牛肉薄片，并與市售的牛肌肉有著相似的楊氏模量和極限拉伸強度。Furuhashi 等[73]將膠原蛋白、纖維蛋白和基質(zhì)組成的ECM 水凝膠植入牛成肌細胞，堆疊在柱子中促進收縮排列，利用脈沖培養(yǎng)14 d，構(gòu)建了與商業(yè)牛肉具有相似斷裂力的毫米級類牛肉組織。

4 總結(jié)與展望

由于日益加劇的人口壓力、資源限制和環(huán)境劣變，以及全球肉類消費需求的不斷增長，傳統(tǒng)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展逐漸成為一個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。細胞培養(yǎng)肉作為替代蛋白的新興技術(shù)，其依據(jù)動物肌肉組織生長機理，利用干細胞由體外三維培育而成，被認為是最有可能解決未來肉品生產(chǎn)難題和消費困境的方案之一，在解決當(dāng)前肉業(yè)生產(chǎn)效能不足以及公共衛(wèi)生、環(huán)境退化和動物福利等問題方面展現(xiàn)了巨大的潛力。

在細胞培養(yǎng)肉制備過程中，由于細胞對三維環(huán)境存在“機械轉(zhuǎn)導(dǎo)機制”，支架的組成、表面化學(xué)性質(zhì)以及孔徑、孔隙度在內(nèi)的結(jié)構(gòu)特征均對細胞的黏附、增殖、遷移和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用，因此，細胞培養(yǎng)肉支架材料應(yīng)滿足多孔性、生物相容性、生物可降解性、可食用性、適度的支架結(jié)構(gòu)與力學(xué)性能、良好的加熱性質(zhì)等原則及要求。常見的細胞培養(yǎng)三維支架材料包括水凝膠支架、脫細胞的組織或器官，以及三維多孔支架、纖維和微球在內(nèi)的其它預(yù)成型功能支架。細胞在支架材料上成功增殖與分化后，還需設(shè)計結(jié)構(gòu)成型方法使其形成宏觀的工程化組織培養(yǎng)肉，目前微載體成型、靜電紡絲成型、生物3D 打印成型等技術(shù)已被研究證實為可行的培養(yǎng)肉組織成型手段。

總之，培養(yǎng)肉被認為是未來替代傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)模式的技術(shù)發(fā)展方向之一，目前仍處于初期階段，缺乏工業(yè)化生產(chǎn)基礎(chǔ)。此外，還有一些基本問題需要解決，包括高表達細胞系、大規(guī)模生物反應(yīng)器、低成本無血清培養(yǎng)基與支架、高效組織成型工程的建立[74，75]，以及相應(yīng)的食品安全性和質(zhì)構(gòu)風(fēng)味特性的調(diào)控。隨著生物、材料與食品技術(shù)的進一步融合發(fā)展，細胞培養(yǎng)肉有望成為一種高效生產(chǎn)、綠色環(huán)保且無需動物屠宰的可持續(xù)肉類制造策略，從而緩解未來人口和肉類需求增長帶來的壓力。

致謝

本研究得到浙江大學(xué)上海高等研究院繁星科學(xué)基金資助（SN-ZJU-SIAS-004）。