miR-27a下調(diào)表達對大鼠心肌缺血再灌注后急性肺損傷的保護作用及機制研究

古文玉， 徐桂萍， 陳 哲， 王曉麗

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia-reperfusion，MI/R)損傷是一種常見的臨床病理生理現(xiàn)象，是由于患者心肌長期缺血再恢復(fù)血液灌注后出現(xiàn)的嚴重心肌組織損傷和功能障礙[1]。雖然缺血再灌注發(fā)生在心臟，但除心臟外，對遠隔器官也可產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能的損傷，其中肺最易受累，早期即可表現(xiàn)出臨床癥狀[2]。MicroRNA(miRNA)是一種長度約為18～23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼微小RNA，在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起關(guān)鍵作用[3]。既往研究表明miR-27a在肺損傷中起保護作用，例如，miR-27a通過調(diào)節(jié)Toll樣受體4/髓樣分化因子88/核因子-κB通路減少炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，實現(xiàn)對脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的保護作用[4]。研究表明七氟醚可能通過上調(diào)miR-27a的表達，抑制促炎因子釋放從而改善脂多糖誘導(dǎo)的ALI[5]。然而，對于MI/R所致ALI，目前還沒有特異性的治療方法，尚少有miR-27a對大鼠MI/R所致ALI的研究，miR-27a是否能通過抑制炎癥反應(yīng)來保護MI/R所致ALI尚不清楚。本研究在MI/R肺損傷造模前對大鼠予尾靜脈注射抑制劑以下調(diào)miR-27a的表達，觀察大鼠肺損傷程度，明確下調(diào)miR-27a表達是否有肺保護作用，測量氧化應(yīng)激指標和炎癥因子，以探討其相關(guān)作用機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選擇清潔級8～12周齡成年雄性SD大鼠40只，體重250～300 g。飼養(yǎng)環(huán)境晝夜節(jié)律正常(12 h光/暗循環(huán))，相對濕度(55±15)%，溫度(25±2)℃。將40只大鼠隨機分為假手術(shù)組(SP組)、模型組(I/R組)、miR-27a抑制劑組(anta-27a+I/R組)、miR-27a抑制劑空白對照組(NC+I/R組)，每組10只。本研究獲新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(IA-CUC20170420-02)。

1.2試劑與儀器 監(jiān)護儀(美國邁瑞公司)；手術(shù)顯微鏡(德國Zeiss公司)；antagomir-27a、antagomir-NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；蘇木素(美國Sigma公司)；伊紅Y(中國醫(yī)藥集團有限公司)。白介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒均購自武漢Elabscience公司。

1.3大鼠MI/R所致ALI模型構(gòu)建[6]大鼠禁食12 h后稱體重并進行標記。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進行麻醉，固定大鼠，連接監(jiān)護儀。行T字形氣管切開，置入導(dǎo)管，連接呼吸機行輔助呼吸，調(diào)整呼吸機參數(shù)：潮氣量為4～5 ml/100 g，頻率為60次/min，呼吸比為2∶1。在左側(cè)第3～4肋間縱行切開，暴露心臟，顯微鏡觀察下尋找左冠狀靜脈主干，可見冠狀動脈的左前降支(left anterior descending，LAD)與之伴行，用6.0血管線于LAD起始部約4 mm處結(jié)扎，阻斷血流30 min，結(jié)扎時放置1根中間剪有一缺口的塑料軟管。結(jié)扎成功標準：肉眼可見心臟室壁運動減弱，左室前壁顏色變蒼白，心電圖表現(xiàn)為ST段抬高幅度>0.25 mV。阻斷血流30 min后，于塑料軟管缺口處，用眼科剪剪斷血管線開放血流，開放后縫合胸腔再灌注120 min。再灌注成功標準：缺血區(qū)顏色逐漸蒼白轉(zhuǎn)紅潤，ST段抬高幅度逐漸下降至約50%則提示再灌注成功。SP組同樣處理，但不進行血管結(jié)扎。anta-27a+I/R組與NC+I/R組手術(shù)前連續(xù)3 d分別予尾靜脈注射antagomir-27a、antagomir-NC 10 mg/kg，第4天行模型構(gòu)建。NC組尾靜脈注射等容量生理鹽水。

1.4大鼠血清IL-6和TNF-α檢測 在再灌注120 min時，每組隨機取大鼠5只，采腹主動脈血3 ml，4 ℃下3 500 r/min離心15 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測血清IL-6和TNF-α水平。

1.5大鼠肺組織濕干重比(wet/dry weight ratio,W/D)測定 在再灌注120 min時，取上述大鼠(方法1.4)右肺組織，生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱濕重。將右肺置于60 ℃烘箱中恒溫干燥48 h，稱干重，W/D=濕重/干重。

1.6大鼠肺組織MDA、SOD水平檢測 在再灌注120 min時，每組取另5只大鼠，麻醉后取新鮮右肺部分組織塊，用2～8 ℃的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)(0.01 M，pH 7.4)漂洗，濾紙吸干，稱重，放于勻漿容器中進行勻漿，取上清置于冰上待測。采用比色法嚴格按照試劑盒的操作步驟檢測肺組織MDA、SOD水平。

1.7HE染色 在再灌注120 min時，取上述(方法1.6)大鼠的左肺上葉組織，置于中性甲醛中固定，脫水，石蠟包埋切片后行HE染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.8大鼠肺組織IL-6和TNF-α水平檢測 在再灌注120 min時，取上述(方法1.6)大鼠左肺下葉組織，勻漿后離心，取上清液。采用ELISA法嚴格按照試劑盒說明書步驟檢測肺組織中IL-6和TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1四組大鼠肺組織病理學(xué)情況 光鏡下，SP組結(jié)構(gòu)清晰完整，無充血、出血、炎性細胞浸潤及肺泡間隔增厚。I/R組與NC+I/R組結(jié)構(gòu)破壞嚴重，細胞排列紊亂，肺泡腔內(nèi)大量炎性細胞浸潤，有明顯的肺泡充血、出血、肺泡間隔增厚，間質(zhì)滲出嚴重，可見大量中性粒細胞等炎性細胞浸潤。與I/R組和NC+I/R組比較，anta-27a+I/R組肺組織病理損傷程度明顯減輕，肺泡及肺間質(zhì)僅少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 四組大鼠肺組織光鏡下所見(HE染色，×200)

2.2四組肺組織W/D值比較 四組肺組織W/D值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=346.089，P<0.001)。與SP組比較，I/R組、anta-27a+I/R組、NC+I/R組肺組織W/D值顯著增加(P<0.05)。與I/R組和NC+I/R組比較，anta-27a+I/R組W/D值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NC+I/R組W/D值與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

W/D值：SP組(3.18±0.11)，I/R組(6.16±0.21)，NC+I/R組(5.96±0.18)，anta-27a+I/R組(4.65±0.14)。與SP組比較，aP<0.05；與I/R組比較，bP<0.05；與NC+I/R組比較，cP<0.05圖2 四組大鼠肺組織W/D值比較圖

2.3四組大鼠肺組織氧化應(yīng)激指標比較 與SP組比較，I/R組、anta-27a+I/R組、NC+I/R組肺組織中MDA水平更高，而SOD水平更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與I/R組和NC+I/R組比較，anta-27a+I/R組肺組織MDA水平下降，SOD水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NC+I/R組與I/R組MDA、SOD水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 四組大鼠肺組織MDA、SOD水平比較

2.4四組大鼠炎癥指標水平比較 與SP組比較，I/R組、anta-27a+I/R組、NC+I/R組肺組織和血清的TNF-α和IL-6更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與I/R組和NC+I/R組比較，anta-27a+I/R組肺組織和血清的TNF-α和IL-6水平顯著下降(P<0.05)。NC+I/R組與I/R組各指標比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 四組大鼠肺組織與血清TNF-α、IL-6水平比較

3 討論

3.1MI/R損傷是臨床上常見的病理現(xiàn)象，主要發(fā)生在心臟手術(shù)和心肌梗死后再灌注治療期間，再灌注造成心肌損傷的同時激活機體發(fā)生炎性反應(yīng)并釋放大量炎癥介質(zhì)和細胞因子，炎癥介質(zhì)經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)作用于遠隔臟器，導(dǎo)致多種遠隔器官的損傷，其中肺臟最易受累[7-9]。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是ALI的主要發(fā)病機制。SOD和炎癥因子的異常產(chǎn)生作用于肺毛細血管內(nèi)皮細胞，破壞其完整性，增加血管通透性，最終導(dǎo)致ALI的發(fā)生[10-11]。ALI主要表現(xiàn)為廣泛的炎癥、彌漫性肺泡損傷、肺水腫[12]。本研究中，與SP組相比，I/R組大鼠再灌注后肺W/D值增高，表明肺血管通透性增加，肺水增加。肺組織病理學(xué)結(jié)果顯示肺泡結(jié)構(gòu)破壞嚴重，肺泡腔內(nèi)大量炎性細胞浸潤，有明顯的肺泡充血、出血、肺泡間隔增厚，間質(zhì)滲出嚴重，提示大鼠在MI/R后發(fā)生了ALI，造模成功。與SP組比較，I/R組和NC+I/R組血清及肺組織的IL-6和TNF-α水平顯著升高，肺組織中MDA水平明顯增加，而SOD水平下降，表明大鼠MI/R激活了機體的炎癥反應(yīng)并且導(dǎo)致了肺組織氧化損傷。

3.2miR-27a是一種位于19號染色體的多功能因子，成熟的miR-27a有兩種異構(gòu)體：miR-27a-3p和miR-27a-5p。研究表明miR-27a在炎癥因子表達和氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[13]。氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化在心肌再灌注后遠隔器官損傷中起重要作用[14]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，可以反映脂質(zhì)過氧化程度；SOD是一種內(nèi)源性氧自由基清除劑，其水平可以反映機體的抗氧化能力。有研究報道，在小鼠腎臟的MI/R模型中，過表達miR-27a-3p靶向生長因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2，Grb2)促進氧化應(yīng)激，增加MDA水平，降低SOD水平，加重了腎損傷[15]。在暴露于七氟醚的新生小鼠中，下調(diào)miR-27a-3p表達可以通過上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體-γ減少炎癥反應(yīng)，并可通過降低氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達來減弱七氟醚誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡[16]。然而，目前尚無研究報道m(xù)iR-27a對MI/R后肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。本研究結(jié)果示，與I/R組和NC+I/R組比較，anta-27a+I/R組大鼠肺組織MDA水平降低，SOD水平增加，W/D值下降，病理結(jié)構(gòu)得到改善；而NC+I/R組與I/R組的氧化應(yīng)激指標、W/D值及病理學(xué)表現(xiàn)并無顯著差異。以上結(jié)果表明下調(diào)miR-27a表達可以減少MI/R后肺組織損傷的脂質(zhì)過氧化，增強機體抗氧化能力，從而產(chǎn)生肺保護作用。

3.3有研究發(fā)現(xiàn)，MI/R后產(chǎn)生的大量炎癥介質(zhì)與細胞因子隨血流輸送至肺，導(dǎo)致肺損傷，包括TNF-α、IL-6、IL-1和IL-8等[17]。TNF-α是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，是導(dǎo)致ALI的重要細胞因子之一。IL-6是應(yīng)激反應(yīng)中重要的介導(dǎo)物，參與全身免疫反應(yīng)和炎癥級聯(lián)反應(yīng)，可激活中性粒細胞，增加創(chuàng)傷后炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，加重組織損傷[18]。既往研究中miR-27a的表達對不同模型炎癥反應(yīng)的影響有著不同的結(jié)論。有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-27a的表達可以降低核因子-κB的磷酸化并抑制其DNA結(jié)合活性，下調(diào)TNF-α和IL-6的表達水平，最終減輕膿毒癥小鼠的肺部炎癥[19]。然而，在小鼠肝損傷模型中，antagomir-27a下調(diào)miR-27a表達后促進了炎癥反應(yīng)，抑制紫杉醇對肝損傷的保護作用[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI模型中，miR-27a表達顯著下調(diào)，agomir-27a上調(diào)miR-27a表達可以減少支氣管肺泡灌注液中TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥細胞因子的產(chǎn)生，降低肺W/D值，改善肺組織病理損傷，減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠ALI[21]。盡管以往研究證明miR-27a可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的ALI，但是關(guān)于miR-27a在MI/R導(dǎo)致的ALI中的作用尚未見報道。本研究中，與I/R組和NC+I/R組比較，anta-27a+I/R組血清和肺組織的TNF-α、IL-6水平下降，降低了肺組織W/D值，減輕了肺組織損傷，提示下調(diào)miR-27a表達具有抗炎作用，并能夠抑制MI/R導(dǎo)致的肺組織炎癥反應(yīng)，實現(xiàn)對肺組織的保護效應(yīng)。

綜上所述，下調(diào)miR-27a表達可以通過減輕氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，緩解MI/R后所引起的ALI。