蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13致死松材線蟲的因子1)

孫玉鳳 談家金 趙曉佳 袁裕超

(南京林業(yè)大學，南京，210037)

松材線蟲病是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)所引起的一種侵染性病害，傳播速度快，短時間內可造成大面積的松林毀壞[1]。松材線蟲主要以墨天牛屬昆蟲為媒介進行傳播，通過寄生于松樹體內而導致樹木迅速死亡[2-3]。自1982年松材線蟲首次在我國的南京中山陵被發(fā)現以來，至今已蔓延至我國19個省市，且近年來有從南向北擴散的趨勢，對我國森林資源造成極大破壞。根據國家林業(yè)和草原局公告(2021年第14號)(2021年全國松材線蟲病新發(fā)縣級疫區(qū)公告)，我國2021年3—7月新增7個松材線蟲病縣級疫區(qū)[4]。由于松材線蟲寄生于松樹體內，發(fā)病速度快，其防控已成為世界性的難題[5]。目前還沒有徹底根治的方法，可采取的防治方法有物理防治、化學防治、生物防治等，其中應用最廣泛的是化學防治，但由于化學農藥易造成環(huán)境污染，且線蟲易產生抗藥性，化學殺線劑的應用受到一定的限制，因此更多的研究者們開始進行生物防治研究[6-7]。近年來的研究表明，在健康植物體內能夠篩選到對松材線蟲具有高效拮抗活性的內生細菌[8-9]。

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)NJSZ-13是從松樹體內分離的一株內生細菌，經殺線作用測定發(fā)現該菌株的無菌發(fā)酵液對松材線蟲的致死率能達到100%，菌體水懸液對松材線蟲的致死率能達到81.5%[10]。在實際應用中細菌需通過菌體對松材線蟲起作用，因此本研究針對NJSZ-13菌懸液對松材線蟲的作用方式進行研究。為了明確蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13對松材線蟲的作用機制，本研究在弄清菌株在線蟲蟲體位置的基礎上，揭示了菌株胞外蛋白酶的殺線作用，從而為進一步探討蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13的殺線機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株來源于南京林業(yè)大學森林病理實驗室。

松材線蟲AMA3蟲株分離自安徽省病死黑松(Pinusthunbergii)，現保存于南京林業(yè)大學松材線蟲蟲株資源庫。

NJSZ-13菌懸液：挑取NJSZ-13單菌落置于200 r/min、28 ℃條件下持續(xù)搖培，于10 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min，棄上清，得到的菌體沉淀以原體積1/2的無菌水徹底懸浮，至最終菌濃度為3×108菌落/mL，即為供試菌懸液。

營養(yǎng)瓊脂(NA)有抗培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉膏3 g/L，青霉素10 mg/L，pH為7.2～7.4。

1.2 菌株NJSZ-13于松材線蟲蟲體上存在位置的鑒定

NJSZ-13菌懸液處理松材線蟲AMA3蟲株24 h后，挑取活的松材線蟲，加入200 μL無菌水清洗線蟲，3 000 r/min離心3 min，研究表明菌株NJSZ-13對青霉素耐藥，因此分三組處理，使用加入青霉素的抗性培養(yǎng)基檢測線蟲帶菌情況。A組吸取離心后的100 μL上清液涂布于抗性培養(yǎng)基，觀察菌株NJSZ-13是否生長。B組依次使用0.05%硫酸鏈霉素、3%過氧化氫以及無菌水徹底清洗線蟲體表。清洗完成后使用無菌水重懸線蟲，混勻后吸取100 μL蟲液涂布抗性培養(yǎng)基，未長菌落說明線蟲表面消毒成功。C組將體表徹底消毒的松材線蟲研磨破碎，混合物涂布抗性培養(yǎng)基。以無菌水處理松材線蟲為對照，觀察線蟲體內菌落生長情況。若抗性培養(yǎng)基中長出菌落，挑取單菌落進行分離純化培養(yǎng)，提取細菌DNA，進行PCR擴增及純化，將得到的PCR純化產物進行測序鑒定。

將滅菌玻璃紙覆蓋于固體NA培養(yǎng)基上，以避免線蟲進入培養(yǎng)基。將含有gfp熒光質粒的菌株NJSZ-13接種于玻璃紙上，置于培養(yǎng)箱內28 ℃培養(yǎng)。待菌落長滿整個平板后，將松材線蟲懸液(約1 000條線蟲)分多點打到玻璃紙上，盡量使蟲鋪滿平板，以無菌水為對照，每個處理重復3次。在培養(yǎng)皿底部劃線，將培養(yǎng)皿平均分成20個小塊，每隔24 h在解剖鏡下隨機選取5個小塊，使用Zeiss熒光顯微鏡觀察NJSZ-13在松材線蟲蟲體上的存在位置，每次觀察至少30條松材線蟲。

1.3 菌株NJSZ-13處理松材線蟲后上清液的殺線活性測定

已有研究表明NJSZ-13菌懸液對松材線蟲存在較高的致死作用，為明確NJSZ-13對松材線蟲的作用方式，使用NJSZ-13處理松材線蟲后的上清液測定殺線效果。在1.5 mL離心管中分別加入1 mL NJSZ-13菌懸液與50 μL松材線蟲蟲液(約2 000條)，于25 ℃黑暗條件下靜置48 h，10 000 r/min、4 ℃條件下離心取上清液，將1 mL上清液轉入新的1.5 mL離心管中，加入50 μL松材線蟲蟲液(約2 000條)，25 ℃黑暗條件下靜置48 h后吸取20 μL(大約50條松材線蟲)于顯微鏡下觀察線蟲死亡情況，以針刺法判定線蟲的死亡，統(tǒng)計死蟲數并計算松材線蟲死亡率。分別以NJSZ-13菌懸液與無菌水處理松材線蟲48 h后線蟲的死亡率為對照，每處理重復5次。

線蟲死亡率=(線蟲死亡數/線蟲總數)×100%。

在200 mL NJSZ-13菌懸液中加入大約10萬條松材線蟲，200 r/min、28 ℃條件下持續(xù)搖培4 d，10 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清，向上清中加入硫酸銨使飽和度達到100%，4 ℃條件下靜置過夜，離心取沉淀物用1/10原濾液體積的PBS緩沖液進行溶解，溶解完成之后，將溶液裝到截留分子量為8 000～14 000 Da的透析袋進行除鹽，得到菌株NJSZ-13的胞外蛋白粗提液。將200 μL胞外蛋白粗提液和等體積線蟲液(約1 000條松材線蟲)混合，每隔24 h查看線蟲存活情況。以PBS緩沖液和沸水浴30 min的胞外蛋白粗提液為對照，每處理重復5次。

1.4 菌株NJSZ-13處理松材線蟲后菌體繁殖量的測定

將50 mL菌懸液與等體積線蟲液(約5 000條/mL)混合。每隔24 h使用紫外分光光度計Lambda 365測定600 nm處的OD值，以OD值大小反應菌體繁殖量的變化。以同等濃度的菌懸液和松材線蟲蟲液為對照，每處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 菌株NJSZ-13于松材線蟲蟲體上的存在位置

圖1顯示挑取NJSZ-13處理后的松材線蟲加入無菌水離心取得的上清液涂布抗性平板后長出菌落(圖1A)，線蟲體表徹底消毒(圖1B)及研磨后(圖1C)涂布抗性平板，均無菌落生長。挑取A組中的單菌落進行測序比對后發(fā)現，菌處理組的分離菌與蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13的序列結果一致，水處理組分離菌進行序列比對后發(fā)現該菌屬于腸桿菌屬(Enterobacterspp.)。結果表明，蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13未存在于松材線蟲體內。

A為無菌水清洗線蟲涂布結果；B為體表消毒后涂布結果；C為研磨蟲液涂布結果。

gfp標記NJSZ-13菌株處理松材線蟲后，線蟲蟲體熒光菌體數量隨時間變化結果如圖2所示，菌株NJSZ-13隨著時間的推移逐漸覆蓋蟲體。gfp基因標記菌株處理24 h后，菌體附著于松材線蟲體表(圖2A)。處理48 h后，附著于松材線蟲體表的菌體增多(圖2B)。處理72 h，菌體已經遍布于松材線蟲全身(圖2C)。對照組經無菌水處理72 h后，松材線蟲依然存活，線蟲運動正常，體表無熒光(圖2D)。結果進一步表明蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13作用位置位于松材線蟲體表。

A為菌株NJSZ-13處理24 h，菌體附著于線蟲體表；B為菌株NJSZ-13處理48 h，附著于松材線蟲體表的菌體增多；C為菌株NJSZ-13處理72 h，菌體覆蓋松材線蟲全身；D為無菌水處理72 h，線蟲運動正常。

2.2 菌株NJSZ-13處理松材線蟲后上清液的殺線活性

NJSZ-13菌懸液處理松材線蟲后的上清液殺線活性如表1所示。離心所得的上清液處理線蟲48 h后，松材線蟲死亡率為13.58%，與無菌水對照無顯著差異，而NJSZ-13菌懸液處理松材線蟲48 h后，松材線蟲死亡率達到70.19%，與上清液相比差異顯著。該結果表明NJSZ-13菌懸液處理松材線蟲后的上清液對松材線蟲幾乎無殺線活性。要達到良好的殺線效果，菌株NJSZ-13需靠近甚至附著于松材線蟲蟲體。

表1 菌株NJSZ-13處理松材線蟲后上清液的殺線活性

表2為菌株NJSZ-13處理松材線蟲后的上清液中分離出的胞外蛋白粗提物對松材線蟲的殺線活性結果。結果表明，菌株NJSZ-13的胞外蛋白粗提物具有較強的殺線活性，沸水浴處理后，殺線活性降低顯著。隨著處理時間的延長，胞外蛋白粗提物的殺線活性逐漸增強。處理24 h后，胞外蛋白粗提物的殺線率為50.31%，沸水浴處理后，殺線率降至13.23%，但仍然高于對照的1.92%；處理48 h和72 h后，胞外蛋白粗提物的殺線率分別提高至66.23%和82.48%，此時沸水浴處理的殺線率也分別增至23.88%和26.81%。表明菌株NJSZ-13主要通過分泌胞外蛋白酶殺死松材線蟲。

表2 蠟樣芽胞桿菌NJSZ-13胞外蛋白粗提物的殺線活性

2.3 菌株NJSZ-13處理松材線蟲后菌體繁殖量的變化

通過細菌懸浮液的吸光度可以反映細菌菌體的濃度。由圖3可見，菌株NJSZ-13處理松材線蟲AMA3后，菌蟲混合液和單獨菌懸液的吸光度總體上呈現前期下降明顯，后期逐漸穩(wěn)定的趨勢，但自始至終兩者都顯著高于單獨蟲懸液的吸光度。同時發(fā)現，菌株處理松材線蟲1 d后，菌蟲混合液的吸光度開始高于單獨菌懸液的吸光度，處理后3 d至10 d，菌蟲混合液的吸光度始終顯著高于單獨菌懸液的吸光度。由此表明，菌株NJSZ-13能夠以松材線蟲蟲體為營養(yǎng)進行生長繁殖。

*** 表示經Tukey多重檢驗在P<0.001水平差異顯著。

3 結論與討論

在自然界中，松材線蟲與微生物之間形成了十分復雜的關系。對于殺線蟲微生物而言，提高線蟲和其接觸機會顯然會提高其生防效果[11]。本試驗發(fā)現，生防菌株NJSZ-13粘附在松材線蟲體表，可通過分泌胞外蛋白酶殺死線蟲以獲取營養(yǎng)進行繁殖。

大多數芽孢桿菌其營養(yǎng)結構簡單、生長繁殖速度快、易于存活定殖，形成抗逆性極強的內生芽孢，并且能夠分泌一些抗菌蛋白[12]。目前關于殺線蟲細菌侵染線蟲機理的國內外報道比較少，大多數為產胞外水解酶(幾丁質酶、絲氨酸蛋白酶、中性蛋白酶等)細菌[13]。1987年有學者首次發(fā)現蘇云金芽孢桿菌的伴胞晶體蛋白毒素(Cry5B、Cry6A、Cry14A、Cry21A)能殺死植物寄生線蟲[14]。Huang et al.發(fā)現側孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)G4菌株和嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)G2菌株都能夠分泌蛋白酶，純化后的蛋白對全齒復活線蟲(Resurrectednematodes)和松材線蟲均具有高效殺線活性[15-16]。本研究發(fā)現，菌株NJSZ-13處理松材線蟲后的上清液中分離出的胞外蛋白粗提物對松材線蟲具有較強的殺線活性，隨后將胞外蛋白粗提物進行沸水浴處理后，殺線活性顯著降低，表明菌株NJSZ-13主要通過分泌胞外蛋白酶殺死松材線蟲。這與Huang et al.研究結果相似，不同的是大多數研究者分離出的蛋白酶均是從細菌發(fā)酵濾液中所得，本研究中的蛋白酶為菌株NJSZ-13菌體水懸液處理松材線蟲后的上清液中分離所得，這與菌株NJSZ-13菌懸液具有較高的殺線活性有關，后續(xù)工作中對分離到的胞外蛋白酶的結構與功能還需進行深入研究。

線蟲表皮由蛋白質和甲殼素組成，外層被一層蛋白膜覆蓋，這是保護線蟲免受環(huán)境破壞的有效屏障[17]。因此，蛋白酶、膠原酶和幾丁質酶在線蟲生物防治中一直受到重視。本研究證明菌株NJSZ-13主要通過分泌胞外蛋白酶殺死松材線蟲，為利用細菌進行高效防治松材線蟲奠定了基礎，今后利用生物技術方法克隆毒性蛋白酶基因、構建殺線蟲工程菌和轉基因植物也可能成為防治松材線蟲的有效途徑。在可持續(xù)發(fā)展的今天，利用細菌開發(fā)生物制劑，防治松材線蟲，已經越來越凸顯出其研究和應用價值。蠟樣芽胞桿菌中殺線蟲蛋白酶對松材線蟲毒殺活性的發(fā)現，與傳統(tǒng)的化學殺線蟲劑相比有著無可比擬的優(yōu)勢。通過基因工程手段改良菌株提高其毒力，可以使殺線細菌在自然環(huán)境中更好地發(fā)揮作用，也有望獲得對松材線蟲有良好防治效果的生防制劑，對深入研究及開發(fā)防治松材線蟲的商品化生防細菌具有重要意義。隨著研究的不斷深入，利用蛋白酶防治松材線蟲應用前景將非常廣闊，對其進行深入的研究對于開發(fā)新的松材線蟲生防細菌制劑以及發(fā)展新的生防戰(zhàn)略具有重要意義。