大白菜抗干燒心病研究進展

魏小春，原玉香，李 林，龐文星，趙艷艷，董曉冰，楊雙娟，蘇賀楠，王志勇，趙佳琦，牛劉靜，張曉偉

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所 鄭州 450002； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院 沈陽 110000）

1926 年，Mcginty 等[1]首次發(fā)現(xiàn)生菜干燒心病，隨后干燒心病害在各類蔬菜中越來越常見。其中大白菜干燒心病在世界各地被廣泛報道，其發(fā)病程度、面積都在逐步增加，干燒心病害也逐漸成為大白菜的主要病害之一。干燒心病也稱“夾皮爛”（圖1），是一種由缺鈣引起的生理性病害。一般從蓮座期開始發(fā)病，發(fā)病時葉邊緣干枯，向內(nèi)傾卷，生長受到抑制；隨著病情的加重，嫩葉邊緣呈水漬狀、半透明，脫水后萎蔫呈白色帶狀；發(fā)病后期病株外觀未見異常，但其內(nèi)葉葉緣變干黃化，葉肉呈干紙狀，有不規(guī)則病斑，病健界限清晰。貯藏期發(fā)病易引起細菌感染，由干心變腐爛，嚴重影響其商品性。筆者對干燒心病的生理生化、鑒定方法及遺傳育種等方面的研究進行歸納總結(jié)。

1 大白菜干燒心病害國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

干燒心病害常出現(xiàn)在結(jié)球白菜、甘藍、菜花、萵苣等植物上，在歐美被稱為內(nèi)部頂燒?。╥nternal tipburn or tipburn）、內(nèi)腐?。╥nternal rot or internal break down）、內(nèi)部褐變?。╥nternal browing），日本稱之為心腐?。╤eart rot）、緣腐病（marginal rot）[2]。1946 年，Shafer 等[3]首次報道甘藍的干燒心病及其發(fā)病原因。從此國內(nèi)外學者相繼開展了大量的研究工作。其中美國Mynard 等[4]認為白菜和甘藍的“干燒心”癥狀、發(fā)病原因、發(fā)病機制基本相同，都是由缺鈣引起的生理性病害。Bangerth[5]也指出植物生理失調(diào)發(fā)病機制與其組織中鈣離子的含量有關，提高鈣離子的含量可減少病害的發(fā)生。

從20 世紀70 年代以來，干燒心病開始在國內(nèi)的一些?。ㄊ校┌l(fā)生。天津地區(qū)在1970—1979 近10年內(nèi)有6 年干燒心病的發(fā)病率在60%以上[6]。據(jù)1986 年對全國14 個有關?。ㄊ校┑恼{(diào)查結(jié)果，北自黑龍江、南到福建、東起遼寧大連、西至新疆都有不同程度的大白菜干燒心病[7]。對大白菜的產(chǎn)量和品質(zhì)造成了巨大的影響，已發(fā)展成為嚴重威脅大白菜生產(chǎn)的生理性病害。

鈣是大白菜生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，以Ca2+的形式存在于細胞中，Ca2+不僅對維持細胞壁和細胞膜結(jié)構至關重要，還可以保護細胞膜的完整性。Ca2+作為第二信使成分在調(diào)控大白菜生長發(fā)育和應對環(huán)境脅迫方面發(fā)揮著重要作用。植物根系從土壤中吸收Ca2+，經(jīng)根尖及成熟區(qū)根毛的表皮，穿過根的外皮層細胞，進入內(nèi)皮層，最后進入中柱，經(jīng)質(zhì)外體或共質(zhì)體途徑運輸至地上部分?？姺f等[8-10]認為，隨著缺鈣時間的延長，細胞壁膜上的鈣逐漸釋放到細胞間隙中，葉綠體片層膜上的鈣逐漸釋放到細胞液中。根據(jù)Ca2+-ATPase 活性的變化及其與細胞壁結(jié)構組分變化的關系，推測干燒心病的發(fā)生與細胞膜鈣泵活性變化誘導的鈣第二信使功能有關。

李林章等[11]對寧波地區(qū)甘藍干燒心病的研究結(jié)果顯示，蓮座期和結(jié)球期為該病的主要發(fā)生時期，心葉為主要的發(fā)病部位，發(fā)病早期心葉緣呈水浸狀、半透明，發(fā)病后期失水褐變干枯，嚴重影響甘藍的貯藏品質(zhì)，易腐爛。

張燁等[12]通過對山東省惠民縣大白菜干燒心病嚴重發(fā)生地塊土壤成分分析，發(fā)現(xiàn)其主要原因是缺錳。山東省農(nóng)業(yè)科學院高建偉[13]團隊研究發(fā)現(xiàn)，大白菜干燒心病也有細菌性干燒心類型，首次報道了菠蘿泛菌（Pantoea ananatis）可引起大白菜細菌性干燒心病，并對分離得到的P.ananatisY2 菌株進行生物學特征、全基因組測序及其引起大白菜干燒心病發(fā)病規(guī)律調(diào)查，共鑒定出29 個強致病相關基因。然而，目前尚未見所報道的29 個基因在大白菜葉片致病機制方面的研究，對其致病力的研究將有利于今后對葉片細菌性干燒心致病機制及大白菜對其抗性作用機制的解析[14]。

2 大白菜抗干燒心病生理生化研究

Kuo 等[15]研究表明，促進根部鈣離子的運轉(zhuǎn)及吸收是避免干燒心的有效措施。Aloni 等[16]研究表明，大白菜干燒心病的發(fā)生與幼嫩葉片中的鈣素含量呈顯著正相關。Saure[17]認為大白菜干燒心病與其說是缺鈣造成的生理性病害，不如說是一種因逆境脅迫造成的生理失調(diào)。大多學者都認為大白菜干燒心病是一種生理性缺鈣病害[18-21]，所謂生理缺鈣并非只有植株生長環(huán)境缺鈣才會導致，直接的病因是植株對鈣素的吸收利用受阻導致植株內(nèi)可利用的鈣含量滿足不了植株生長所需。

20 世紀80 年代，南開大學趙素娥等[22]從田間著手調(diào)查，開始了對大白菜干燒心病的研究工作，先后分析了氣候、土壤中鹽分與發(fā)病的關系，以及病株和健株不同部位鈣化物含量的比較，指出病株含鈣量明顯低于健株，尤其是內(nèi)葉。安志信等[18]通過心葉補鈣的方法證明此病是由缺鈣引起的生理性病害。王莉莉[21]研究結(jié)果表明，大白菜干燒心病是由土壤中缺少水溶性鈣和營養(yǎng)失調(diào)引起的，過量施氮也會嚴重影響植株對鈣的吸收，但也有個別學者認為干燒心病是由缺錳引起的[23-24]。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所測定，盡管典型鈣質(zhì)土中有效錳含量較低，石灰性土壤中的交換態(tài)錳含量和還原態(tài)錳含量可以保證作物所需，從化驗分析結(jié)果來看，病健株大白菜中的含鈣量并無明顯規(guī)律性，但其含錳量差異顯著，患病白菜含錳量較低。

張純胄等[25]通過葉面噴施的方法，證明在大白菜上噴施錳肥和硼肥比噴施鈣肥防治干燒心病的效果更好，他認為干燒心病在一定程度上與缺錳有關，但不是主要病因，其主要原因是缺水生長和營養(yǎng)吸收不暢引起的代謝失調(diào)。

繆穎等[9]研究了大白菜干燒心病發(fā)生過程中酶活性的變化情況，發(fā)現(xiàn)在缺鈣條件下細胞膜Ca2+-ATPase 的活性發(fā)生了變化。擬南芥Ca2+-ATPase 基因ECA的敲除可導致與大白菜干燒心病發(fā)病相似的表型。這些結(jié)果表明ECA可能參與了大白菜干燒心病的發(fā)病進程，進一步的Real-time PCR（熒光定量PCR）檢測結(jié)果證實，大白菜ECA和CAS基因的表達受鈣脅迫的影響，說明這2 個基因與大白菜干燒心病的發(fā)生密切相關。

對于植物來說，通過外質(zhì)體和陽離子通道從土壤中吸收Ca2+，在木質(zhì)部隨蒸騰作用向上運輸[26]。Ca2+在植物細胞中主要存儲在質(zhì)膜、液泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER），但胞質(zhì)Ca2+通過濃度的變化在宿主響應各種壓力信號。細胞質(zhì)Ca2+水平的調(diào)節(jié)提供了對環(huán)境刺激的快速反應，是通過Ca2+的運輸和存儲途徑系統(tǒng)實現(xiàn)的，外源鈣離子的缺失是干燒心病發(fā)生的誘因。

3 大白菜干燒心病抗性鑒定方法

由于大白菜自然生長周期較長，使得鑒定時期所需周期更長，干燒心病一般在內(nèi)葉發(fā)生比較嚴重，從外觀上并不能直觀地觀察到發(fā)病癥狀。抗性鑒定有利于快速、直觀地觀察干燒心病與抗干燒心病情況。大部分鑒定模式在幼苗期間進行，對于干燒心發(fā)生的情況可控，相對占用空間小，方便試驗管理，減少經(jīng)濟損失，有利于進一步的分子研究。目前，白菜干燒心病鑒定方法主要有傳統(tǒng)田間鑒定法、離體葉片扦插法、室內(nèi)苗期鑒定法3 種。

3.1 傳統(tǒng)田間鑒定法

將試驗材料育苗后定植在露天大田環(huán)境中，統(tǒng)一實行常規(guī)管理，結(jié)球期縱切剖開調(diào)查球心發(fā)病情況。優(yōu)點是田間鑒定較為準確，不需要溫室設施，降低成本。缺點是該鑒定方法費時費工，鑒定周期長，不宜用于大量材料的篩選，發(fā)病受環(huán)境條件影響大，不同年份之間發(fā)病情況差異較大，很難用于抗病育種實踐中。

3.2 室內(nèi)苗期鑒定法

張鳳蘭等[27]在大白菜育種工作中發(fā)現(xiàn)，不同品種和材料對大白菜干燒心病的抗性差異較大，初步建立了大白菜抗干燒心病的室內(nèi)人工鑒定技術，為培育大白菜抗干燒心病品種提供了有效手段。優(yōu)點是利用營養(yǎng)液進行育苗可以更準確地控制營養(yǎng)元素的含量，而且相比傳統(tǒng)模式，苗期鑒定法節(jié)省空間，節(jié)省成本，周期較傳統(tǒng)田間鑒定省時，更適合試驗研究。缺點是白菜幼苗期間需要適宜的溫度、光照、濕度環(huán)境條件，所以需要在培養(yǎng)室進行試驗。

3.3 離體葉片扦插法

日本學者吉川宏昭等[28]創(chuàng)建了離體葉片扦插法。優(yōu)點是能夠簡單、快速、省時地鑒定干燒心病發(fā)病情況。缺點是發(fā)病差異不明顯，適于大量材料粗劣的鑒定。

目前采用較多的方法是室內(nèi)苗期干燒心病鑒定方法，又稱為干燒心?。ㄈ扁}）抗性室內(nèi)鑒定方法。張鳳蘭等[27]根據(jù)過施氮會嚴重影響植株鈣吸收的原理，使用了配方中去除了Ca2+、且含N 成分增加1 倍的Hoagland 營養(yǎng)液進行室內(nèi)培養(yǎng)，初步確立了大白菜對干燒心病抗性的室內(nèi)苗期人工鑒定技術。隨后不斷完善，大白菜干燒心病苗期鑒定法能排除許多外界干擾，重復性好，能夠觀察到植株的整個發(fā)病過程，是一種相對準確的鑒定方法，但在培養(yǎng)時間的長短與始培養(yǎng)苗形態(tài)方面并未達成一致。開始處理的苗形態(tài)差異很大，有的采用種子播種直接缺鈣培養(yǎng)[29]，也有采用2 片[30]、8 片[7]、12 片真葉[6]幼苗培養(yǎng)，處理時間也各有不同。石姜超等[31]在玻璃溫室內(nèi)采用營養(yǎng)缽栽培，以珍珠巖為栽培基質(zhì)在使用前先用蒸餾水沖洗2 次，以避免鈣離子的干擾。采用缺鈣的Hongland 營養(yǎng)液配方，即除去原配方中的Ca（NO3）2，使其他含N 成分比原營養(yǎng)液增加約1 倍，總N 量和原營養(yǎng)液基本平衡。采用室內(nèi)苗期干燒心病鑒定方法的研究報道有很多，但仍存在幼苗黃化、干燒心癥狀不典型以及操作繁瑣等問題。

苗期鑒定法不受環(huán)境條件限制，準確率較高，適合少量材料精選。但在育苗和鑒定過程中會受到營養(yǎng)缽珍珠巖中鈣元素的干擾，因此苗期鑒定法還有改良的空間。隨著無土栽培技術的發(fā)展，改良苗期鑒定法－營養(yǎng)液水培鑒定法也成為一種創(chuàng)新的鑒定方式。雷娟利等[32]調(diào)查大白菜小黑點病時將帶有苗子的水培海綿定植到穴盤中，再統(tǒng)一放入盛有營養(yǎng)液的托盤里進行鑒定。王鑫[33]在調(diào)查白菜干燒心病時采用阿夫道寧營養(yǎng)液配方，將材料定植在營養(yǎng)液槽中進行苗期水培鑒定。營養(yǎng)液水培鑒定過程中避免了鈣元素的干擾，環(huán)境條件控制更加精確，無土栽培的興起為干燒心病鑒定模式提供了新的思路。

4 大白菜干燒心病抗性遺傳規(guī)律研究

大白菜在抗干燒心病和鈣吸收特性上存在基因型差異，但其發(fā)病受多種環(huán)境因素的誘導。對大白菜干燒心病害抗性遺傳規(guī)律的研究結(jié)果表明，此病害并不是簡單的顯性與隱性之間的關系，而是屬于非單一基因控制的數(shù)量性狀遺傳（表1）。

表1 大白菜干燒心病抗性遺傳規(guī)律研究進展

孫秀峰等[7]首次將大白菜干燒心病的研究深入到分子方面，構建了AFLP 分子遺傳圖譜，其中包含105 個標記位點、11 個連鎖群、覆蓋長度669.7 cM。在此基礎上檢測到分布在4 個連鎖群上的與抗干燒心病有關的4 個QTL 位點，解釋的遺傳變異范圍在11.0%～58.9%之間，符合正態(tài)分布，表明大白菜干燒心病抗病性受微效多基因控制，遺傳表現(xiàn)符合數(shù)量遺傳性狀特點。但偏度系數(shù)為負數(shù)表示該曲線呈負偏態(tài)，說明干燒心病可能由不等效多基因控制。將大白菜干燒心病的研究深入到分子水平，這為從分子角度揭示大白菜干燒心病發(fā)病機制和闡明合適的鑒定方法提供了理論依據(jù)，并為利用分子標記輔助選育大白菜抗干燒心病品種做出了開創(chuàng)性的工作。

李坤等[30]利用SSR 和SRAP 分子標記技術，篩選出2 個與干燒心性狀相關的QTL 位點和3 個與其緊密連鎖的分子標記，通過對QTL 位點加性效應分析可知提高干燒心病抗病性為增效位點，貢獻率分別為7.80%和16.50%，對F2代干燒心性狀進行正態(tài)分布檢驗，結(jié)果表明干燒心病抗病性遺傳不是簡單的顯隱性的關系，而是符合數(shù)量性狀遺傳的特征。黃萍等[34]利用AFLP 和BSA 相結(jié)合的方法，檢測到1 個與大白菜干燒心病基因緊密連鎖的AFLP標記E10/M05，該標記與干燒心病病情級數(shù)的相關系數(shù)為0.633，為極顯著正相關。石姜超等[31]采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法來觀察干燒心病發(fā)病過程，發(fā)現(xiàn)不同時期、不同植株的干燒心病表現(xiàn)不同，初步明確了不同病狀發(fā)病特點，F(xiàn)2代植株的抗病性呈現(xiàn)連續(xù)分布，干燒心病病害級別的次數(shù)分布呈現(xiàn)單峰曲線，符合正態(tài)分布，說明干燒心病抗病性受微效多基因控制，符合數(shù)量遺傳特征。劉俊峰等[35]以DH 群體為研究材料，構建了一張包含12 個連鎖群、108 個標記位點、覆蓋基因組長度1 004.7 cM、平均圖距9.30 cM 的InDel/SSR 標記連鎖圖，定位了1 個與干燒心性狀相關的QTL 位點，位于3 號染色體上，其貢獻率為12.30%，為增效位點，同時也對大白菜其他農(nóng)藝性狀的基因定位進行了研究，例如株高、株幅、外葉長、外葉寬、葉形指數(shù)等，為大白菜新品種的分子輔助育種提供了理論基礎。金秀卿等[36]報道了2 個與大白菜干燒心抗病性基因緊密連鎖的In-Del 標記，都位于7 號染色體，貢獻率都達到40.00%以上。王鑫[33]利用SSR 和InDel 分子標記構建了一個包含10 個連鎖群、64 個標記位點、總長度893.9 cM 的InDel/SSR 遺傳連鎖圖，共檢測出3個與大白菜干燒心抗病性性狀相關的QTL 位點，位于A01、A03、和A06 連鎖群上，貢獻率分別為12.10%、15.70%和9.40%。通過對每個群體的發(fā)病率和發(fā)病系數(shù)分析，峰值走向呈正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀遺傳特征。以上研究結(jié)果均表明，大白菜干燒心病抗性符合數(shù)量遺傳規(guī)律，部分貢獻率高的位點可以開發(fā)為分子標記，為分子標記輔助選育和抗病機制研究提供了理論依據(jù)。

Su 等[37]解析了鈣網(wǎng)蛋白BrCRT2（calreticulin 2）在大白菜抗干燒心中的作用，闡述了BrCRT2參與植物胞質(zhì)Ca2+濃度調(diào)控的新機制，該基因編碼的蛋白在其關鍵結(jié)構域中有17 個氨基酸的缺失，通過轉(zhuǎn)基因分析、Ca2+熒光標記和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離體的鈣離子結(jié)合/外排等試驗證明，這17 個氨基酸的缺失會導致該蛋白鈣離子結(jié)合能力下降，從而降低植物應對缺鈣脅迫的能力，最終導致干燒心病的發(fā)生。通過對抗、感2 種材料中的鈣濃度進行分析，結(jié)合先前報道的與鈣吸收和運輸相關的差異表達基因進行功能注釋和KEGG 途徑富集分析，發(fā)現(xiàn)鈣缺乏不是感病大白菜J95822 發(fā)生干燒心病的主要原因，而可能是由后期細菌感染引起的[38]。目前，用于生產(chǎn)的大白菜主栽品種大多不具備抗病性，此外，環(huán)境、栽培管理不當?shù)炔焕蛩鼐蓪е赂蔁牟“l(fā)生，嚴重影響大白菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，挖掘植物自身的抗干燒心基因、培育抗病新品種是解決白菜干燒心病的最佳途徑。

5 展 望

蔬菜干燒心病是由缺鈣引起的生理性病害，自1946 年Shafer 等[3]首次在甘藍上報道以來，國內(nèi)外專家對此病的誘因和致病機制進行了大量研究，并取得了一些進展。大白菜原產(chǎn)于我國，是廣大人民喜愛的一種傳統(tǒng)蔬菜，其種植歷史悠久、種類繁多。我國各種類型的白菜為抗病蟲害育種研究提供了極為豐富的種質(zhì)資源。干燒心病是大白菜生產(chǎn)上發(fā)生最普遍的一種生理病害，主要發(fā)生在白菜幼嫩葉片上，使大白菜失去食用價值和商品價值，造成嚴重產(chǎn)量損失。我國學者結(jié)合生理生化特征與遺傳規(guī)律方面進行深入系統(tǒng)的研究之后發(fā)現(xiàn)，大白菜在抗干燒心病和鈣吸收特性上存在基因型的差異，但是其發(fā)病受到多種環(huán)境因素的誘導。

國內(nèi)外在大白菜干燒心病的發(fā)生和防治方面已經(jīng)取得了很大的成績，比如在生產(chǎn)栽培方面合理安排播期避開高溫天氣，深耕改善土壤環(huán)境。生長期加強水肥管理，及時補施鈣素和葉面追肥進行防控等。但在不同基因型中篩選抗干燒心病材料方面仍缺乏簡便有效的方法。目前采用較多的方法是室內(nèi)苗期干燒心病鑒定方法[27]，種子播種直接缺鈣培養(yǎng)[29]，離體葉片數(shù)為2 片真葉[30]、8 片真葉[7]、12片真葉時[6]幼苗培養(yǎng)。關于苗期干燒心病鑒定方法研究報道有很多，但仍存在幼苗黃化、干燒心病癥狀不典型以及操作繁瑣等問題。雷娟利等[32]將帶有苗子的水培海綿定植到穴盤中，再統(tǒng)一放入盛有營養(yǎng)液的托盤里進行鑒定。王鑫[33]采用阿夫道寧營養(yǎng)液配方，將材料定植在營養(yǎng)液槽中進行苗期水培鑒定。營養(yǎng)液水培鑒定過程中避免了鈣元素的干擾，環(huán)境控制更加精確，為干燒心病鑒定模式提供了新的思路。

分子標記技術已被用于大白菜干燒心病的定位和分析，并輔助蔬菜育種。盡管如此，目前對大白菜干燒心的遺傳規(guī)律研究還不夠系統(tǒng)和深入。孫秀峰等[7]、李坤等[30]、黃萍等[34]、石姜超等[31]、劉俊峰等[35]、金秀卿等[36]、王鑫[33]等的研究結(jié)果均表明，大白菜干燒心病抗性符合數(shù)量遺傳規(guī)律，部分貢獻率高的位點可以開發(fā)為分子標記，為分子標記輔助選育和抗病機制研究提供理論依據(jù)。Su 等[37]解析了鈣網(wǎng)蛋白BrCRT2（calreticulin 2）在大白菜抗干燒心中的作用，闡述了BrCRT2參與植物胞質(zhì)Ca2+濃度調(diào)控的新機制，該基因編碼的蛋白在其關鍵結(jié)構域中有17 個氨基酸的缺失。

目前，用于生產(chǎn)的大白菜主栽品種大多不抗干燒心病。此外，環(huán)境不佳、栽培管理不當?shù)炔焕蛩鼐蓪е赂蔁牟“l(fā)生，嚴重影響大白菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，挖掘植物自身的抗干燒心基因、培育抗病新品種是防治白菜干燒心病的最佳途徑。利用現(xiàn)代生物技術的手段、結(jié)合改良的干燒心病鑒定方法，是植物營養(yǎng)學、分子生物學以及遺傳育種學之間的有機結(jié)合及交叉滲透，也是針對植物營養(yǎng)性狀基因在育種實踐中應用的探討，學科交叉融合也將使大白菜抗干燒心病育種取得更大的成就。