外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能與AECOPD合并膈肌功能障礙的相關(guān)性分析

楊寧梅 陽(yáng)元彬 杜鳳 羅鳳華

慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)是慢性阻塞性肺疾病患者住院和死亡的最常見(jiàn)原因[1]。由于長(zhǎng)期氣流受阻，肺過(guò)度充氣，可導(dǎo)致膈肌變形和功能進(jìn)行性減退[2-3]。線粒體是骨骼肌活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的主要來(lái)源，ROS過(guò)度產(chǎn)生可破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和 DNA，導(dǎo)致膈肌萎縮和功能障礙[4]，線粒體功能障礙可引起膿毒癥所致膈肌功能障礙使患者呼吸衰竭以及機(jī)械通氣脫機(jī)困難[5]。氧化應(yīng)激和全身炎癥反應(yīng)刺激下線粒體出現(xiàn)自噬異常，并與慢性阻塞性肺疾病骨骼肌功能障礙有關(guān)[6]，慢性阻塞性肺疾病合并外周骨骼肌功能障礙患者線粒體呼吸速率、呼吸控制率、線粒體DNA表達(dá)顯著降低[7]。本研究擬檢測(cè)AECOPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能，探討其與膈肌功能障礙的關(guān)系，以期臨床診治提供參考。

資料與方法

一、臨床資料

選擇2020年1月至2021年8月我院收治的115例AECOPD患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)診治中國(guó)專家共識(shí)(2017年更新版)》相關(guān)診斷流程和標(biāo)準(zhǔn)[8]；②年齡18周歲以上；③均接受超聲檢查，評(píng)估膈肌功能，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①急性肺水腫、肺氣腫、胸腔積液；②膈肌麻痹病史、外傷所致膈肌破裂，膈肌手術(shù)史；③肺間質(zhì)疾?。虎芟忍煨孕乩?；⑤格林巴利綜合征；⑥肺結(jié)核、肺癌、肺源性心臟?。虎哐合到y(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病。膈肌功能障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：①用力肺活量(FVC)<預(yù)計(jì)值的50%，仰臥位時(shí)下降超過(guò)30%；最大吸氣壓(MIP)<預(yù)計(jì)值的40%；②跨膈壓(Pdi)<40 cmH2O，膈神經(jīng)刺激誘導(dǎo)Pdi<28 cmH2O,膈肌張力緊張指數(shù)(TTdi)>1.5；③超聲提示膈肌厚度(功能殘氣位)<1.5～2 mm，膈肌厚度變異率<30%～36%，膈肌移動(dòng)度<10～14 mm。符合②或①、③中任何一項(xiàng)可診斷。115例患者中41例發(fā)生膈肌功能障礙(障礙組)，74例未發(fā)生膈肌功能障礙(無(wú)障礙組)，兩組性別、年齡、吸煙史、病程比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)，本研究已經(jīng)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(190518)。

表1 基線資料

二、線粒體功能檢測(cè)方法

入院24h內(nèi)采集空腹外周靜脈血5 mL注入肝素抗凝試管，等量磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋血液，F(xiàn)icoll-Paque (德國(guó)默克Sigma-Aldrich)密度梯度上分層，室溫下 800×g離心30 min，采用移液器從 Ficoll-Paque 和血漿間界面提取單核細(xì)胞，PBS洗滌兩次，800×g離心10 min，低滲氯化鈉(0.2%)、高滲氯化鈉(1.6%)分別重懸單核細(xì)胞1 min，PBS 洗滌離心。線粒體裂解液提取單個(gè)核細(xì)胞線粒體，Bradford 法測(cè)定線粒體蛋白濃度，線粒體濃度保持在2～3mg/mL線粒體。氧電極法測(cè)量狀態(tài)Ⅲ(ST3)、狀態(tài)Ⅳ(ST4)單位時(shí)間內(nèi)每毫克線粒體蛋白消耗氧的量[( nmoL·O2) /( min·mg· protein)]，計(jì)算呼吸控制率(RCR)=ST3/ST4×100%。雙波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定在516、495 nm波長(zhǎng)下線粒體跨膜電位吸光度值，跨膜電位采用熒光探針羅丹明123(Rh123)標(biāo)記指示劑標(biāo)記，計(jì)算516、495 nm波長(zhǎng)下吸光度值的差值為膜電位吸光度差，吸光度增加表示線粒體跨膜電位下降[10]。采用葡萄糖/己糖激酶系統(tǒng)測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)無(wú)機(jī)磷消耗的量，即三磷酸腺苷酶(ATP)生成水平，以nmoL/mg·min表示。

三、膈肌功能評(píng)估

1 肺功能檢查 入院24h內(nèi)采用FGC -A肺功能測(cè)試儀(安徽電子科學(xué)研究所)檢測(cè)肺通氣功能，患者坐位，鼻夾夾住鼻腔防止漏氣，囑患者深吸氣后咬住吹嘴以最大力度最快速度吹氣，儀器自動(dòng)測(cè)量記錄第1秒用力呼氣容積(FEV1)，F(xiàn)VC，囑患者呼氣后快速用力深吸氣，測(cè)量MIP。以上均重復(fù)測(cè)量3次，取3次測(cè)量的平均值。

2 呼吸力學(xué)檢測(cè) 入院24 h內(nèi)采用患者坐位，經(jīng)鼻置入2條頂端帶氣囊(10 cm×3.5 cm)的導(dǎo)管，1條置于胃內(nèi)，1條置于食道，置入后氣囊充氣(胃囊0.8 mL～1 mL，食道囊0.4 mL～0.6 mL)，導(dǎo)管外端連接壓力傳感器。囑患者先平靜呼吸，當(dāng)處于功能殘氣量時(shí)，夾緊鼻腔，緊閉聲門，以最大力度吸氣并做鼓腹動(dòng)作，測(cè)得平靜呼吸時(shí)兩個(gè)導(dǎo)管壓力差值為Pdi，功能殘氣量時(shí)兩個(gè)導(dǎo)管壓力差值為最大跨膈壓(Pdimax)，刺激器刺激膈神經(jīng)誘發(fā)膈肌顫搐，測(cè)定膈神經(jīng)刺激誘導(dǎo)Pdi和Pdimax，并記錄吸氣時(shí)間(Ti)與呼吸周期總時(shí)間(Ttot)，計(jì)算TTdi=(Pdi/ Pdimax)×(Ti/Ttot)[11-12]。以上均重復(fù)測(cè)量3次，取3次測(cè)量的平均值。

3 胸部B超檢查 入院24 h內(nèi)采用進(jìn)行超聲檢查，飛利浦EPIQ7C超聲診斷儀，患者平臥，正常呼吸，線陣探頭(頻率2.5～5MHz)置于第8～10肋間和右側(cè)腋前線之間，觀察呼吸狀態(tài)1 min，凍結(jié)吸氣末、呼氣末、功能殘氣量清晰圖像，測(cè)量平靜吸氣末、呼氣末、功能殘氣量時(shí)膈肌厚度，計(jì)算膈肌厚度變異率=[(吸氣末膈肌厚度-呼氣末膈肌厚度)/呼氣末膈肌厚度×100%]。更換心臟探頭(頻率3.0～5MHz)，置于腋下和肋弓下緣交界處，取肝臟聲窗，顯示膈肌運(yùn)動(dòng)圖像，測(cè)量吸氣末、呼氣末膈肌運(yùn)動(dòng)幅度，計(jì)算膈肌移動(dòng)度(吸氣末膈肌運(yùn)動(dòng)幅度-呼氣末膈肌運(yùn)動(dòng)幅度)。以上均重復(fù)測(cè)量3次，取3次測(cè)量的平均值[13]。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能評(píng)估結(jié)果比較

障礙組RCR、ATP低于無(wú)障礙組(P<0.05)，膜電位吸光度差高于無(wú)障礙組(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 兩組外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能評(píng)估結(jié)果差異

二、兩組膈肌功能評(píng)估結(jié)果比較

障礙組FEV1、FVC、MIP、Pdi、Pdimax、膈神經(jīng)刺激誘導(dǎo)Pdi、膈神經(jīng)刺激誘導(dǎo)Pdimax、功能殘氣位膈肌厚度、膈肌厚度變異率、膈肌移動(dòng)度均低于無(wú)障礙組(P<0.05)，TTdi大于無(wú)障礙組(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 兩組膈肌功能評(píng)估結(jié)果差異

三、AECOPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能與膈肌功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

AECOPD患者RCR、ATP與FEV1、FVC、MIP、Pdi、Pdimax、膈神經(jīng)刺激誘導(dǎo)Pdi、膈神經(jīng)刺激誘導(dǎo)Pdimax、功能殘氣位膈肌厚度、膈肌厚度變異率、膈肌移動(dòng)度呈正相關(guān)(P<0.05)，與TTdi呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；膜電位吸光度差與FEV1、FVC、MIP、Pdi、Pdimax、膈神經(jīng)刺激誘導(dǎo)Pdi、膈神經(jīng)刺激誘導(dǎo)Pdimax、功能殘氣位膈肌厚度、膈肌厚度變異率、膈肌移動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與TTdi呈正相關(guān)(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 AECOPD患者外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能與膈肌功能指標(biāo)的相關(guān)性

四、外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能診斷AECOPD患者膈肌功能障礙的價(jià)值分析

RCR、膜電位吸光度差、ATP診斷AECOPD患者膈肌功能障礙的截?cái)嘀禐?.80%、13.02、86.23 nmoL/mg·min，曲線下面積為0.734、0.665、0.705，低于Pdimax、TTdi(Z=2.433、5.475；2.901、5.965；2.317、5.390，P=0.015、<0.001；0.004、<0.001；0.021、<0.001)，與Pdi接近(Z=0.955、0.661、0.307，P=0.340、0.509、0.759)，聯(lián)合RCR、ATP、膜電位吸光度差診斷AECOPD患者膈肌功能障礙的曲線下面積為0.898，高于Pdimax(Z=2.125，P=0.034)，略低于TTdi(Z=2.818，P=0.005)(見(jiàn)表5、圖1)。

表5 外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能診斷AECOPD患者膈肌功能障礙的效能

圖1 外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能診斷AECOPD患者膈肌功能障礙的ROC圖

討 論

呼吸困難是AECOPD的主要臨床表現(xiàn)，呼吸肌收縮功能下降是導(dǎo)致呼吸困難的主要原因之一。膈肌是人體最主要的呼吸肌，在正常平靜狀態(tài)下膈肌收縮產(chǎn)生的吸氣量占總潮氣量的80%，在AECOPD發(fā)展過(guò)程中，受長(zhǎng)期氣道阻力增加、通氣需求增多、全身炎癥反應(yīng)、長(zhǎng)期使用類固醇、呼氣末正壓和過(guò)度充氣相關(guān)機(jī)械損傷等因素的影響，膈肌結(jié)構(gòu)和收縮功能發(fā)生改變[14]?，F(xiàn)有研究顯示慢性阻塞性肺疾病患者往往合并不同程度的膈肌功能障礙，膈肌功能障礙肺通氣功能下降，呼吸困難加重，低氧血癥、二氧化碳潴留，日?；顒?dòng)能力和生活質(zhì)量下降，并增加因頻繁急性加重而住院的風(fēng)險(xiǎn)[15]。膈肌功能障礙發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及肌纖維蛋白合成代謝受損、肌纖維蛋白降解增強(qiáng)、彌漫性炎癥和氧化應(yīng)激增加、代謝激素失衡、肌核細(xì)胞凋亡、自噬和肌纖維重塑等多個(gè)環(huán)節(jié)[16]，線粒體氧化應(yīng)激在膈肌功能障礙中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究發(fā)現(xiàn)障礙組RCR、ATP低于無(wú)障礙組，膜電位吸光度差高于無(wú)障礙組，表明AECOPD膈肌功能障礙患者存在外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能異常，線粒體功能變化可能是AECOPD膈肌功能障的潛在機(jī)制。線粒體是細(xì)胞能量產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，在產(chǎn)生ATP的同時(shí)可產(chǎn)生ROS，并可調(diào)節(jié)鈣反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和凋亡，線粒體功能異常與阿爾茨海默病、創(chuàng)傷性腦損傷、癲癇、癌癥等許多疾病發(fā)病有關(guān)[17]。線粒體在骨骼肌代謝和收縮活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，線粒體為骨骼肌收縮提供能量來(lái)源，線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致骨骼肌無(wú)力和疲勞，降低抗氧化能力，引起ROS生成增加，激活炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致骨骼肌蛋白水解增加和肌肉萎縮[18]。線粒體還可調(diào)節(jié)膈肌膜蛋白的合成和降解，線粒體功能失調(diào)可引起ROS大量產(chǎn)生，導(dǎo)致強(qiáng)烈氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化和功能改變， 增強(qiáng)細(xì)胞自噬和凋亡，與危重病患者膈肌功能障礙的發(fā)生有關(guān)[19]。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)AECOPD膈肌功能障礙患者RCR、ATP與FEV1、FVC、MIP、Pdi、Pdimax、膈神經(jīng)刺激誘導(dǎo)Pdi、膈神經(jīng)刺激誘導(dǎo)Pdimax、功能殘氣位膈肌厚度、膈肌厚度變異率、膈肌移動(dòng)度呈正相關(guān)，與TTdi呈負(fù)相關(guān)，膜電位吸光度差則相反，表明線粒體功能下降與AECOPD患者肺通氣功能下降，膈肌疲勞，膈肌厚度減少、收縮力減弱和運(yùn)動(dòng)力降低有關(guān)。檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞線粒體功能可反映AECOPD患者膈肌功能，為臨床提供更為簡(jiǎn)便、可重復(fù)性強(qiáng)的客觀生物學(xué)指標(biāo)。

Pdi被認(rèn)為是評(píng)估膈肌收縮強(qiáng)度的金指標(biāo)，但是需受試者配合平靜呼吸和用力呼吸，在一定程度上受主觀因素影響較大，綜合膈神經(jīng)刺激可提高診斷膈肌功能障礙的準(zhǔn)確性。TTdi綜合膈肌收縮強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間指標(biāo)，能反映膈肌耐力，與膈肌收縮力比較，膈肌耐力更能反映膈肌疲勞度[20-21]。本研究ROC分析結(jié)果顯示RCR、ATP、膜電位吸光度差診斷AECOPD膈肌功能障礙具有一定價(jià)值，聯(lián)合三項(xiàng)指標(biāo)后診斷效能明顯提高，略低于TTdi，與Pdi接近，說(shuō)明綜合檢測(cè)外周血線粒體功能可較好的判斷AECOPD患者膈肌功能障礙的發(fā)生，對(duì)臨床預(yù)防和治療提供參考。

線粒體功能失調(diào)引起AECOPD患者膈肌功能障礙的機(jī)制尚不明確，分析可能的原因有：首先，線粒體氧化應(yīng)激激活了內(nèi)源性凋亡、蛋白酶體、自噬等蛋白質(zhì)降解信號(hào)通路，導(dǎo)致膈肌蛋白質(zhì)降解增強(qiáng), 誘發(fā)膈肌功能障礙[22]。其次，線粒體功能失調(diào)導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化顯著降低，糖酵解增加，導(dǎo)致肌肉整體能量供應(yīng)減少[23]。第三，線粒體調(diào)節(jié)肌肉中神經(jīng)遞質(zhì)酶的活性，線粒體功能障礙可導(dǎo)致膈肌乙酰膽堿酯酶活性降低，引起膈肌功能障礙[24]。

綜上，AECOPD合并膈肌功能障礙患者外周血單核細(xì)胞線粒體RCR、ATP降低，膜電位吸光度差增高，線粒體功能失調(diào)與AECOPD患者肺通氣功能下降，膈肌疲勞，膈肌厚度減少、收縮力減弱和運(yùn)動(dòng)力降低有關(guān)，可作為AECOPD患者膈肌功能障礙診斷的潛在指標(biāo)。本研究樣本量偏少，不能代表所有AECOPD合并膈肌功能障礙患者，且為單中心研究，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本例數(shù)，開(kāi)展多中心研究加以證實(shí)。