大腸桿菌脂多糖體外誘導(dǎo)羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥模型的建立

董 寧，郭洪冉，王志超，楊雨鑫

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

大腸桿菌學(xué)名是大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，E.coli)，是革蘭氏陰性菌中最為熟知的菌種，盡管在健康的腸道中低豐度，卻在動(dòng)物腸道內(nèi)普遍存在。大多數(shù)大腸桿菌菌株不會(huì)造成疾病，但是感染致病性大腸桿菌則會(huì)導(dǎo)致腹瀉、出血性腸炎，嚴(yán)重的時(shí)候會(huì)造成組織壞死和腸道穿孔，進(jìn)而引發(fā)溶血性尿毒癥綜合征、腹膜炎、革蘭氏陰性肺炎和敗血癥等疾病[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的主要成分，是一種可以引起機(jī)體免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)的內(nèi)毒素，在大腸桿菌感染性疾病中起到重要的調(diào)節(jié)作用。LPS可以與細(xì)胞膜表面Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)結(jié)合，通過(guò)NF-κB和MAP激酶相關(guān)信號(hào)通路途徑，誘導(dǎo)多種促炎癥因子(IL-1、IL-6和TNF-α等)的表達(dá)和分泌，引起炎癥反應(yīng)，清除病原體[2]。

在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫學(xué)中，研究者通常采用LPS構(gòu)建動(dòng)物體內(nèi)和體外急性應(yīng)激模型來(lái)研究動(dòng)物機(jī)體免疫功能，檢測(cè)藥物或天然植物提取物質(zhì)的抗炎癥治療效果。通過(guò)腹腔或靜脈注射LPS溶液構(gòu)建小鼠全身炎癥模型可以有效地研究藥物對(duì)敗血癥[3]、過(guò)敏性肺部損傷[4]、感染性急性腎衰竭[5]以及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[6]等伴隨著機(jī)體炎癥疾病的治療效果。LPS在體外細(xì)胞炎癥模型建立試驗(yàn)中應(yīng)用也十分廣泛。Soares等[7]使用LPS構(gòu)建體外牙髓細(xì)胞炎癥模型探討辛伐他汀與納米纖維聚l-乳酸復(fù)合支架對(duì)牙髓細(xì)胞(DPCs)的抗炎、牙源性和促血管生成作用。Zhao等[8]采用LPS構(gòu)建體外RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型探究雞腿菇和羊肚菌發(fā)酵液中總黃酮的抗炎作用。申靜[9]采用LPS構(gòu)建雞外周血單個(gè)核細(xì)胞探究蛋氨酸和葉酸對(duì)炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表觀遺傳機(jī)制的調(diào)控作用。

外周血單個(gè)核細(xì)胞由于來(lái)源簡(jiǎn)單易行，含有單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞多種免疫細(xì)胞，是一類(lèi)重要的免疫細(xì)胞，擔(dān)負(fù)著炎癥介導(dǎo)和病原體清楚的重要工作，因此被廣泛應(yīng)用于疾病治療方面的研究。陳瀚文[10]研究表明，外周血單個(gè)核細(xì)胞中的miRNA可以作為驗(yàn)證性腸病診斷和活動(dòng)度監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)記物。蔣俊艷等[11]通過(guò)研究炎癥性腸病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞LncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)明顯上調(diào)與炎癥指標(biāo)、病情活動(dòng)度密切相關(guān)的表達(dá)物，有助于炎癥性腸病的早期診斷。在槲皮素抗炎效果[12]、殼寡糖抗氧化應(yīng)激[13]、多種中草藥對(duì)免疫細(xì)胞的增殖[14]等研究中，外周血單個(gè)核細(xì)胞構(gòu)建的體外模型發(fā)揮著重要的作用。

本試驗(yàn)探究了不同作用時(shí)間和濃度的大腸桿菌LPS溶液對(duì)羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞活力和炎癥因子表達(dá)量的影響，篩選出最適的LPS作用濃度和時(shí)間建立體外羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥模型，為后續(xù)天然植物型飼料抗炎癥效果的探究奠定細(xì)胞試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與主要溶液配制

脂多糖、羊外周血單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒、RPMI 1640培養(yǎng)基、10×PBS、100×青霉素鏈霉素混合液、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液、Trizol細(xì)胞裂解液(Solarbio，中國(guó)北京)；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國(guó)上海)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞生物，中國(guó)湖南)；熒光定量PCR預(yù)混Mix(全式金，中國(guó)北京)。

1×PBS：用高溫滅菌后的超純水將10×PBS稀釋10倍，每100 mL的PBS加入1 mL的100×青霉素鏈霉素混合液，4 ℃封口備用。

LPS處理液：用1×PBS將LPS配制成1 mg/mL的母液，于-20 ℃分裝保存。用不加胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基將LPS母液稀釋為不同濃度的處理液，用于后續(xù)試驗(yàn)。

RPMI 1640完全培養(yǎng)基：向90 mL的RPMI 1640培養(yǎng)基中加入10 mL胎牛血清，配制含10%FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，4 ℃封口備用。

1.2 細(xì)胞分離及培養(yǎng)

1.2.1 細(xì)胞來(lái)源 試驗(yàn)選取5只常規(guī)方法飼養(yǎng)的6～8月齡健康陜北白絨山羊，靜脈采血置于肝素抗凝采血管中，并于采血后1～2 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞間進(jìn)行絨山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞分離試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分離方法 用等體積的全血及組織稀釋液稀釋抗凝血，用移液槍輕柔吹打混勻得到稀釋全血；向15 mL離心管中加入5 mL絨山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液，取等體積的稀釋全血加于分離液面上，保持分離液和稀釋全血之間界限分明，兩者總體積不超過(guò)離心管體積的1/3；2 500 r/min室溫水平離心25 min，液體出現(xiàn)明顯的分層，吸取云霧狀外周血單個(gè)核細(xì)胞層的細(xì)胞(不超過(guò)2 mL)于高溫滅菌的10 mL離心管中，加入5 mL細(xì)胞洗滌液，輕柔吹打混勻，1 200 r/min室溫水平離心10 min；棄上清液，保留細(xì)胞沉淀，再向離心管中加入5 mL的細(xì)胞洗滌液，輕柔吹散細(xì)胞沉淀，1 200 r/min室溫水平離心7 min；棄上清液，加入1 mL的RPMI完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液染色后，用牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞懸液密度，調(diào)整密度為5×106個(gè)/mL，用于后續(xù)培養(yǎng)及試驗(yàn)。

1.3 MTT檢測(cè)脂多糖對(duì)PBMC活力的影響

將剛分離出來(lái)的外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液調(diào)整密度為1×106個(gè)/mL，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，最外圍一圈培養(yǎng)孔用PBS填充，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)25 h，在終止培養(yǎng)前3 h、6 h、12 h每孔加入20 μL不同濃度的LPS處理液，使得LPS在培養(yǎng)基中的終濃度為0、0.016、0.08、0.2、0.4、1、2、4、6、8、10、50 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，2個(gè)空白對(duì)照孔(將100 μL細(xì)胞懸液換為不添加血清的RPMI 1640培養(yǎng)基)。終止培養(yǎng)后每孔加入10 μL MTT溶液，37 ℃、5%CO2孵育4 h，之后每孔加入Formazan溶解液100 μL繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育3 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察紫色結(jié)晶全部溶解后，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

1.4 熒光定量PCR檢測(cè)炎癥因子

將密度為5×106個(gè)/mL的羊外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液接種于6孔板中，每孔1.6 個(gè)/mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)26 h，在終止培養(yǎng)前3 h、6 h、12 h、24 h分別向每孔加入0.4 mL不同濃度的LPS處理液(終濃度為0、0.4、1、2、4、6、8、10 μg/mL)，每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)。結(jié)束培養(yǎng)后1 000 r/min收集細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度，每個(gè)樣本吸取含量為1 μg的RNA溶解液按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用20 μL的熒光定量PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1.5 μL、上下游引物各0.4 μL、Green qPCR SuperMix 10 μL、無(wú)酶水補(bǔ)足體系。采用兩步法進(jìn)行熒光信號(hào)采集：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。選取β-actin作為內(nèi)參基因，檢測(cè)各處理組中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量，引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Excel 2016軟件初步處理整合后，使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，使用繪圖軟件Graphpad 9進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PBMCs形態(tài)學(xué)觀察

新分離出的原代羊外周血單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)基中懸浮生長(zhǎng)，少量巨噬細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。在光學(xué)顯微鏡下觀察呈球形，折光率較強(qiáng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，外周血單個(gè)核細(xì)胞出現(xiàn)抱團(tuán)生長(zhǎng)的現(xiàn)象，細(xì)胞折光率降低，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始出現(xiàn)不規(guī)則變化，甚至有細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和破裂(圖1)。

圖1 羔羊外周血單個(gè)細(xì)胞體外培養(yǎng)Fig.1 In vitro culture of lamb PBMC

2.2 LPS對(duì)羊外周血單個(gè)核細(xì)胞活力的影響

如圖2所示，在相同時(shí)間內(nèi)，隨著LPS處理濃度的升高，外周血單個(gè)核細(xì)胞的相對(duì)活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但是與對(duì)照組相比均差異不顯著。在處理3 h時(shí)，濃度為0.4、2 μg/mL時(shí)細(xì)胞相對(duì)活性達(dá)到峰值；在處理6 h時(shí)，濃度為0.2 μg/mL時(shí)細(xì)胞相對(duì)活性達(dá)到峰值；在處理12 h時(shí)，濃度為0.4 μg/mL時(shí)細(xì)胞相對(duì)活性達(dá)到峰值。

圖2 不同LPS處理時(shí)間外周血單個(gè)核細(xì)胞相對(duì)活性柱上標(biāo)相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同F(xiàn)ig.2 Relative activity of PBMCs at different timestreated with LPSThe same or the absence of letters above columns indicateinsignificant difference(P>0.05),different lowercase lettersindicate significant difference(P<0.05),different capitalletters indicate highly significant difference(P<0.01).The same below

2.3 LPS對(duì)羊外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥因子表達(dá)量的影響

LPS處理后羊外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥因子表達(dá)量見(jiàn)圖3。

由圖3A可見(jiàn)，IL-1β處理3 h，各處理組之間IL-1β基因相對(duì)表達(dá)含量差異不顯著(P>0.05)；處理6 h時(shí)，2、4、6、8、10 μg/mL濃度處理組IL-1β基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均極顯著升高(P<0.01)，1 μg/mL濃度處理組IL-1β基因相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，除0.4 μg/mL以外其他濃度處理組IL-1β基因相對(duì)表達(dá)量較3 h和12 h均有所升高；處理12 h，濃度為2 μg/mL時(shí)相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。處理6 h、處理濃度為10 μg/mL時(shí)，IL-1β的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值。

IL-6的表達(dá)量如圖3B所示，LPS處理3 h，濃度為6、10 μg/mL相對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；LPS處理6 h，濃度為6、8、10 μg/mL處理組的IL-6相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他各組(P<0.01)，并且在8 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值；處理12 h，濃度為6 μg/mL處理組相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他各組(P<0.01)。當(dāng)處理時(shí)間為3 h、處理濃度為6 μg/mL時(shí)，IL-6的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值。

如圖3C所示，LPS處理3 h，濃度為1、2、4、6、8 μg/mL時(shí)IL-10基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組之間存在極顯著性差異(P<0.01)；處理6 h，濃度4 μg/mL組相對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，濃度2、6 μg/mL組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；處理12 h，濃度1、4 μg/mL組相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。處理6 h、處理濃度為4 μg/mL時(shí)，IL-10的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值。

如圖3D所示，LPS處理3 h，濃度為4、6 μg/mL處理組TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)；處理6 h，1、4 μg/mL處理組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；處理12 h，2、4、6 μg/mL處理組與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)。處理6 h、濃度為1 μg/mL時(shí)，TNF-α的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值。

圖3 LPS對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥因子相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of LPS on the relative expression of inflammatory factors in PBMC

綜上所述，LPS處理時(shí)間為6 h時(shí)，各細(xì)胞炎癥因子表達(dá)量普遍達(dá)到峰值。結(jié)合細(xì)胞相對(duì)活力結(jié)果，應(yīng)選取濃度為4 μg/mL、處理時(shí)間為6 h建立LPS體外誘導(dǎo)的羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥模型，用于后續(xù)試驗(yàn)。

3 討 論

本試驗(yàn)采用LPS構(gòu)建羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥模型，探究了不同作用濃度和時(shí)間，羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活力、IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α炎癥因子的表達(dá)量，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)LPS濃度高于6 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活性低于對(duì)照組。在相同處理時(shí)間條件下，隨著處理濃度的升高，細(xì)胞相對(duì)活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，各處理組之間差異不顯著。在處理濃度小于6 μg/mL，處理時(shí)間在12 h之內(nèi)細(xì)胞活性沒(méi)有顯著性變化。LPS對(duì)羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞活力變化趨勢(shì)的影響與吳華[15]研究中細(xì)胞活性的變化趨勢(shì)一致，但是不同動(dòng)物的外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)LPS溶液具有不同的耐受程度，本試驗(yàn)中建立的外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥模型，LPS的處理濃度應(yīng)小于6 μg/mL。羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外未加刺激時(shí)存活時(shí)間較短，在培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)大量細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞活性逐漸受到抑制，因此本試驗(yàn)選取3 h、6 h和12 h 3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)檢測(cè)LPS對(duì)細(xì)胞活性和炎癥因子表達(dá)量的影響。

外周血單個(gè)核細(xì)胞體外疾病模型被廣泛運(yùn)用于各種藥物作用效果的研究中。Du等[16]采用LPS構(gòu)建人外周血單個(gè)核細(xì)胞體外炎癥模型探究異佛司可林和佛司可林對(duì)炎癥的抑制作用；Yu等[17]通過(guò)外周血單個(gè)核細(xì)胞體外模型探究人絨毛膜促性腺激素對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響；Garcia-Campos等[18]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法探究綿羊和牛感染肝片吸蟲(chóng)后外周血單個(gè)核細(xì)胞中基因表達(dá)的差異變化，以求尋找新的預(yù)防和治療方法，包括新的活性化合物和疫苗。因此探究羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)條件，構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥模型，可為新型植物提取物的抗炎作用的探究提供便利和細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

IL-1β、IL-6和TNF-α是內(nèi)源性致熱源，可引起機(jī)體發(fā)熱以及組織細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，釋放一系列炎性介質(zhì)，引發(fā)組織損傷。IL-1β和IL-6最初被發(fā)現(xiàn)作用于白細(xì)胞之間因此被稱(chēng)為白細(xì)胞介素[19]。IL-1β出現(xiàn)各種能夠引起炎癥反應(yīng)的疾病中，可以促進(jìn)Th1對(duì)疾病的應(yīng)答，同時(shí)可促進(jìn)NLRP3炎癥小體的產(chǎn)生，進(jìn)而加重疾病造成的炎癥反應(yīng)[20]。IL-6可由多種免疫細(xì)胞分泌，既可以促炎又可以抗炎，可以刺激Th17細(xì)胞的產(chǎn)生，分泌IL-17和IL-10細(xì)胞因子，抑制Th17細(xì)胞的致病功能[21]。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[22]。IL-10可拮抗炎癥介質(zhì)，通過(guò)控制炎癥反應(yīng)，避免組織過(guò)度損傷[23]。本試驗(yàn)中，IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的表達(dá)量隨著LPS處理濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這可能是由于LPS濃度過(guò)高抑制了外周血單個(gè)核細(xì)胞的活性，從而降低了炎癥因子的分泌量。隨著處理時(shí)間的增加，炎癥因子表達(dá)量也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但是IL-1β的相對(duì)表達(dá)量在處理時(shí)間為6 h時(shí)，除了0.4 μg/mL處理組外其余各濃度處理組均高于3 h和12 h，其他炎癥因子在時(shí)間維度的變化趨勢(shì)并不顯著。整體來(lái)說(shuō)，處理時(shí)間為6 h時(shí)，各炎癥因子表達(dá)量達(dá)到峰值。因處理濃度高于6 μg/mL時(shí)細(xì)胞活性低于對(duì)照組，所以選取處理濃度為4 μg/mL建立體外炎癥模型。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，LPS處理濃度和處理時(shí)間對(duì)細(xì)胞相對(duì)活性沒(méi)有顯著影響。IL-1β的相對(duì)表達(dá)量在LPS處理6 h、處理濃度為10 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值，且除0.4 μg/mL以外，其余各濃度處理組均顯著高于對(duì)照組。IL-6的相對(duì)表達(dá)量在處理3 h、處理濃度為6 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值。IL-10的相對(duì)表達(dá)量在處理6 h、處理濃度為4 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值。TNF-α的相對(duì)表達(dá)量在處理6 h、處理濃度為1 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值。建議以處理時(shí)間為6 h、處理濃度為4 μg/mL建立LPS體外誘導(dǎo)的羔羊外周血單個(gè)核細(xì)胞炎癥模型，可以在保證細(xì)胞相對(duì)活力不受影響的同時(shí)提高炎癥因子表達(dá)量。