奶牛小腸上皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型的建立

金 釗,張艷芳,周 華,紀(jì)雯雯,魏筱詩,王 翀,茅慧玲

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州311300)

隨著全球變暖的加劇，近10年來環(huán)境溫度不斷上升[1]。動物機體在嚴(yán)重的外界熱環(huán)境刺激下自身的產(chǎn)熱與散熱失衡，從而引起非特異性應(yīng)答反應(yīng)，即熱應(yīng)激。有調(diào)查指出58%以上的奶牛生活在溫濕度指數(shù)高達68以上的高溫亞熱帶地區(qū)，造成奶牛熱應(yīng)激[2]。

熱應(yīng)激能夠加劇活性氧(Reactive oxygen species，ROS)種類的生成，打破自由基和抗氧化系統(tǒng)的平衡，最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激[3-5]。且熱應(yīng)激狀態(tài)下，奶牛胃腸道收縮以重新分配外周血液來增加機體熱量的消耗，血流量減少導(dǎo)致腸上皮缺氧，從而損傷腸道的完整性，造成其生理功能下降，增加健康問題的風(fēng)險，最終降低奶牛產(chǎn)奶量[6]。因此，探索減輕奶牛痛苦，減少熱應(yīng)激引起經(jīng)濟損失的有效方法具有十分重要的意義。

本試驗利用奶牛小腸上皮細(xì)胞系，構(gòu)建奶牛小腸上皮細(xì)胞體外熱應(yīng)激模型，為進一步研究奶牛腸道在熱應(yīng)激狀態(tài)下的營養(yǎng)物質(zhì)吸收規(guī)律提供平臺和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

試劑：DMEM培養(yǎng)基和磷酸緩沖鹽溶液(上海生工生物工程有限公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)；青鏈霉素和細(xì)胞凍存液(杭州昊天生物技術(shù)有限公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；活性氧試劑盒(碧云天生物)；抗氧化相關(guān)酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；CCK-8試劑盒(MCE公司)。

儀器：CO2培養(yǎng)箱(THermo)、倒置顯微鏡(Motic)、酶標(biāo)儀(THermo)、T6 紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與試驗處理

永生化奶牛小腸上皮細(xì)胞系(取自空腸段)購自上海賽齊生物工程有限公司[7]。將奶牛小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗。

試驗采用單因素完全隨機試驗設(shè)計，43 ℃處理奶牛小腸細(xì)胞0、2、4、8、12 h，其中0 h即為對照組(37 ℃)，測定細(xì)胞存活率及細(xì)胞活性氧含量，初步篩選適宜的作用時間。在篩選出適宜43 ℃作用時間的基礎(chǔ)上，再測定抗氧化指標(biāo)，進一步確定建立奶牛小腸上皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型的條件。每組設(shè)3個重復(fù)，每個試驗重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞存活率檢測

取對數(shù)生長期的奶牛小腸上皮細(xì)胞以1×105個/mL的細(xì)胞密度接種于96 孔板上，每孔100 μL，經(jīng)43 ℃分別處理0、2、4、8、12 h后，將試驗孔更換為等體積新鮮培養(yǎng)液，加入10 μLCCK-8溶液，放回培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定試驗孔在450 nm波長下的吸光度。

細(xì)胞存活率% =(處理孔OD-空白OD)/(對照孔OD-空白OD)×100

1.4 細(xì)胞活性氧測定

細(xì)胞經(jīng)43 ℃分別處理0、2、4、8、12 h后，收集各孔細(xì)胞，超聲波破碎得到待測樣品。按照試劑盒說明書利用熒光探針DCFH-DA測定細(xì)胞ROS含量，數(shù)據(jù)以熒光值相對于0 h的倍數(shù)表示。

1.5 細(xì)胞抗氧化酶活性測定

細(xì)胞經(jīng)熱應(yīng)激(43 ℃)處理4 h后，收集各孔細(xì)胞，超聲波破碎得到待測樣品。按照試劑盒說明書分別測定總超氧化物歧化酶(total superoxid dismutase, T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(copper and zinc superoxide dismutase, CuZn-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和丙二醛(malonaldehyde, MDA)。其中T-SOD活性采用WST-1法測定，單位定義為每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為1個SOD活力單位(U)，比色波長為450 nm；CuZn-SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定，動物細(xì)胞內(nèi)有2種SOD，即CuZn-SOD和Mn-SOD，二者相加等于T-SOD，樣本經(jīng)前處理后Mn-SOD活力喪失，但CuZn-SOD活力不變，比色波長為550 nm；GSH-Px活性采用比色法測定，單位定義為每0.1 mL反應(yīng)液在37 ℃反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 μmol/L為1個酶活力單位，比色波長為412 nm；MDA采用硫代巴比妥酸法測定，比色波長為532 nm。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行整理后用SAS 8.0統(tǒng)計軟件中的ANOVA進行單因素方差分析，其中熱應(yīng)激處理時間選擇的數(shù)據(jù)用Duncan氏方差分析進行多重比較，試驗結(jié)果P<0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞存活率及活性氧含量

由表1可見，隨著作用時間的延長，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)。2 h組存活率76.1%，接近80%，細(xì)胞損傷較??；4 h組細(xì)胞存活率顯著降低至62.6%，符合建立熱應(yīng)激模型的條件；8 h和12 h組存活率進一步降低。

表1 熱應(yīng)激時間對奶牛小腸細(xì)胞存活率及活性氧含量的影響Table 1 Effects of heat stress on the cell viability andreactive oxygen species of cow intestinal epithelial cells

細(xì)胞內(nèi)ROS含量也隨著熱應(yīng)激時間的延長顯著上升(P<0.05)。

2.2 熱應(yīng)激對奶牛小腸上皮細(xì)胞形態(tài)的影響

由圖1可見，對照組(37 ℃)細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)正常且分布均勻；而熱應(yīng)激處理組(43 ℃)細(xì)胞間隙變大并出現(xiàn)脫落，且隨著處理時間的增長，細(xì)胞死亡數(shù)增加，尤其在12 h處理組，細(xì)胞呈現(xiàn)大片的死亡。

圖1 熱應(yīng)激時間對奶牛小腸上皮細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)Fig. 1 Effects of heat stress on the morphology of cow intestinal epithelial cells(×100)

2.3 熱應(yīng)激對奶牛小腸上皮細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶活性的影響

由表2可見，與對照組(37 ℃)相比，熱應(yīng)激組(43 ℃)總超氧化物歧化酶活、銅鋅合超氧化物歧化酶活和谷胱甘肽過氧化物酶活顯著降低(P<0.05)，丙二醛含量顯著增加(P<0.05)。

表2 熱應(yīng)激對奶牛小腸上皮細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶活性的影響Table 2 Effects of heat stress on the anti-oxidative enzyme activities U/mg prot

3 討 論

小腸是動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要器官，同時也是機體重要的防御屏障之一。當(dāng)動物處于熱應(yīng)激時，機體動用全身血液以維持自身的散熱功能，此時腸道便會因缺血缺氧而受到嚴(yán)重?fù)p傷[8]。小腸上皮細(xì)胞是一類更新速度很快的細(xì)胞，目前，在細(xì)胞水平研究奶牛熱應(yīng)激的報道主要集中在乳腺[9-10]，對奶牛小腸上皮的研究較少。因此，建立奶牛小腸上皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型，對于揭示熱應(yīng)激狀態(tài)下，營養(yǎng)物質(zhì)的吸收代謝機制，研究開發(fā)緩解熱應(yīng)激營養(yǎng)添加劑等有著重要意義。

本研究前期設(shè)定3個溫度(41 ℃，42 ℃及43 ℃)下分別處理奶牛小腸上皮細(xì)胞1 h，2 h及 3h，以摸索熱應(yīng)激的適宜溫度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在43 ℃處理下細(xì)胞存活率有影響，因此選擇43 ℃作為熱應(yīng)激的處理溫度(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。在熱應(yīng)激43 ℃處理下，細(xì)胞存活率與處理時間呈反比，處理時間越長，細(xì)胞存活率越低。細(xì)胞存活率過高說明外界刺激條件不顯著，相反，存活率過低則說明細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損傷。因此，選擇一個合適的細(xì)胞存活率作為建模參數(shù)至關(guān)重要。孔令聯(lián)等[7]認(rèn)為，不同細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型呈現(xiàn)的條件因細(xì)胞本身的耐受力不同而各異，選用細(xì)胞存活率的范圍在50%～70%為宜。細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除一旦發(fā)生失衡，過多的ROS使得機體自身的抗氧化系統(tǒng)處于過載狀態(tài)，破壞脂肪，蛋白質(zhì)及DNA的正常代謝，擾亂正常細(xì)胞的功能從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[11-12]。ROS的產(chǎn)生在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用[13]。本研究選擇的熱應(yīng)激處理時間為4 h，該條件下細(xì)胞的存活率為62.6%且ROS產(chǎn)量與對照組相比顯著上升，說明細(xì)胞發(fā)生了損傷且細(xì)胞存活率在建模適宜范圍之內(nèi)，符合建模條件。

正常狀態(tài)下，動物機體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)，代謝過程中產(chǎn)生的自由基能被體內(nèi)的抗氧化酶及時清除。而當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化，如斷奶，熱應(yīng)激等，機體的這種動態(tài)平衡便被打破，自由基不能被及時清除，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激[14]。機體內(nèi)，SOD是對抗自由基的第一道防線，GSH-Px可以清除超氧陰離子自由基，二者是機體抗過氧化能力的重要指標(biāo)，對機體的氧化與抗氧化平衡起關(guān)鍵作用[15]。另一方面，自由基過量產(chǎn)生導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物MDA含量顯著增加[16]，最終造成細(xì)胞損傷[17]。本試驗中，熱應(yīng)激處理細(xì)胞4 h后，抗氧化酶SOD，CuZn-SOD和GSH-Px的活性顯著下降，導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化防御能力下降，且MDA的含量顯著增加，說明細(xì)胞的氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)被打破，發(fā)生了氧化應(yīng)激。Wang等[12]研究報道奶牛卵巢顆粒細(xì)胞在40 ℃處理后顯著降低SOD和GSH-Px的酶活性，增加MDA的含量。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，西門塔爾和秦川雜交牛的空腸上皮細(xì)胞經(jīng)43 ℃處理2 h后SOD、GSH-Px酶活力顯著降低，MDA含量顯著增加。這些結(jié)果均說明細(xì)胞在熱應(yīng)激狀態(tài)下會發(fā)生氧化應(yīng)激，而熱應(yīng)激處理的溫度不同可能與研究的細(xì)胞不同有關(guān)，不同物種的不同細(xì)胞對溫度的耐受程度存在較大差異。

4 結(jié) 論

本試驗中，43 ℃條件下作用奶牛小腸上皮細(xì)胞4 h，可成功構(gòu)建奶牛小腸上皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型，為今后研究熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛腸道養(yǎng)分消化吸收提供平臺和基礎(chǔ)。