用高通量測序技術(shù)分析紅皮云杉梢枯病前后葉圍微生物多樣性1)

劉宇航 申東晨 王思涵 馬千雯 林輝 鐘鵬 董愛榮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

紅皮云杉(PiceakoraiensisNakai)是松科(Pinaceae)云杉屬(Picea)的一種珍貴樹種，為常綠喬木，樹高可達(dá)到30m以上，樹皮呈現(xiàn)淡紅褐色或灰褐色。紅皮云杉不僅分布于黑龍江、吉林、遼寧和內(nèi)蒙古等地區(qū)，在朝鮮的北部及俄羅斯遠(yuǎn)東部分地區(qū)也有分布，而且適應(yīng)性較強(qiáng)，能在不同類型的立地條件下正常生長，能夠生長在海拔400～1 800 m的地帶[1-2]。紅皮云杉木材淡黃褐色，樹干筆直，質(zhì)地較軟，耐腐蝕性能比較弱，可用作建筑、高檔家具和造紙的原料，也是東北地區(qū)的主要綠化樹種，具有觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3-8]。

紅皮云杉的梢枯病對于樹種的危害極大，致病病原菌為寄生小穴殼(Dothiorellagregaria)，寄生小穴殼病害在世界范圍內(nèi)均有分布[9-11]。寄生小穴殼于1979年在楊樹水泡型潰瘍病的鑒定發(fā)現(xiàn)，并描述了寄生小穴殼的形態(tài)特征與生長特性，后驗(yàn)證出可以引起梢枯病[9，12]。梢枯病病害發(fā)生部位為云杉的嫩梢，發(fā)病后，嫩梢干枯，針葉頂部會開始彎曲并且下垂，僅剩下一小簇針葉殘留在枝梢頂部，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)整株云杉死亡。對梢枯病的防治我國目前主要使用物理防治和化學(xué)防治，但是這兩種防治方法均有比較明顯的劣勢。目前國內(nèi)外對運(yùn)用植物內(nèi)生菌拮抗病原菌防治梢枯病進(jìn)行了研究[13-15]；高通量測序能夠更為準(zhǔn)確快捷了解微生物的性質(zhì)及其在自然界中的生態(tài)功能，通過高通量測序技術(shù)能夠一次性檢測出樣品中可能感染的多種病原物基因組序列，對病原檢測鑒定具有很好的應(yīng)用前景[16-18]。關(guān)于紅皮云杉梢枯病的研究鮮有報(bào)道，而對其生物防治技術(shù)方面的報(bào)道，更是微乎其微。本研究基于高通量測序技術(shù)分析感云杉梢枯病前后葉圍微生物多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的變化探知優(yōu)勢微生物的分布，從而指導(dǎo)篩選云杉葉片葉圍優(yōu)勢的梢枯病拮抗菌。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康紅皮云杉(Piceakoraiensis)、發(fā)病紅皮云杉葉片均采自黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。2021年7月18日，采用“S”形十點(diǎn)采樣法，分別剪取10棵28年生健康及感梢枯病紅皮云杉針葉。分別從10棵樹上采集的樣品中選取1.0 g，用無菌剪刀剪碎后，將其混勻。分別得到10.0 g健康樣品及10.0 g感病樣品，D1表示健康樣品，D2表示感病樣品。

1.2 紅皮云杉葉圍微生物基因組DNA的提取及檢測

紅皮云杉樣品的基因組DNA參照MP試劑盒(Fast DNA Spin Kit for Soil 116560-200)的使用說明書進(jìn)行提取，將所提取到的DNA溶于50 μL無菌水中，混合均勻，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肗ano Drop2000進(jìn)行基因組DNA濃度及純度檢測，使用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因組DNA完整性檢測?；蚪MDNA濃度、純度檢測待DNA完全溶解后，將TE緩沖液設(shè)為空白對照，移取2 μL，使用超微量紫外可見分光光度計(jì)檢測其濃度，并根據(jù)D260/D280的值檢測其純度?；蚪MDNA完整性檢測根據(jù)濃度檢測結(jié)果，先將樣品放置于冰上進(jìn)行融化，之后將其充分混勻并離心，移取3 μL DNA樣品進(jìn)行檢測，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓為130 V，電泳時(shí)間為20 min，在凝膠成像系統(tǒng)上拍照觀察分析DNA樣品的完整性[19]。

1.3 16SrDNA熒光定量PCR擴(kuò)增和高通量測序

利用2%瓊脂糖凝膠檢測提取的DNA的質(zhì)量，并將其送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測序，應(yīng)用Miseq平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

真菌ITS選擇ITS1和ITS2R作為引物，分別為5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’；細(xì)菌16SrRNA選擇799F和1193R作為引物，引物序列分別為5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’和5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’；利用IlluminaMiSeq平臺進(jìn)行測序和分析。

數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME(v1.8.0)軟件過濾、拼接、去除嵌合體，去除各樣本中讀長(reads)尾部質(zhì)量值在20以下的堿基、切除reads中含N部分序列，并去除數(shù)據(jù)中的短序列(長度閾值200 bp)，隨后再對低復(fù)雜度的序列進(jìn)行過濾。采用Usearch(v7．1)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，物種比對注釋使用RDP classifier軟件，保留置信區(qū)間大于0.8的注釋結(jié)果。利用Mothur軟件進(jìn)行Chao1指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù)、覆蓋度(Coverage)指數(shù)計(jì)算分析，并在各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病前后樣品的細(xì)菌和真菌多樣性

阿爾法(Alpha)多樣性指數(shù)可用來反映生物群落的豐富度和多樣性。其中，Chao1指數(shù)可反映生物物種的豐富度，其數(shù)值越大表示該樣品物種豐富度越大，Chao1指數(shù)用來估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)；香農(nóng)(Shannon)多樣性指數(shù)是一種基于信息理論的測量指數(shù)，反映生物群落的多樣性和衡量群落的異質(zhì)性，其數(shù)值越大表示群落多樣性越高；測序深度(Coverage)指數(shù)則可以反映生物群落的覆蓋度，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，該指數(shù)反映本次測序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況[20]。

由表1可知，感病前后分別檢測到260、64個細(xì)菌OTU，165、157個真菌OTU；樣品D2中細(xì)菌的OTU數(shù)目、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)都明顯下降，D2中真菌的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)都小幅下降。說明感病后，病原菌占絕對優(yōu)勢，且對其他微生物產(chǎn)生一定的抑制作用，細(xì)菌、真菌多樣性及物種總數(shù)顯著下降。所有樣品的覆蓋度(coverage)指數(shù)均超過0.998 6，表明細(xì)菌及真菌的測序深度已達(dá)到較高水平，數(shù)據(jù)可靠。

表1 感病前后紅皮云杉樣品的細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)

由圖1可知，感病前后樣品共含有279個細(xì)菌OTU，兩組樣品共有的細(xì)菌種類僅有45個，占細(xì)菌總數(shù)的16.13%，說明紅皮云杉感染梢枯病菌前后，葉圍細(xì)菌發(fā)生了極大的改變。感病前后樣品共含有249個真菌OTU，兩組樣品共有的真菌種類僅有73個，占真菌總數(shù)的29.32%，說明紅皮云杉感染梢枯病菌前后，葉圍真菌發(fā)生了巨大的變化。

圖1 感病前后紅皮云杉樣品真菌和細(xì)菌OTU分布韋恩圖

2.2 感病前后樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性

由表2可知，從細(xì)菌分類門的水平看，兩個樣品主要含有4個門的細(xì)菌，包括變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)。

表2 感病前后紅皮云杉樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布

在門水平下，感病前后樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成大致相同，兩組樣品都含有以上4個門的細(xì)菌，而D1樣品中主要含有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)，豐度分別為69.94%、12.85%、10.54%和4.11%，三者合計(jì)高達(dá)97.44%，未鑒定的細(xì)菌豐度為2.56%。D2樣品主要含有變形菌門這一個門，豐度高達(dá)99.56%，其他門以及未鑒定的細(xì)菌豐度均在0.33%以下。結(jié)果紅皮云杉感染云杉梢枯病后，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成未發(fā)生較大的變化，變形菌門豐度大幅度上升，放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門豐度均發(fā)生大幅度下降，而其他細(xì)菌門豐度也發(fā)生了大幅度下降。

根據(jù)物種分類結(jié)果，由于樣品中所檢測出的細(xì)菌種類繁多，許多物種豐度極低，因此篩選出優(yōu)勢物種，對細(xì)菌平均豐度前15的物種進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)并將在兩組樣品中豐度均小于1%的物種合并至其他類別。從細(xì)菌分類屬水平看，兩樣品豐度前15個屬的細(xì)菌主要包括：馬賽菌屬(Massilia)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、青枯菌屬(Ralstonia)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、貪噬菌屬(Variovorax)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、擬桿菌屬(Bacteroides)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、Robbsia屬、動球菌屬(Kineococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、布勞特氏菌屬(Blautia)、志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、紡錘鏈桿屬(Fusicatenibacter)和未被鑒定的放線菌綱(Gaiellales)。

在屬水平下，兩組樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成不盡相同，且相對豐度的差異也較大。D1中克雷伯菌屬、青枯菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、貪噬菌屬、假單胞菌屬、擬桿菌屬、甲基桿菌屬、動球菌屬、鏈球菌屬、布勞特氏菌屬、志賀氏菌屬、紡錘鏈桿屬和未被鑒定的放線菌綱的豐度均高于D2組，其中，青枯菌屬、擬桿菌屬、鏈球菌屬、布勞特氏菌屬和紡錘鏈桿屬等僅存在于D1組；而D2中馬賽菌屬豐度占據(jù)絕對優(yōu)勢，豐度高達(dá)93.95%，其余優(yōu)勢屬只有兩個，分別為鞘氨醇單胞菌屬與Robbsia屬，豐度分別為1.25%和1.51%，除了馬賽菌屬外，只有Robbsia屬的豐度高于D1組，其中，克雷伯菌屬、志賀氏菌屬、未被鑒定的放線菌綱這三種屬在D2中僅占0.01%并且D2中沒有特有菌屬。

2.3 感病前后樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)差異性

由表3可知，從真菌分類門水平看，兩組樣品主要含有3個門的真菌，即：子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、無法確定的真菌(unclassified_k_Fungi)。在門水平下，感病前后樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對豐度。這說明2組樣品中群落結(jié)構(gòu)未發(fā)生根本改變。子囊菌門是兩組樣品中的優(yōu)勢真菌，其中，D1樣品的豐度(85.04%)略大于D2樣品的豐度(55.44%)。其次是擔(dān)子菌門和無法確定的真菌，在D1樣品中其他類別的真菌豐度為0.35%，在D2樣品中無其他類別的真菌。

表3 感病前后紅皮云杉樣品真菌群落結(jié)構(gòu)分布

根據(jù)物種分類結(jié)果，由于樣品中所檢測出的真菌種類繁多，許多物種豐度極低，因此篩選出優(yōu)勢物種，并對優(yōu)勢真菌進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。從真菌分類屬水平看，兩組樣品平均豐度前20個屬的真菌包括:亞隔孢殼屬(Didymella)、穴殼菌屬(Dothiorella)、線黑粉菌屬(Filobasidium)、Naganishia屬、Kwoniella屬、短梗霉屬(Aureobasidium)、外囊菌屬(Taphrina)、未被鑒定的亞隔孢殼科(Didymellaceae)、枝孢屬(Cladosporium)、Papiliotrema屬、Sclerostagonospora屬、擔(dān)孢酵母屬(Erythrobasidium)、新刺毛莖點(diǎn)霉屬(Neosetophoma)、Knufia屬、附球菌屬(Epicoccum)、赤霉菌屬(Gibberella)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidiobolus)、未被鑒定的真菌(unclassified_k_Fungi)、Dothidea屬、未被鑒定的錘舌菌綱(Leotiomycetes)、Genolevuria屬。

在屬水平下，兩組樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對豐度。D1中亞隔孢殼屬、外囊菌屬、枝孢屬、Sclerostagonospora屬、擔(dān)孢酵母屬、新刺毛莖點(diǎn)霉屬、Knufia屬、附球菌屬、赤霉菌屬、紅冬孢酵母屬、未被鑒定的真菌、Dothidea屬、未被鑒定的錘舌菌綱、Genolevuria屬豐度高于D2組，其中，Knufia屬、赤霉菌屬和未被鑒定的錘舌菌綱僅存在于D1組；而D2中穴殼菌屬、線黑粉菌屬、Naganishia屬、Kwoniella屬、短梗霉屬、未被鑒定的亞隔孢殼科和Papiliotrema屬等的豐度高于D1組，其中，穴殼菌屬及Naganishia屬僅存在于D2組。

3 討論

本研究通過IlluminaMiSeq測序平臺，分析了紅皮云杉健康葉和感梢枯病葉的葉圍微生物的群落結(jié)構(gòu)，以及兩者之間共生細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的差異。紅皮云杉感梢枯病葉與健康葉相比，細(xì)菌、真菌的多樣性及物種總數(shù)都顯著下降，在門及屬水平上差異都較為顯著。相較于放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，變形菌門在紅皮云杉健康葉和感梢枯病葉的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成中占顯著優(yōu)勢；在兩者的真菌群落結(jié)構(gòu)中，子囊菌門占據(jù)絕對優(yōu)勢。

在葉圍微生物的研究中，分別發(fā)現(xiàn)了45個屬的細(xì)菌和73個屬的真菌。馬賽菌屬在病葉的細(xì)菌群落中占據(jù)絕對優(yōu)勢，楊恩東等[21]發(fā)現(xiàn)馬賽菌屬目前包含43個有效描述種，該菌群在土壤環(huán)境中廣泛分布，并未作為致病病原細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)且該菌具有溶磷作用。而本次研究顯示在病葉中馬賽菌屬的相對豐度占據(jù)絕對優(yōu)勢且高達(dá)93.95%，故在病葉中細(xì)菌種類及多樣性的減少是由于真菌病原菌的影響。通過分析真菌群落，發(fā)現(xiàn)穴殼菌屬僅存在于病葉之中，云杉梢枯病病原為寄生小穴殼(D.gregaria)[9]，與本研究的結(jié)果剛好對應(yīng)。在云杉內(nèi)生優(yōu)勢細(xì)菌中，克雷伯菌屬(Klebsiella)及假單胞菌屬(Pseudomonas)這兩屬細(xì)菌在不同程度上具有抑制不同真菌病原菌的能力[22]；而在云杉內(nèi)生優(yōu)勢真菌中，未發(fā)現(xiàn)具有抑制真菌病原菌能力的真菌。

4 結(jié)論

紅皮云杉發(fā)生云杉梢枯病后，感梢枯病病葉與健康葉相比，細(xì)菌、真菌的多樣性及物種總數(shù)都顯著下降，在門及屬水平上差異都較為顯著；病葉與健康葉在門與屬水平上的具體差異，確定了穴殼菌屬會導(dǎo)致紅皮云杉的云杉梢枯病，確定了兩屬極可能拮抗穴殼菌屬的內(nèi)生細(xì)菌為克雷伯菌屬及假單胞菌屬。