長(zhǎng)距彗星蘭花蜜距石蠟切片的制備和顯微結(jié)構(gòu)的觀察

崔以璨

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 湖北武漢 430079)

1 彗星蘭的主要特點(diǎn)

蘭科是僅次于菊科的單子葉植物中的第一大科，有2萬(wàn)多個(gè)物種和悠久的栽培歷史，野生蘭科植物的分布范圍極為廣泛的，大多集中在熱帶和亞熱帶。彗星蘭(Angraecum)是蘭科彗星蘭亞族彗星蘭屬植物(圖略)[1]，這種植物原產(chǎn)于非洲大陸的馬達(dá)加斯加半島，是那里所特有的。本文研究的是彗星蘭其中的一個(gè)物種—長(zhǎng)距彗星蘭(Angraecum sesquipedale Thouars)，常被稱為“達(dá)爾文蘭”，其最突出的特點(diǎn)即是其唇瓣特化，有長(zhǎng)達(dá)近30 cm的花蜜距。

長(zhǎng)距彗星蘭唇瓣向后延長(zhǎng)呈管狀，形成細(xì)長(zhǎng)的花蜜距(圖略)，長(zhǎng)度可達(dá)30 cm。長(zhǎng)距彗星蘭花蜜距里面有腺體等結(jié)構(gòu)，花蜜則是由此類腺體分泌而形成，花蜜在花蜜距的底部。

2 實(shí)驗(yàn)材料和研究方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

本試驗(yàn)的試驗(yàn)材料為長(zhǎng)距慧星蘭，于2021年12月在上海辰山植物園溫室內(nèi)取得后移栽回華中師范大學(xué)9號(hào)樓。待植物生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后采摘，在開放的新鮮花上取下花蜜距，將其浸泡在FAA固定液中保存后供實(shí)驗(yàn)使用。

2.2 研究方法

石蠟切片法的具體步驟如下：

(1)固定與洗滌:在自然界中獲得的材料一般先放入FAA固定液中保存固定，直至需要使用時(shí)再取出。取出的材料要去除附著的固定液，以免影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。該洗滌步驟用流動(dòng)的蒸餾水沖洗，并在蒸餾水中浸泡2 h左右直至固定液被完全洗去。

(2)脫水:固定后的組織內(nèi)充滿水分，若不去除水分則后續(xù)的步驟如染色效果將不太理想。酒精即為最常見(jiàn)的脫水劑，按濃度梯度順序進(jìn)行浸泡脫去材料中的水分。將材料放入梯度酒精中浸泡1 h-2 h，再兩次放入無(wú)水酒精中，每次脫水1 h-2 h。后續(xù)透明時(shí)二甲苯浸泡的材料塊周圍沒(méi)有出現(xiàn)水霧狀即為脫水完全，若透明過(guò)程中材料塊周圍出現(xiàn)水霧狀則需要重新退回?zé)o水酒精中脫水。

(3)透明:配制無(wú)水酒精和二甲苯1：1等比混合的試劑，將脫水后的材料放入并浸泡1 h-2 h，再放入二甲苯中1 h-2 h[2]。

(4)浸蠟:將材料與1:1等量混合的二甲苯和石蠟一起放入小坩堝中，蓋上蓋子于42 ℃的烘箱內(nèi)放置24 h；后將蓋子打開，調(diào)溫度為60 ℃，恒溫24 h，此步驟的目的是讓二甲苯蒸發(fā)；24 h后傾去原溶液，將材料轉(zhuǎn)移至有熔融石蠟的小坩堝中，每隔1 h-3 h換一次純蠟，共換三次。

(5)包埋:將石蠟與材料倒入紙盒，用鑷子整理材料使材料切面向下，位置放正。將紙盒內(nèi)石蠟倒?jié)M后，靜置紙盒等待直至石蠟表面凝固出一層薄膜。將紙盒迅速放入冷水中使其凝固，然后反轉(zhuǎn)紙盒將其壓入水底，等待12 h后取出。

(6)切片與貼片:包埋好的蠟塊拆去紙盒修整成立方體，用膠水將其底部貼附于小木塊上，將處理好的小木塊放入冰室冷凍片刻使包埋材料與木塊間的粘性更強(qiáng)后取出。將木塊夾緊，調(diào)整到方便操作的合適位置，將切片厚度設(shè)置為8 μm，向著同一個(gè)方向勻速轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)的搖桿，使切片連續(xù)不斷的切下。

用鑷子將切片夾到41 ℃水浴鍋中，待切片自然展開后，用涂有蛋白甘油的玻片抄起，撥正位置后放入45 ℃烘箱中烘干直至石蠟熔化。

(7)切片脫蠟:將烤干的切片放入二甲苯溶液中，充分浸泡2 min，再重復(fù)上述操作一次，以便脫去玻片上材料周圍的石蠟。

(8)復(fù)水:將切片依次放入梯度酒精和蒸餾水中各浸泡1 min-2 min。

(9)番紅染色:配置濃度為1%的番紅染液，將操作后的切片放入其中染色1 min-2 min。

(10)脫色:將切片放入梯度酒精中，每個(gè)濃度浸泡1 min。

(11)固綠染色:配置0.5%的固綠染液，將切片放入其中染色45s左右。后放入無(wú)水乙醇中脫色1min。此步驟結(jié)束后即可將玻片放在顯微鏡下觀察植物的組織結(jié)構(gòu)。

(12)封片:切片置于60 ℃烤箱中烤干，在二甲苯中透明5 min后滴加1-2滴中性樹膠封片。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1 橫切面顯微圖

圖1所示即為長(zhǎng)距彗星蘭花蜜距在光學(xué)顯微鏡4倍鏡下觀察到的整體橫切圖，長(zhǎng)距彗星蘭的花蜜距是管狀結(jié)構(gòu)，中間呈空心狀。

3.2 表皮細(xì)胞

彗星蘭是單子葉植物，內(nèi)外兩側(cè)覆蓋表皮細(xì)胞，起到保護(hù)的作用，內(nèi)外兩側(cè)的表皮分別為上表皮和下表皮，根據(jù)觀察可看出表皮細(xì)胞呈方形，外壁較厚，彼此互相嵌合，連接非常緊密，除了氣孔之外沒(méi)有任何間隙，如圖2所示。為適應(yīng)光合作用氣體交換以及提高地上部水勢(shì)的需要, 植物表皮細(xì)胞進(jìn)化出通道, 逐漸形成氣孔。根據(jù)觀察圖3圈出部位可以看到在花蜜距的內(nèi)側(cè)表皮上有一對(duì)啞鈴型的細(xì)胞，那是單子葉植物表皮上的保衛(wèi)細(xì)胞，一對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞中間出現(xiàn)橢圓形的裂口即為氣孔。氣孔的作用是調(diào)節(jié)和控制植物與外界環(huán)境之間的氣體交換以及水分的散失?？梢钥闯龃藭r(shí)內(nèi)側(cè)表皮上的氣孔是處于關(guān)閉狀態(tài)的。

圖1 花蜜距橫切顯微結(jié)構(gòu)圖

圖2 花蜜距表皮細(xì)胞

圖3 氣孔

3.3 維管組織

觀察圖4可以看到花距橫切顯微圖中有一圈染色較深的明顯部分，在基本組織中分散著的各種細(xì)胞緊密結(jié)合形成的束狀結(jié)構(gòu)是植物的維管組織。因?yàn)殄缧翘m是單子葉植物，與雙子葉植物無(wú)限閉合維管束不同的是單子葉彗星蘭的維管束是有限的，維管束相互連接構(gòu)成維管系統(tǒng)。維管組織包括木質(zhì)部和韌皮部，起到一定的支持功能，并對(duì)植物適應(yīng)陸生環(huán)境起到一定的幫助。木質(zhì)部細(xì)胞大并且排列較為蓬松，這部分質(zhì)地堅(jiān)硬，自下向上的主要輸導(dǎo)水分，同時(shí)與礦物質(zhì)的運(yùn)輸有關(guān)。韌皮部細(xì)胞小并且排列緊密，這部分質(zhì)地較韌，自上而下的主要運(yùn)輸有機(jī)養(yǎng)料，圖4為光學(xué)顯微鏡下維管束中木質(zhì)部和韌皮部具體結(jié)構(gòu)示意圖。

3.4 分泌組織

觀察圖5可以看到花蜜距內(nèi)側(cè)表皮有呈棒狀的突起，疑似是表皮系統(tǒng)中起分泌作用的腺毛，腺毛是植物的一種外分泌結(jié)構(gòu)。腺毛的種類繁多、形態(tài)各異，有防御作用、降毒作用，還可以合成、積累和儲(chǔ)存各種類型的天然產(chǎn)物。

圖4 維管組織

圖5 表皮內(nèi)的腺毛

4 思考與討論

4.1 不足與反思

在切片過(guò)程中反復(fù)出現(xiàn)幾個(gè)問(wèn)題：第一是偶爾切片會(huì)變成小卷堆疊在切片機(jī)的刀片上，不成帶。分析得知可能因?yàn)槭鞘覂?nèi)的溫度過(guò)低。因?yàn)槭覝丶笆灥娜埸c(diǎn)對(duì)切片的厚度有很大的影響[3]。切片較厚，高溫的影響較小，切片愈薄，對(duì)高溫愈敏感。第二是切片時(shí)蠟片不易連成蠟帶，組織塊易破碎,攤片時(shí)皺折多。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件猜測(cè)是因?yàn)槌Ｓ糜诮炁c包埋的石蠟中含有空氣及雜質(zhì)。有雜質(zhì)和空氣進(jìn)入的石蠟往往韌性較差,硬度不適當(dāng)?？梢栽谑炛屑尤胍欢康姆湎?可提高蠟塊的硬度和韌度，切片時(shí)手感好, 易連片[4]。第三是切片向某一側(cè)彎曲而導(dǎo)致不能形成直帶，推測(cè)是因?yàn)橄瀴K在此之前并未修整成規(guī)整的立方體或者是蠟塊與切片刀的刀面沒(méi)有保持平行。第四是切片上出現(xiàn)裂紋，反思實(shí)驗(yàn)過(guò)程推測(cè)可能的原因是組織材料較硬或是在包埋的過(guò)程中石蠟冷凍太慢。實(shí)驗(yàn)中使用的番紅染液的配制應(yīng)選擇用蒸餾水取代酒精，這樣染色效果好，不易被褪色。洗去番紅和固綠浮色時(shí)，因酒精對(duì)番紅有分化作用，所以應(yīng)避免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)導(dǎo)致染液顏色被褪色[4]。

本次實(shí)驗(yàn)的目的是為了觀察到長(zhǎng)距彗星蘭花蜜距的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)。因此在一個(gè)玻片上應(yīng)該放有多個(gè)連續(xù)不斷的帶有組織材料的石蠟切片，以便后續(xù)在顯微鏡下觀察時(shí)可以看到花蜜距不同部位的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以此來(lái)比較材料不同部位組織細(xì)胞的相同和細(xì)微差別之處。比如花蜜距中應(yīng)該有蜜腺的結(jié)構(gòu)，但在染色后觀察玻片時(shí)并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)組織，考慮可能是切片時(shí)漏去蜜腺等其他部位從而導(dǎo)致觀察的缺失。花蜜腺和腺毛一樣是植物體常見(jiàn)的外分泌結(jié)構(gòu)，在長(zhǎng)期的物種進(jìn)化演變過(guò)程中分化而形成的一類腺體。蜜腺根據(jù)其著生位置可分為花蜜腺和花外蜜腺。大多數(shù)蘭科植物的香味十分濃郁或是蜜腺比較發(fā)達(dá)，這是因?yàn)樗鼈円揽刻厥獾臍馕痘蚴欠置诘幕蹃?lái)吸引傳粉者。不同植物蜜腺的位置、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等都存在差異。

4.2 展望

本文通過(guò)石蠟切片實(shí)驗(yàn)對(duì)長(zhǎng)距彗星蘭的花蜜距內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察并分析其具體功能，可以觀察到花蜜距的橫切結(jié)構(gòu)中主要有起保護(hù)作用的表皮細(xì)胞，起輸導(dǎo)作用的維管組織，還有起填充作用的薄壁細(xì)胞等。前人對(duì)花蜜距的研究大多是基于生物個(gè)體水平上，對(duì)植物花部的特征進(jìn)行描述和分類時(shí)有涉及到對(duì)花蜜距的描述，而對(duì)于花蜜距內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)以及其相關(guān)生物功能的研究相對(duì)較少。

迄今為止，大多對(duì)花蜜腺的研究是對(duì)花蜜腺的發(fā)育解剖學(xué)研究和基于在電子顯微鏡下對(duì)超薄切片的觀察，而對(duì)于花外蜜腺尤其是對(duì)于花蜜距內(nèi)蜜腺的研究十分稀少。因此，在今后應(yīng)該更加深入的對(duì)花蜜距內(nèi)蜜腺的結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)胞以及分子水平上的研究，并加強(qiáng)對(duì)花蜜距內(nèi)蜜腺作用機(jī)理的應(yīng)用。