碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌基因型檢測(cè)研究

萬(wàn)會(huì)林 曹小利 王小梅 韓亞飛 孔燕 趙丹妹 諸君

肺炎克雷伯菌是一種革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于哺乳動(dòng)物鼻咽和胃腸道中，是導(dǎo)致醫(yī)院感染發(fā)生的主要病原菌之一[1]。碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物是臨床抗感染常用藥物，包括亞胺培南、美羅培南、多尼培南等，其抗菌活性較強(qiáng)、抗菌譜較廣，且毒性較低，在治療革蘭氏陰性桿菌中具有重要應(yīng)用價(jià)值[2]。然而由于碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的濫用及不合理使用，導(dǎo)致病原菌對(duì)該類(lèi)藥物的耐藥性不斷增強(qiáng)，并導(dǎo)致碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)形成[3]。我國(guó)多項(xiàng)調(diào)查報(bào)道[4-5]，肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的耐藥性及CRKP檢出率呈逐年上升趨勢(shì)，CRKP感染治療已成為當(dāng)前臨床感染防控工作面臨的嚴(yán)峻考驗(yàn)。本研究檢測(cè)分析CRKP基因類(lèi)型并對(duì)患者臨床特征進(jìn)行分析，以期為臨床防控及治療CRKP提供參考。

資料與方法

一、臨床資料

回顧性分析我院2018年9月～2021年8月收治的56例分離出CRKP菌株患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)病原學(xué)檢測(cè)確診，經(jīng)血培養(yǎng)或痰培養(yǎng)，攜帶細(xì)菌鑒定結(jié)果為CRKP陽(yáng)性；(2)臨床資料完整；(3)年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)同一患者重復(fù)菌株；(2)可疑污染挑取血液或痰液可疑部位(膿、 黏液)涂片，革蘭染色后進(jìn)行顯微鏡檢查， 根據(jù)平均每個(gè)低倍視野下出現(xiàn)鱗狀上皮細(xì)胞(Squamous epithelial cells，SEC)和白細(xì)胞(white blood cell，WBC)的多少或比例，判斷送檢標(biāo)本污染程度，不合格標(biāo)準(zhǔn)[6]：SEC≥10個(gè)或WBC≤25個(gè)；SEC/WBC≥1.25；SEC>0，WBC=0。本次研究符合《赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。本次研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，符合審核標(biāo)準(zhǔn)，倫理同意號(hào)：(同)2021-019-01。

二、方法

1 CRKP耐藥基因檢測(cè) 使用PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序檢測(cè)CRKP耐藥基因(包括KPC、IMP、VIM、NDM-1、OXA-48)，引物參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]設(shè)計(jì)，并由TaKaRa生物技術(shù)公司合成，引物序列(見(jiàn)表1)。

表1 CRKP耐藥基因引物序列

2 細(xì)菌鑒定及耐藥性分析 使用全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(Vitek 2 Compact 30，法國(guó)生物梅里埃)進(jìn)行病原菌鑒定及耐藥性分析，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

三、觀察指標(biāo)

記錄患者年齡、性別、收治科室、標(biāo)本來(lái)源、合并基礎(chǔ)疾病情況、抗菌藥物使用情況、住院時(shí)間以及侵入性操作情況等資料。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、CRKP基因型分析

經(jīng)檢測(cè)及BLAST比對(duì)，56株CRKP中檢出47株KPC型耐藥基因(83.93%)、9株NDM-1型耐藥基因(16.07%)，未檢出IMP、VIM以及OXA-48耐藥基因(見(jiàn)表2)。

表2 56例CRKP基因型分析

二、不同基因型CRKP耐藥性分析

耐藥性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KPC和NMD-1型耐藥基因?qū)Π鼻夏退幮圆町愑薪y(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 不同基因型CRKP耐藥性分析

三、不同基因型CRKP患者臨床特征分析

KPC和NMD-1型耐藥基因?qū)?yīng)患者年齡、性別、收治科室、標(biāo)本來(lái)源分布情況、合并基礎(chǔ)疾病、抗菌藥物使用時(shí)間、3種及以上抗菌藥物聯(lián)用史、住院時(shí)間以及侵入性操作比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 不同基因型CRKP患者臨床特征分析

討 論

碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物是臨床治療革蘭氏腸桿菌屬細(xì)菌感染的常用藥物，然而由于該類(lèi)藥物頻繁及不合理使用使病原菌耐藥性不斷增強(qiáng)，最終導(dǎo)致耐碳青霉烯腸桿菌形成，給感染防控、醫(yī)療工作帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)[9-10]。CRKP是耐碳青霉烯腸桿菌中最常見(jiàn)的一類(lèi)細(xì)菌，同時(shí)也是臨床感染中最重要的病原菌之一，其在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，CRKP已成為當(dāng)前臨床上亟待解決的醫(yī)學(xué)難題[11-12]。

本文研究結(jié)果表明，56株CRKP檢出47株KPC型耐藥基因和9株NDM-1型耐藥基因，其檢出率分別為83.93%和16.07%，提示CRKP基因型主要以KPC型為主。黃秋艷等[13]研究報(bào)道，CRKP常見(jiàn)類(lèi)型為KPC，少見(jiàn)NDM-1和VIM，陳婭等[14]研究也表明，分離CRKP均檢出KPC型耐藥基因，均與本文研究結(jié)果相符。值得注意的是，CRKP耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，而其中產(chǎn)碳青霉烯酶是CRKP耐藥主要原因[15-16]。碳青霉烯酶主要包括A、B、D三類(lèi)，A類(lèi)主要水解頭霉素類(lèi)以外幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，其主要包括KPC、SME、GES等，B類(lèi)包括NDM-1、IMP、VIM等，相比于A類(lèi)酶檢出相對(duì)較少，其對(duì)青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)以及碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥性較強(qiáng)，對(duì)單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物較敏感，D類(lèi)主要包括OXA-48，在我國(guó)檢出率較低，其主要對(duì)苯唑西林有較強(qiáng)耐藥性[17]。本文研究結(jié)果表明，KPC型和NDM-1型耐藥基因?qū)Π鼻夏退幮杂忻黠@差異，氨曲南是臨床中常用的一種單環(huán)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物，結(jié)合前文研究表明耐藥性差異與基因型類(lèi)型不同有關(guān)，CRKP不同基因型對(duì)于不同抗菌藥物存在異質(zhì)性，臨床治療CRKP患者可結(jié)合基因檢測(cè)結(jié)果合理使用抗菌藥物，值得注意的是，本研究中KPC和NDM-1對(duì)其他常用抗菌藥物的耐藥性也有所差異，但由于樣本量較少，兩者未見(jiàn)顯著差異，后續(xù)還需收集更多樣本進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

本研究進(jìn)一步分析患者臨床特征，結(jié)果表明，56株CRKP收治科室分別為重癥監(jiān)護(hù)室、腫瘤科、神經(jīng)內(nèi)/外科、康復(fù)科、消化內(nèi)科、腎內(nèi)科、泌尿外科、呼吸科、感染科、內(nèi)分泌科、普外科，其中CRKP分離的臨床科室在重癥監(jiān)護(hù)室占比最高，占28.57%(16/56)，與相關(guān)研究報(bào)道相符[18]。重癥監(jiān)護(hù)室患者通常病情較嚴(yán)重，免疫功能較弱，病房環(huán)境相對(duì)復(fù)雜，且常常需要接受氣管插管、機(jī)械通氣、中心靜脈置管等侵入性操作，相比于其他科室患者更加容易發(fā)生感染，因此結(jié)合本文研究結(jié)果提示CRKP感染防控治療工作需重點(diǎn)關(guān)注重癥監(jiān)護(hù)室患者情況[19]。分析CRKP菌株標(biāo)本來(lái)源發(fā)現(xiàn)，56株CRKP菌株分別來(lái)源于痰樣、尿液、血液、膿液以及其他(膽汁、引流液等)，其中CRKP菌株來(lái)自痰樣標(biāo)本最多，占42.86%(24/56)，其次為尿液，占26.79%(15/56)，張侃等報(bào)道[20]，CRKP分離菌株主要來(lái)源于呼吸道和泌尿道，與本文研究結(jié)果相符。既往相關(guān)研究也報(bào)道[21]，呼吸道和泌尿道是人體與外界相通的腔道，是感染發(fā)生最常見(jiàn)的場(chǎng)所，結(jié)合本文研究結(jié)果提示，CRKP感染防控需加強(qiáng)患者呼吸道管理和基礎(chǔ)衛(wèi)生護(hù)理工作，以盡量避免患者發(fā)生呼吸道及尿路感染。但值得注意的是，本研究結(jié)果表明，兩組患者的年齡、性別、收治科室、標(biāo)本來(lái)源分布情況、合并基礎(chǔ)疾病、抗菌藥物使用時(shí)間、3種及以上抗菌藥物聯(lián)用史、住院時(shí)間以及侵入性操作等臨床特征比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往相關(guān)研究[22-23]結(jié)論有所不同，分析其原因可能與本研究采集樣本量較少所致，增加樣本量?jī)山M患者各指標(biāo)差異是否顯著化仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，CRKP基因型主要以KPC型最常見(jiàn)，占83.93%，不同基因型CRKP對(duì)常用抗菌藥物耐藥性存在異質(zhì)性，臨床抗感染治療需結(jié)合基因檢測(cè)及耐藥性分析制定合理方案，此外，不同基因型CRKP臨床特征無(wú)明顯差異，但由于樣本量較少，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可能存在片面性，研究結(jié)果可信度不高，此外，由于本研究樣本均取自同一中心病例，研究結(jié)論具有一定局限性，因此還需收集更多中心的樣本進(jìn)行多中心研究以完善本文研究。