基于合成核酸分子工程的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用

曹夢(mèng)瑤,李 麗,裴 昊

（華東師范大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院 上海市綠色化學(xué)與化工過程綠色化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200062）

0 引 言

核酸分子作為自然界生物遺傳信息的載體,具有獨(dú)特的化學(xué)或結(jié)構(gòu)特性,例如DNA雙鏈遵循Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對(duì)原則、序列可編程性和優(yōu)異生物相容性等[1-2].同時(shí),利用限制性核酸酶、連接酶和聚合酶,研究人員能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)核酸分子的剪切、連接、復(fù)制和延伸等操作[1-2].近年來,核酸分子合成技術(shù)的不斷進(jìn)步,以及其價(jià)格的降低,促進(jìn)了核酸納米技術(shù)領(lǐng)域的迅速發(fā)展[3-4].核酸納米技術(shù)可大致分為結(jié)構(gòu)納米技術(shù)和動(dòng)態(tài)納米技術(shù)[5].一方面,結(jié)構(gòu)納米技術(shù)通過核酸分子自下而上的自組裝,實(shí)現(xiàn)了不同尺寸的二維和三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建[6].這些結(jié)構(gòu)在納米尺度上具有空間可尋址性,可以在體外對(duì)生物分子進(jìn)行位點(diǎn)特異性錨定[5,7-8].另一方面,動(dòng)態(tài)核酸納米技術(shù)基于可編程的核酸分子間相互作用或分子內(nèi)構(gòu)象變化,可以構(gòu)建具有自主移動(dòng)或處理信息能力的分子馬達(dá)或電路[5,7].對(duì)核酸分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的定量研究,能夠預(yù)測單鏈核酸分子的折疊路徑以及核酸分子間的反應(yīng)路徑,這是核酸納米技術(shù)取得成功的一個(gè)關(guān)鍵因素[9].長期以來,核酸納米技術(shù)取得的進(jìn)步推動(dòng)了多個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展,例如基因編輯[10]、智能藥物遞送[11-14]和綠色催化[4]等.這些進(jìn)步使人們看到了核酸分子器件在“智能療法”中的巨大應(yīng)用潛力,尤其是用于生物診斷.已經(jīng)有研究表明,利用核酸分子器件能夠?qū)Χ鄠€(gè)生物標(biāo)志物進(jìn)行同時(shí)檢測,并實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速的疾病診斷[15-16].目前,已經(jīng)發(fā)展的多種體外診斷(in vitro diagnostics,IVD)方法也涉及合成核酸分子器件,例如基于DNA折紙和人工基因電路的埃博拉病毒檢測試紙[17].這些能夠用于護(hù)理點(diǎn)的簡單、快速的體外診斷方法的涌現(xiàn),揭示了合成DNA分子潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.

本文總結(jié)了合成核酸分子工程在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的進(jìn)展.首先,簡要概述了對(duì)核酸結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)和修飾,描述了對(duì)核酸分子間反應(yīng)和分子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力學(xué)的調(diào)控方法,闡述了功能切換電路的設(shè)計(jì).然后,總結(jié)了合成核酸分子工程3個(gè)方向的應(yīng)用:利用合成核酸分子的生物分子識(shí)別能力,構(gòu)建核酸傳感器,實(shí)現(xiàn)生物標(biāo)志物的檢測和疾病的診斷;核酸分子電路用于細(xì)胞表面工程化,以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控;在生物催化中,核酸分子用于構(gòu)建模擬酶和優(yōu)化酶的催化活性.最后,提出了合成核酸分子工程當(dāng)前面臨的瓶頸,并指出了其未來的發(fā)展方向.

1 對(duì)核酸結(jié)構(gòu)以及分子間相互作用的研究

自20世紀(jì)80年代Seeman設(shè)計(jì)并構(gòu)建了第一個(gè)DNA納米結(jié)構(gòu)以來[18],自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)不斷涌現(xiàn).2006年DNA折紙的問世[19],在結(jié)構(gòu)核酸納米技術(shù)領(lǐng)域具有里程碑的意義.在數(shù)百條短的訂書釘鏈的輔助下,一條長的DNA支架鏈折疊形成DNA折紙結(jié)構(gòu)(圖1(a))[19-25].基于DNA分子的序列可編程性和互補(bǔ)鏈間的程序化雜交,通過上述方法,理論上能夠構(gòu)建任意復(fù)雜形狀的二維、三維結(jié)構(gòu),如笑臉、立方體和半球形等.平面DNA折紙結(jié)構(gòu)的尺寸受到支架鏈的長度的限制,通常為8 000～10 000 nm2.通過合理的設(shè)計(jì),多個(gè)DNA折紙結(jié)構(gòu)能夠作為模塊進(jìn)行拼接,合成的結(jié)構(gòu)能夠達(dá)到毫米尺度.在DNA折紙結(jié)構(gòu)中,每一條訂書釘鏈經(jīng)過設(shè)計(jì),其位置可輕易確定.因此,折紙結(jié)構(gòu)具有空間可尋址能力,可以將修飾分子錨定在指定的位置.每40～50 nm2內(nèi)存在1個(gè)可尋址點(diǎn).

基于其空間可尋址的特性,研究人員能夠從設(shè)計(jì)層面上改造DNA折紙結(jié)構(gòu).在DNA折紙結(jié)構(gòu)上,通過找到預(yù)設(shè)的可尋址點(diǎn)或具有一定間距的多個(gè)可尋址點(diǎn)所在的訂書釘鏈,可對(duì)其進(jìn)行功能化修飾[8].通過對(duì)訂書釘鏈的修飾,諸如延伸出捕獲鏈或連接生物素,多種分子或結(jié)構(gòu)能夠被錨定在DNA折紙結(jié)構(gòu)表面,使其獲得新的功能(圖1(b))[8,11,26].例如,通過精確控制捕獲鏈在棒狀DNA折紙結(jié)構(gòu)上的位置,可實(shí)現(xiàn)對(duì)平行金納米棒簇三維空間配置的控制[27].

圖1 核酸納米技術(shù)的發(fā)展Fig.1 Development of nucleic acid nanotechnology

在結(jié)構(gòu)核酸納米技術(shù)發(fā)展的同時(shí),動(dòng)態(tài)核酸納米技術(shù)也取得了巨大的進(jìn)步.基于DNA鏈置換反應(yīng),AND和OR等基礎(chǔ)邏輯門以及DNA分子電路等計(jì)算器件被構(gòu)建.鏈置換反應(yīng)的過程:在toehold區(qū)域的觸發(fā)下,一條DNA單鏈取代DNA雙鏈中的一條鏈,并與另一條鏈雜交.通過調(diào)整toehold區(qū)域的長度和序列,可實(shí)現(xiàn)對(duì)鏈置換反應(yīng)速率6個(gè)數(shù)量級(jí)范圍的調(diào)控.在此基礎(chǔ)上,本文課題組提出了精細(xì)調(diào)控DNA鏈置換反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的策略[28].在這一策略中,能夠發(fā)生分子內(nèi)構(gòu)象變化的發(fā)夾結(jié)構(gòu)作為分子開關(guān)模塊被插入到toehold區(qū)域與分支遷移域之間,通過調(diào)控發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖和環(huán)的長度實(shí)現(xiàn)了鏈置換反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的連續(xù)微調(diào).進(jìn)一步利用協(xié)同變構(gòu)的DNA開關(guān),設(shè)計(jì)了DNA I/O(input/output)控制器,實(shí)現(xiàn)了DNA鏈置換反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的非線性調(diào)控,希爾系數(shù)可達(dá)2.70[29].

通過對(duì)序列的合理設(shè)計(jì),上游DNA鏈置換反應(yīng)的產(chǎn)物能夠作為輸入,用來觸發(fā)下游反應(yīng)的發(fā)生,從而實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的級(jí)聯(lián).基于此,研究人員設(shè)計(jì)并構(gòu)建了具有特定功能的DNA電路[30].將DNA電路進(jìn)一步與刺激響應(yīng)材料結(jié)合,構(gòu)建了對(duì)外界刺激具有響應(yīng)能力的DNA功能切換電路(圖1(c)).該工作以光控DNA功能切換電路作為一個(gè)經(jīng)典的例子[31],將紫外光(Ultraviolet,UV)響應(yīng)的光致變色分子(螺吡喃)引入到反應(yīng)體系中.在初始狀態(tài)下,三鏈體結(jié)構(gòu)的DNA開關(guān)能夠與輸入鏈發(fā)生反應(yīng);在紫外光照射下,螺吡喃發(fā)生變構(gòu)并誘導(dǎo)三鏈體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為雙鏈結(jié)構(gòu),通過阻礙與輸入鏈的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)功能的轉(zhuǎn)化.此外,研究人員還設(shè)計(jì)并構(gòu)建了p H響應(yīng)的功能切換電路[32-33].

目前,研究人員將動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)與靜態(tài)DNA納米技術(shù)相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了具有動(dòng)態(tài)行為的分子機(jī)器,如能夠開閉的DNA六邊形桶狀結(jié)構(gòu)[34]、局域化分子電路[35]及DNA步行者[36]等.

2 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

基于其優(yōu)異的生物相容性和低細(xì)胞毒性,核酸分子在體內(nèi)應(yīng)用中顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢[37].結(jié)合其易于修飾、可編程等特點(diǎn),基于核酸的分子機(jī)器在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力.本文從3個(gè)方面來簡述合成DNA分子工程的應(yīng)用潛力:生物分子識(shí)別、生物膜表面修飾和生物催化.

2.1 生物分子識(shí)別

生物分子識(shí)別依賴于識(shí)別元件和靶標(biāo)之間的特異性結(jié)合[38-39].經(jīng)核酸適配體或官能團(tuán)修飾,核酸結(jié)構(gòu)能夠作為識(shí)別元件靶向多種目標(biāo),包括核酸、蛋白、離子,甚至整個(gè)細(xì)胞.此類具有生物分子識(shí)別能力的DNA結(jié)構(gòu)可以應(yīng)用于生物傳感等領(lǐng)域[40-60].

受馬達(dá)蛋白的啟發(fā),研究人員創(chuàng)造出了人工分子機(jī)器人—DNA步行者.其中,行走元件能夠在驅(qū)動(dòng)力的作用下沿著步行軌道穩(wěn)定、漸進(jìn)地運(yùn)動(dòng)[2].將DNA識(shí)別元件與步行者的行走元件相結(jié)合,識(shí)別元件捕獲靶標(biāo)后,引發(fā)信號(hào)的產(chǎn)生,隨著步行者的多步行走,進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大,這一過程可用于構(gòu)建高靈敏生物傳感器.基于此,本文課題組設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種隨機(jī)DNA步行者,它以一條DNA單鏈作為行走元件,以核酸外切酶Ⅲ為驅(qū)動(dòng)力,在DNA鏈修飾的金納米粒子上移動(dòng)[61].當(dāng)行走元件結(jié)合到一條軌道鏈上之后,軌道鏈會(huì)在酶的作用下被水解,從而產(chǎn)生信號(hào).而釋放的行走元件會(huì)結(jié)合到下一條軌道鏈上,通過多次循環(huán)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大.在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步構(gòu)建了雙步行者系統(tǒng),目標(biāo)細(xì)菌能夠與識(shí)別元件結(jié)合,從而釋放兩類行走鏈,分別觸發(fā)兩類步行者上信號(hào)的產(chǎn)生及擴(kuò)增,實(shí)現(xiàn)快速靈敏的生物傳感[62].此外,有研究報(bào)道使用雙鏈特異性核酸酶作為驅(qū)動(dòng)力,以吸附在MoS2納米片上的DNA發(fā)夾作為行走軌道,發(fā)展了能夠用于miRNA識(shí)別和檢測的RNA步行者[63-64].更進(jìn)一步地,基于單壁碳納米管的RNA步行者也被開發(fā)并應(yīng)用于miRNA識(shí)別和胞內(nèi)成像[65].為了實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的超高通量檢測,研究人員將隨機(jī)DNA步行者與基于液滴的微流體策略結(jié)合,采用基于熒光種類和強(qiáng)度的二維編碼策略,構(gòu)建了具有超多重檢測能力的生物傳感器,理論上可以識(shí)別和區(qū)分9種細(xì)菌的511種不同組合(圖2)[66].

圖2 隨機(jī)DNA步行者-液滴平臺(tái)用于細(xì)菌的超多重檢測[66]Fig.2 Stochastic DNA walkers in droplets,a platform for super-multiplexed detection of bacteria[66]

2.2 生物膜表面修飾

細(xì)胞膜是細(xì)胞與其環(huán)境之間發(fā)生交互的主要介質(zhì)[67].開發(fā)細(xì)胞膜上的分子工程策略可以用于調(diào)節(jié)細(xì)胞與環(huán)境之間的交互作用.目前,調(diào)控細(xì)胞膜表面受體的常用工具是基因編輯.基因編輯是一種能夠?qū)ι锘蚪M進(jìn)行修飾的強(qiáng)有力的工具,利用編輯工具對(duì)基因“改寫”,從而改變細(xì)胞膜表面受體的表達(dá).但這種方法操作復(fù)雜,存在脫靶的可能性,并且可能會(huì)造成基因組結(jié)構(gòu)突變.相比于基因編輯,利用細(xì)胞表面工程也能夠?qū)崿F(xiàn)相似的功能,并且可規(guī)避上述問題.研究人員已經(jīng)發(fā)展了各種策略來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表面工程[68].例如,利用合成細(xì)胞黏附肽(arginylglycylaspartic acid,RGD)將DNA電路修飾在細(xì)胞膜表面,通過改變輸入模式可調(diào)控細(xì)胞在載玻片表面的黏附和分離行為(圖3(a))[69].此外,基于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng),研究人員發(fā)展了一種基于DNA電路的細(xì)胞表面工程策略,可以對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用進(jìn)行可編程調(diào)控,從而選擇性地控制多細(xì)胞自組裝路徑(圖3(b))[70].近期,基于DNA概率電路,研究人員提出了一種可精確調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上的人工受體聚集程度的策略(圖3(c)),這一策略可以調(diào)控自然殺傷細(xì)胞與癌細(xì)胞之間相互作用,從而促進(jìn)有效的癌細(xì)胞殺傷[71].該研究為精確控制細(xì)胞識(shí)別和發(fā)展基于細(xì)胞的免疫治療提供了有效工具.除對(duì)細(xì)胞膜外表面進(jìn)行人工核酸分子修飾之外,基于核酸的細(xì)胞膜內(nèi)表面工程化進(jìn)一步擴(kuò)展了功能性核酸分子在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用,這一方面的研究也引起了廣泛關(guān)注.例如,邢航課題組提出了一種基于融合性球形核酸的可在空間上控制膜表面工程化的仿生策略[72].依賴這一膜融合策略,可以精準(zhǔn)控制DNA鏈在細(xì)胞膜內(nèi)表面或外表面的高效修飾,并以此實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞間通信的調(diào)節(jié)以及細(xì)胞內(nèi)代謝物的監(jiān)測.

圖3 細(xì)胞表面工程和智能藥物運(yùn)輸Fig.3 Cell surface engineering and intelligent drug delivery

適配體等靶向元件能夠與細(xì)胞膜上蛋白發(fā)生特異性相互作用,將靶向元件與藥物載體結(jié)合,構(gòu)建智能藥物遞送系統(tǒng),這類系統(tǒng)能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)藥物的靶向遞送,從而提高藥物的運(yùn)輸效率、降低藥物的全身毒性.基于此,研究人員開發(fā)了一種DNA開關(guān)調(diào)控的水凝膠,用于控制腫瘤殺傷藥物在特定癌細(xì)胞中的釋放[13].體系以金納米粒子作為模板,DNA鏈在模板表面發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng),形成球形核酸水凝膠.抗癌藥物能夠插入到DNA雙鏈當(dāng)中.當(dāng)識(shí)別到靶細(xì)胞中ATP(adenosine triphosphate)時(shí),DNA雙鏈解旋并釋放藥物(圖3(d)).此外,適配體修飾的DNA折紙結(jié)構(gòu)[11]和金屬有機(jī)框架(metal-organic framework,MOF)-生物礦化DNA納米球[12]也被開發(fā)用于智能藥物運(yùn)載系統(tǒng).

2.3 生物催化

生物催化是在酶或生物有機(jī)體等催化劑的作用下進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程,它有助于合成化學(xué)品、藥物和生物燃料等,對(duì)于生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展至關(guān)重要.生物催化是一種環(huán)境友好和經(jīng)濟(jì)有效的催化方法,有望替代傳統(tǒng)金屬催化方法.常見的生物酶包括蛋白、DNA和RNA.為了實(shí)現(xiàn)高效的生物催化,Zhong等[73]發(fā)展了一種具有與酶相似活性的新型DNA納米纖維水凝膠(G4模擬酶),可用于H2O2和四甲基聯(lián)苯胺的氧化還原催化(圖4(a)).G4模擬酶通過鳥嘌呤核苷與KB(OH)4自組裝,并在自組裝過程中插入血紅素,具有顯著的類酶活性.

圖4 基于合成核酸分子的生物催化Fig.4 Biocatalysis using synthetic nucleic acid molecules

設(shè)計(jì)構(gòu)建高效的生物催化劑可以加速化學(xué)反應(yīng).然而,在工業(yè)化應(yīng)用中,生物催化劑還需要滿足兩個(gè)重要條件:高化學(xué)轉(zhuǎn)化速率和對(duì)極端條件的耐受性(包括高溫或低溫,有機(jī)溶劑和抑制性試劑等).研究人員通過調(diào)控兩個(gè)酶分子的間距有效地提高了級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率(圖4(b))[26].基于DNA折紙結(jié)構(gòu)的可編程性和空間可尋址性,兩種酶以不同的間距被錨定在平面核酸結(jié)構(gòu)上,以優(yōu)化酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)的效率.此外,研究人員還使用多殼金屬有機(jī)框架,在納米尺度上對(duì)酶進(jìn)行空間組裝,提高酶的級(jí)聯(lián)催化活性[74].這種金屬有機(jī)框架還能夠作為區(qū)室化的反應(yīng)器,有效避免反應(yīng)串?dāng)_.另一方面,使用MOF封裝脫氧核糖核酸酶(DNAzymes),可以提高酶的穩(wěn)定性,使其在有機(jī)溶劑或高溫條件下依舊具有良好的酶催化活性(圖4(c))[75].

3 結(jié) 論

本文總結(jié)了合成核酸分子工程在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的進(jìn)展.本研究專注于核酸分子底層技術(shù),尤其是對(duì)靜態(tài)核酸結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計(jì)和修飾,以及對(duì)核酸分子間反應(yīng)和分子運(yùn)動(dòng)動(dòng)力學(xué)的調(diào)控方法,并且進(jìn)一步展示了功能切換電路的設(shè)計(jì).最后闡述了合成核酸分子工程用于生物分子識(shí)別、生物膜表面工程和生物催化這3個(gè)方向的研究進(jìn)展.

合成核酸分子工程的蓬勃發(fā)展為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域帶來了巨大的機(jī)遇,但仍然存在一些障礙和發(fā)展瓶頸.主要包括:①受到穩(wěn)定性和體內(nèi)分子串?dāng)_的影響,目前功能化DNA分子雖然能夠識(shí)別廣泛的靶標(biāo),但在生物體液中的檢測能力仍然有限.為了解決這一問題,研究人員將支架結(jié)構(gòu)引入到生物檢測當(dāng)中[76],以提高體系的穩(wěn)定性.② 基于DNA的藥物運(yùn)輸系統(tǒng)存在細(xì)胞攝取率不高、細(xì)胞攝取的機(jī)制不明確等問題.為此,研究人員針對(duì)藥物載體的種類、尺寸和形狀等對(duì)細(xì)胞攝取的影響進(jìn)行了研究[77].③ 當(dāng)核酸分子工程應(yīng)用于生物領(lǐng)域時(shí),需要在體系中加入特定的工具酶或者對(duì)探針鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記,這無疑會(huì)增加體系的成本.為了解決這一問題,非常有必要發(fā)展等溫非酶擴(kuò)增方法和無標(biāo)記方法.④ 對(duì)于DNA納米技術(shù)而言,當(dāng)DNA電路規(guī)模擴(kuò)展到一定程度或DNA納米結(jié)構(gòu)大到一定尺度時(shí),信號(hào)泄露和DNA鏈錯(cuò)誤折疊的概率都會(huì)急劇增加,這會(huì)導(dǎo)致電路的錯(cuò)誤輸出,并且影響合成結(jié)構(gòu)的產(chǎn)率和完整性.因此,改進(jìn)和完善DNA電路或結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)和制備技術(shù),對(duì)于構(gòu)建更復(fù)雜的DNA電路和組裝更復(fù)雜的DNA結(jié)構(gòu)具有重要的意義,也是未來核酸分子工程的發(fā)展方向.

盡管核酸分子工程仍面臨諸多挑戰(zhàn),但不可否認(rèn)的是,其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用,尤其是生物分子的檢測以及疾病的診斷和治療方面.同時(shí),研究人員也在不斷拓展核酸分子工程在熱點(diǎn)領(lǐng)域(如生物安全、表觀遺傳學(xué)等)的應(yīng)用.相信未來經(jīng)過幾十年的發(fā)展,在先進(jìn)功能性材料的推動(dòng)下,DNA設(shè)計(jì)、合成、修飾及組裝技術(shù)的發(fā)展將達(dá)到一個(gè)新的水平,有望應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域.