肺炎支原體壞死性肺炎患兒支氣管肺泡灌洗液IL-17A及MUC5AC檢測的臨床意義

余燕娟 李敏 靳秀紅

肺炎支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP)占兒童社區(qū)獲得性肺炎的10%～40%[1-3]，是引起壞死性肺炎的最重要病原體之一[4]。兒科纖維支氣管鏡技術(shù)的迅速發(fā)展[5]，促進了肺部免疫的研究。MUC5AC高表達是氣道黏液分泌量及黏度增加的主要原因[6]。國內(nèi)外研究[7-11]表明肺炎支原體感染能夠?qū)е翸UC5AC高分泌，但其機制尚不清楚。IL-17A是一種關(guān)鍵的促炎因子[12-13]，其產(chǎn)生在中性粒細胞招募及防御肺炎支原體感染中是必不可少的[14]。另外，IL-17A通過NF-κB信號通路在氣道上皮細胞中對MUC5AC的表達進行調(diào)控[15]。查閱國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn)，有關(guān)肺炎支原體壞死性肺炎患兒的肺泡灌洗液(BALF)中IL-17A、MUC5AC的相關(guān)研究較少，本文通過檢測MP壞死性肺炎BALF中IL-17A及MUC5AC水平，揭示MPP感染導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)及黏液高分泌的機制，為MPP的治療提供理論依據(jù)及靶點。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2018年1月～2021年12月在我院呼吸科住院治療的肺炎支原體感染所致大葉性肺炎患兒，并根據(jù)患兒是否合并肺壞死分為肺炎支原體非壞死性大葉性肺炎(A組)30例及肺炎支原體壞死性肺炎(B組)30例，以及同期入院行纖維支氣管鏡下異物取出治療的30例支氣管異物患兒(對照組/C組)作為研究對象。選取的所有病例組患兒(A組+B組)根據(jù)病情均行兩次纖維支氣管鏡灌洗治療，第一次在入院3～5天內(nèi)急性期時，第二次在第一次灌洗治療5～7天后。該研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(2022-K-034)，且在獲得患兒家長知情同意的情況下進行纖維支氣管鏡操作及留取肺泡灌洗液。

非壞死性大葉性肺炎選取標(biāo)準：①年齡1個月～14歲；②符合肺炎診斷，有咳嗽伴或不伴發(fā)熱癥狀，胸部影像學(xué)顯示大于1個肺段或一個肺葉有浸潤影；③符合MP感染標(biāo)準，即BALF中MP-RNA/DNA陽性；⑤排除混合其他病原感染，包括呼吸道合胞病毒、流感病毒A、B型、腺病毒、鼻病毒、副流感病毒l、2、3型、博卡病毒、人偏肺病毒的常見7種呼吸道病毒及肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae，CP)，并行血培養(yǎng)、痰培養(yǎng)、BALF培養(yǎng)等，排除合并其他病原體如細菌、真菌、結(jié)核等感染。

壞死性肺炎入選標(biāo)準：在上述大葉性肺炎的診斷基礎(chǔ)上合并有胸部影像學(xué)表現(xiàn)為肺實變區(qū)域出現(xiàn)小的多發(fā)性含氣或液體的空洞[16]。

支氣管異物組入選標(biāo)準：①年齡≤14歲；②異物在氣管內(nèi)存留時間不超過3d；③異物吸入前6個月內(nèi)無肺部感染病史。本研究通過醫(yī)院倫理委員會的審查，經(jīng)患兒家長同意并簽署知情同意書。

以上入組對象均排除支氣管哮喘、肺膿腫、肺囊腫伴感染、肺結(jié)核、支氣管肺發(fā)育畸形、免疫缺陷病、血液系統(tǒng)疾病、慢性呼吸系統(tǒng)疾病等。

二、方法

1 一般臨床資料收集 收集三組患兒的一般資料及臨床資料(臨床表現(xiàn)、實驗室檢驗結(jié)果、支氣管鏡下表現(xiàn)、胸部影像結(jié)果和治療用藥情況等)。實驗室檢驗結(jié)果包括C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)、D-二聚體、LDH；痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)和BALF病原學(xué)檢測。

2 BALF標(biāo)本采集 所有的支氣管鏡檢查均有臨床指征，并在適度鎮(zhèn)靜和局部麻醉下使用可彎曲的纖維支氣管鏡進行。肺炎組患兒選擇肺部病變相應(yīng)的支氣管肺段進行灌洗，支氣管異物對照組患兒選擇異物病灶的對側(cè)肺進行灌洗。用37℃滅菌生理鹽水作為灌洗液，每次回收應(yīng)大于40%。將回收的灌洗液立即置4℃冰箱保存，半小時內(nèi)送檢。按照歐洲呼吸病學(xué)會推薦[17]，收集第1管灌洗液送病原學(xué)檢測，第2和第3管灌洗液合并混勻再次分為兩份，一份送細胞學(xué)檢測，另一份離心后取上清放入-80℃冰箱作為MUC5AC、IL-17A檢測標(biāo)本。

3 BALF中MUC5AC、IL17A檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定。試劑盒由武漢伊萊瑞特生物科技有限公司提供。

MUCA5AC檢測操作步驟：

(一)分別設(shè)定標(biāo)準孔、空白孔和樣本孔。標(biāo)準孔加入100μL倍比稀釋的標(biāo)準品，空白孔加入100μL標(biāo)準品&樣本稀釋液，其余孔加入100μL待測樣本(建議所有的待檢樣本和標(biāo)準品在檢測中設(shè)立復(fù)孔)。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育90 min。

(二)甩盡孔內(nèi)液體，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液100μL，給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育1 h。

(三)棄去孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干。每孔加洗滌液350μL，浸泡1 min，甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。

(四)每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育30 min。

(五)甩盡孔內(nèi)液體，按步驟3洗板5次。

(六)每孔加底物溶液(TMB)90 μL，給酶標(biāo)板覆膜，37℃避光孵育15 min左右。

(七)每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。提示：終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。

(八)立即用酶標(biāo)儀測量各孔在450 nm波長的光密度(OD值)。

(九)繪制標(biāo)準曲線，計算出各樣本的濃度。

IL-17A檢測步驟同MUC5AC。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

病例組60例，包括非壞死性大葉性肺炎A組30例，其中男15例，女15例(男 ∶女=1 ∶1)，平均年齡(6.12±2.33)歲，壞死性肺炎B組30例，其中男14例，女16例(男 ∶女=1 ∶1.14)，平均年齡(6.45±1.24)歲。對照組C組30例兒童，其中男18例，女12例(男：女=1：1.5)，平均年齡(5.66±2.54)歲。非壞死性大葉性肺炎組、壞死性肺炎組及對照組兒童的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

二、第一次灌洗BALF中MUC5AC、IL-17A水平比較

第一次灌洗，A組、B組、C組每兩組之間BALF中MUC5AC、IL-17A水平的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P均<0.05)，且均以B組最高，其次為A組，C組最低(見表1)。

表1 第一次灌洗時各組BALF中MUC5AC及IL-17A水平的比較

三、第二次灌洗BALF中MUC5AC及IL-17A水平比較

第一次灌洗5～7天后，A組和B組患兒行第二次灌洗，B組患兒BALF中的MUC5AC、IL-17A水平較A組仍有顯著升高(P<0.05)；兩組患兒MUC5AC、IL-17A水平較第一次灌洗時顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；A組患兒BALF中MUC5AC、IL-17A水平較對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 第二次灌洗時各組BALF中MUC5AC及IL-17A水平的比較

四、MUC5AC水平與IL-17A相關(guān)性

急性期兩組患兒肺泡灌洗液中MUC5AC水平與IL-17A水平呈正相關(guān)(rA=0.9716,rB=0.9326,P均<0.001)(見圖1，2)。

圖1 A組患兒BALF中MUC5AC與IL-17A相關(guān)性

圖2 B組患兒BALF中MUC5AC與IL-17A相關(guān)性

五、兩組患兒纖維支氣管鏡下氣道黏液栓塞情況對比

A組和B組患兒兩次纖維支氣管鏡灌洗時氣道黏液栓塞情況對比發(fā)現(xiàn)，肺炎支原體壞死性肺炎組患兒氣道黏液栓塞發(fā)生情況較非壞死性肺炎組患兒明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

表3 A組和B組患兒纖維支氣管鏡下氣道黏液栓塞情況

討 論

MP是兒童社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體，MPP發(fā)病率逐年升高，且呈現(xiàn)低齡化趨勢，由MP感染引起的大葉性肺炎在兒科門診和病房非常常見，部分患兒出現(xiàn)胸腔積液、肺不張等，且由肺炎支原體引起的壞死性肺炎的發(fā)病率呈上升趨勢。壞死性肺炎(necrotizing pneumonia，NP)的診斷主要依賴于胸部成像，在胸部平片中，壞死病變可表現(xiàn)為密度降低區(qū)域和腔病變，NP的胸部計算機斷層掃描(CT)表現(xiàn)為正常肺實質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，實質(zhì)強化減少，結(jié)構(gòu)逐漸被多個小的空氣或液體的腔取代，壁薄，不增強[16,18-19]。如果不進行充分的治療，NP可能會導(dǎo)致并發(fā)癥，包括支氣管胸膜瘺、膿胸、呼吸衰竭和膿毒性休克[20]。自1997年Oermann[21]首次報道MP感染引起的NP以來，文獻中報道的病例越來越多。來自中國13家醫(yī)院的兒童壞死性肺炎病原學(xué)的多中心回顧性研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體肺炎是導(dǎo)致兒童壞死性肺炎第一位的病原體，其次是肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌[4]。而國內(nèi)外報道NP的病原體主要以細菌感染為主，肺炎支原體感染占據(jù)少數(shù)[20,22]。這可能和肺炎支原體流行的區(qū)域、人群易感、肺炎支原體的檢測方法、肺炎支原體耐藥以及近年來我國逐漸增多的難治性支原體肺炎、重癥支原體肺炎有關(guān)。還可能跟早期抗菌藥物的使用使得細菌感染的檢出率降低及肺炎鏈球菌疫苗的普遍接種有關(guān)。

肺炎支原體肺炎的全身免疫機制及肺部局部免疫機制尚不明確， BALF來自于肺部感染部位，BALF炎癥因子檢測對了解MPP局部炎癥應(yīng)答特點和評估病情有重要作用。IL-17A是由先天免疫細胞或T輔助性17(Th17)細胞分泌的一種關(guān)鍵的促炎細胞因子，IL-17A通過誘導(dǎo)趨化因子和在感染部位誘導(dǎo)抗微生物蛋白招募中性粒細胞，在保護宿主防御感染中起到關(guān)鍵作用[23]，顯著上調(diào)能夠直接殺死入侵病原菌的抗菌肽，對宿主免疫做出貢獻[24]。國內(nèi)外已有多項研究表明肺炎支原體肺炎血清及BALF中IL-17A表達水平明顯升高，且能夠幫助預(yù)測難治性支原體肺炎及重癥支原體肺炎的發(fā)生[13,25-27]。但是關(guān)于肺炎支原體壞死性肺炎患兒肺泡灌洗液中IL-17A的表達水平的相關(guān)研究較少。

MUC5AC是組成氣道黏液的主要黏蛋白，分布于氣道表面，由氣道上皮細胞及黏膜下腺細胞分泌。正常情況下，只有少量黏液分泌，可以保護氣道、協(xié)助纖毛運動清除病原微生物及異物[28]。在呼吸道感染后，MUC5AC過度表達，導(dǎo)致黏液栓阻塞氣道，使得病情加重、病程遷延、甚至死亡率增加[29]。多項體外研究及動物試驗研究發(fā)現(xiàn)肺炎支原體感染可誘導(dǎo)MUC5AC的表達，與支氣管哮喘的氣道重塑、致死性并發(fā)癥以及慢性阻塞性肺疾病(COPD)的急性加重密切相關(guān)，但其致病機制尚不明確。有關(guān)肺炎支原體感染的大葉性肺炎及壞死性肺炎的BALF中MUC5AC的表達是否升高及其高表達是否與肺炎支原體感染后所導(dǎo)致的肺壞死性改變相關(guān)，國內(nèi)外并無相關(guān)報道。

本研究收集了肺炎支原體感染的非壞死性大葉性肺炎、壞死性肺炎患兒作為病例組及支氣管異物的患兒作為對照組進行研究，分別檢測其BALF中IL-17A、MUC5AC水平，對于病例組第一次灌洗也就是疾病急性期時的肺泡灌洗液中，所有病例組患兒BALF中IL-17A、MUC5AC水平顯著高于對照組兒童，且壞死性肺炎組兒童的IL-17A及MUC5AC水平顯著高于非壞死性大葉性肺炎組，說明肺炎支原體感染后，可引起肺部局部炎癥反應(yīng)增強及黏蛋白分泌增多，這與臨床上見到的纖維支氣管鏡下黏液栓及塑形性支氣管炎以肺炎支原體感染為主是相一致的，提示肺炎支原體感染后IL-17A、MUC5AC的高表達與肺炎支原體壞死性肺炎的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。病例組第二次灌洗后收集肺泡灌洗液再次檢測IL-17A及MUC5AC，發(fā)現(xiàn)病例組仍高于對照組，且壞死性肺炎組BALF中IL-17A、MUC5AC表達水平明顯高于非壞死性大葉性肺炎及對照組(P<0.05)，而非壞死性大葉性肺炎中兩種蛋白的表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明經(jīng)過治療后肺部局部炎癥反應(yīng)及氣道黏液高分泌的狀態(tài)得到一定控制，但是壞死性肺炎BALF中的IL-17A及MUC5AC水平雖然有一定程度的下降，但是較對照組及非壞死性肺炎組中的表達水平仍顯著升高，提示肺炎支原體壞死性肺炎的肺部局部炎癥免疫反應(yīng)及黏液高分泌狀態(tài)持續(xù)時間更長，這可能導(dǎo)致壞死性肺炎的病例住院時間及治療療程更長。本研究還分析了肺炎支原體壞死性肺炎和非壞死性肺炎組患兒的纖維支氣管鏡下表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)壞死性肺炎組患兒出現(xiàn)氣道黏液栓塞的比例更多，這與本研究中檢測的兩組BALF中MUC5AC在壞死性肺炎組患兒中表達水平更高相一致。

綜上所述，肺炎支原體感染后引起中性粒細胞增多，增多的中性粒細胞遷移至肺組織引起IL-17A釋放增多，而IL-17A又可以招募更多的中性粒細胞，并且IL-17A具有誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表達的能力，引起肺部過激的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致氣道黏膜損傷、氣道黏蛋白MUC5AC分泌增多，引起氣道黏液栓塞及氣道阻塞，進一步導(dǎo)致閉塞性支氣管炎、支氣管擴張、壞死性肺炎等的發(fā)生。

本研究通過分析肺炎支原體感染的大葉性肺炎及壞死性肺炎BALF中IL-17A、MUC5AC的表達水平，探討了這兩種蛋白分子的表達與肺炎支原體壞死性肺炎的相關(guān)性，并給肺炎支原體肺炎的治療提供了理論依據(jù)和新的靶點，為后期開發(fā)新的藥物提供了更多的選擇和方向。本研究尚有不足之處，沒有同步檢測患兒血清中的細胞因子水平，無法判斷及對比全身炎癥反應(yīng)與肺部局部免疫反應(yīng)是否平行發(fā)生。后期研究中預(yù)期收集肺泡灌洗液中的細胞提取RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過熒光定量PCR檢測IL-17A mRNA、MUC5AC mRNA的表達水平，在轉(zhuǎn)錄水平上揭示肺炎支原體感染后黏液高分泌的機制及對肺部并發(fā)癥的影響。