鳶尾糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因ItUGT349和ItUGT419克隆及特性研究

張李兵，李 靜，陶無(wú)恙，黃梓璐，陳嘉杰，段禮新，季愛(ài)加

鳶尾糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因和克隆及特性研究

張李兵，李 靜，陶無(wú)恙，黃梓璐，陳嘉杰，段禮新，季愛(ài)加*

廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院國(guó)際中醫(yī)藥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，教育部中醫(yī)藥防治腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東 省中醫(yī)藥防治腫瘤轉(zhuǎn)化藥學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東 廣州 510000

克隆獲得鳶尾糖基轉(zhuǎn)移酶基因和，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、基因差異表達(dá)檢測(cè)和蛋白原核表達(dá)等特性分析。以鳶尾轉(zhuǎn)錄組中篩選到的基因全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序后獲得基因序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；通過(guò)熒光定量PCR（real-time PCR，qRT-PCR）進(jìn)行基因差異表達(dá)檢測(cè)；最后構(gòu)建pET-32a（+）原核表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)蛋白。PCR擴(kuò)增和的ORF長(zhǎng)度分別為1461、1488 bp，編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小分別為53 830、54 910。熒光定量PCR顯示，的表達(dá)量在葉片中最高，而在花器官中表達(dá)最高。進(jìn)化樹(shù)表明，ItUGT419與三萜類糖基轉(zhuǎn)移酶聚類在一起，ItUGT349與三萜、黃酮和木質(zhì)素等多種類型的糖基轉(zhuǎn)移酶聚類到一支。ItUGT349和ItUGT419在大腸桿菌中均成功的表達(dá)出可溶性蛋白。通過(guò)和基因全長(zhǎng)ORF克隆，并對(duì)其進(jìn)行序列分析，基因差異表達(dá)檢測(cè)及原核表達(dá)等研究，為后續(xù)進(jìn)一步鑒定其催化功能奠定基礎(chǔ)。

鳶尾；糖基轉(zhuǎn)移酶；基因克??；生物信息學(xué)分析；原核表達(dá)；qRT-PCR

鳶尾科植物鳶尾Maxim.廣泛分布于世界各地，具有悠久的民間用藥歷史，其主要化學(xué)成分黃酮類和三萜類化合物對(duì)多種疾病如癌癥、炎癥及病毒感染等均具有很好的療效，具有極高的藥用價(jià)值，《中國(guó)藥典》2010年版正式將其收錄[1]。目前已從鳶尾中分離出多種三萜及其皂苷類化合物，特別是一系列結(jié)構(gòu)新穎的鳶尾醛型三萜，其結(jié)構(gòu)特征在于一個(gè)多取代環(huán)己烷的C-11位上連有一個(gè)側(cè)鏈，C-6位連有一個(gè)羥丙基可被糖基化[2]；在抗腫瘤和抗癌方面表現(xiàn)出良好活性[3]。

糖基化是植物次生代謝過(guò)程中十分重要的一類化學(xué)反應(yīng)；在尿苷二磷酸（UDP）依賴性糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）的作用下，將UDP活化的糖作為主要的供體分子轉(zhuǎn)移到特定的受體分子，形成糖苷鍵，產(chǎn)生多種多樣的糖苷類化合物[4]。被糖基化的化合物可顯著提高水溶性、化學(xué)穩(wěn)態(tài)以及轉(zhuǎn)運(yùn)能力等, 也能促進(jìn)其在某些特定的植物細(xì)胞或組織中進(jìn)行儲(chǔ)存和積累[5]。植物中的UGTs是一個(gè)基因超家族，已在許多植物中被克隆和表征功能[6-8]。此外在模式植物擬南芥L.中，已經(jīng)報(bào)道了120個(gè)基因[9]；雙子葉植物大豆L.中報(bào)道182個(gè)基因[10]；單子葉植物水稻L.中有180個(gè)基因被報(bào)道[11]。由于UGTs家族成員眾多，且催化底物復(fù)雜，其基因功能仍有許多未知。有研究指出，UGTs在C端均具有一個(gè)高度保守基序PSPG box（putative secondary plant glycosyl-transferase），該保守基序被認(rèn)為是UDP-糖供體結(jié)合的區(qū)域；而在N端的序列變異則十分顯著，其可能具有對(duì)萜類、黃酮類和甾體類等不同的底物進(jìn)行選擇性結(jié)合的功能[12-14]。

目前植物中關(guān)于催化三萜類化合物糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶基因已有不少報(bào)道；如從王不留行中克隆的從燕麥中克隆的和從大豆中克隆的、、等；其編碼糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白均可對(duì)三萜骨架或側(cè)鏈進(jìn)行糖基化修飾[15-17]。鳶尾中存在著眾多結(jié)構(gòu)新穎的三萜及皂苷類成分，但相關(guān)糖基轉(zhuǎn)移酶的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)鳶尾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選并克隆了2條糖基轉(zhuǎn)移酶基因（和），并通過(guò)生物信息學(xué)分析、基因差異表達(dá)分析；推測(cè)其可能具有催化三萜類底物糖基化的功能。最后在大腸桿菌中進(jìn)行了蛋白體外表達(dá)研究，為進(jìn)一步鑒定其催化功能、解析鳶尾中三萜類成分生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料

本研究所用植物材料于2019年6月取自中國(guó)科學(xué)院植物研究所，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院季愛(ài)加副研究員鑒定為鳶尾Maxim.。選取生長(zhǎng)年限2年，生長(zhǎng)健壯，處于盛花期的鳶尾植物，各組織部位取材后立即置于液氮速凍，置于?80 ℃冰箱備用。

2 方法

2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用液氮研磨法，使用植物總RNA提取試劑盒（北京興華越洋生物科技有限公司）按試劑盒操作說(shuō)明提取鳶尾各部位總RNA。將提取的總RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA濃度。參照TakaRa公司的PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA Synthesis Kit（TakaRa公司，6210A）試劑盒中的操作說(shuō)明合成cDNA鏈。

2.2 ItUGTs基因克隆

從鳶尾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到2條潛在的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，命名為和。根據(jù)其全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）序列，使用Vector NTI設(shè)計(jì)引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列信息見(jiàn)表1。以高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，P505-d1）對(duì)候選基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為2 ×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，高保真酶1 μL，正反向引物各1 μL，cDNA模板1 μL，超純水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃、15 s，57 ℃、15 s，72 ℃、90 s，32個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、切膠回收純化后連接pLB-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含氨芐抗性的LB固體平板；于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)12～15 h。挑取單菌落小搖5～6 h，進(jìn)行菌液PCR陽(yáng)性鑒定，將陽(yáng)性菌液送至生工生物工程上海股份有限公司測(cè)序。

2.3 ItUGTs生物信息學(xué)分析

使用NCBI在線工具ORF Finder （https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）搜索和糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列的開(kāi)放閱讀框；經(jīng)ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)站獲得預(yù)測(cè)蛋白的理化性質(zhì)。通過(guò)CELLO v 2.5（http://cello.life.nctu.edu.tw/）獲得蛋白亞細(xì)胞定位信息；利用在線工具SignalP-5.0（http://www. cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）和TMHMM（http:// www. cbs. dtu. dk/ services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)。通過(guò)SOPMA（https://npsa- prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，再經(jīng)SWISS-MODEL（https://swissmodel. expasy.org/ interactive）進(jìn)行同源模建，獲得蛋白的三維結(jié)構(gòu)。通過(guò)NCBI-cdd（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/cdd）在線工具和pfam（http:// pfam.xfam.org/）網(wǎng)站預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)域范圍，利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)。再使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)；已知功能糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白序列[14,18]從NCBI（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載。

表1 引物序列

2.4 ItUGTs基因qRT-PCR分析

參照TakaRa公司的qRT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TakaRa公司，RR047A）中的操作說(shuō)明合成cDNA鏈，用于qPCR反應(yīng)的模板。參照艾科瑞生物公司的SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用QuantStudio 5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，將鳶尾各組織部位cDNA稀釋20倍作為qRT-PCR反應(yīng)體系模板，以為內(nèi)參基因（引物序列見(jiàn)表1）；每個(gè)基因3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系10 μL：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix，5.0 μL；正反向引物各0.2 μL；熒光染料0.2 μL；模板cDNA 1 μL；超純水3.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán)（95 ℃，5 s；64 ℃，34 s）。使用2?△△Ct法計(jì)算基因在不同組織部位中的相對(duì)表達(dá)量。使用IBM SPSS 2.0軟件進(jìn)行表達(dá)差異的統(tǒng)計(jì)分析，＜0.01表示顯著性差異。

2.5 ItUGTs基因原核表達(dá)

參照南京諾唯贊生物科技有限公司的快速重組克隆試劑盒（ClonExpress II）盒說(shuō)明書(shū)對(duì)候選基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，采用雙酶切（EcoRI，XhoI）進(jìn)行pET32a載體線性化，通過(guò)同源重組酶將二者重組，同源產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，涂布于含氨芐抗性的平板上，過(guò)夜培養(yǎng)（37 ℃），經(jīng)菌液PCR鑒定，選取陽(yáng)性菌液送測(cè)序，將測(cè)序正確的菌液活化，提取質(zhì)粒，獲得帶目的基因的表達(dá)載體質(zhì)粒。

通過(guò)熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌BL21(DE3) 感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆菌于LB 液體培養(yǎng)基（含100 mg/L氨芐抗生素）中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，4～6 h后通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌液密度至OD值為0.5～0.6時(shí)，加入終濃度0.1 mmol/L IPTG，18 ℃、180 r/min，誘導(dǎo)培養(yǎng)18 h。4 ℃、4000 r/min 離心10 min 收集菌體，棄上清。在菌體中加入20 mL的50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）重懸菌體，蛋白破碎前加入1 mmol/L PMSF，超聲破碎。4 ℃、12 000 r/min離心30 min，分離上清及沉淀。進(jìn)行SDS-PAGE。

3 結(jié)果與分析

3.1 ItUGTs基因克隆

以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，可見(jiàn)和均為1條清晰條帶（圖1），片段大小在1500 bp左右，與預(yù)期大小相符。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組序列比對(duì)，結(jié)果一致?；虻腛RF長(zhǎng)度為1461 bp，編碼486個(gè)氨基酸，命名為UGT707D1；基因的ORF長(zhǎng)度為1488 bp，編碼495個(gè)氨基酸，命名為UGT92N1。

3.2 ItUGTs的序列分析

3.2.1 ItUGTs蛋白理化性質(zhì) 經(jīng)ProtParam在線工具預(yù)測(cè)，ItUGT349和ItUGT419相對(duì)分子質(zhì)量分

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

別為53 830和54 910，理論等電點(diǎn)分別為4.94、4.92，不穩(wěn)定系數(shù)為53.69、49.58，表明ItUGT349和ItUGT419均屬于不穩(wěn)定酸性蛋白。

3.2.2 ItUGTs跨膜區(qū)及信號(hào)肽分析 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，2個(gè)ItUGTs均定位于細(xì)胞質(zhì)。通過(guò)在線工具TMHMM預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)ItUGTs均不含有跨膜螺旋區(qū)（圖2），為膜外蛋白。利用在線工具SignalP-5.0對(duì)ItUGTs進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)ItUGT349具有信號(hào)肽（圖2），為分泌蛋白；ItUGT419不具有信號(hào)肽，為非分泌蛋白，二者可能具有不同的生物學(xué)功能。

3.2.3 ItUGTs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維建模 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，ItUGT349和ItUGT419均以α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲為主要組成元件，其具體預(yù)測(cè)信息見(jiàn)表2。

使用在線工具SWISS-MODEL預(yù)測(cè)ItUGT349和ItUGT419蛋白三維結(jié)構(gòu)。ItUGT349蛋白與蒺藜苜蓿三萜UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT71G1）具有42.70%的序列相似性，以該蛋白（PDB ID：2acw.1）A鏈[19]為模板，通過(guò)同源建模構(gòu)建ItUGT349蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，建模范圍為2～485位氨基酸，全球性模型估測(cè)值（GMQE值）為0.68，三維建模質(zhì)量良好（圖3）。ItUGT419蛋白與美洲商陸糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT3）具有32.83%的序列相似性，以該蛋白（PDB ID:6lzx.1）A鏈[20]為模板，通過(guò)同源建模構(gòu)建ItUGT419蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，建模范圍為4～488位氨基酸，GMQE值為0.67，三維建模質(zhì)量良好。

A、B-ItUGTs跨膜區(qū)預(yù)測(cè) C、D-ItUGTs信號(hào)肽分析

表2 ItUGTs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖3 鳶尾ItUGTs蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3.3 ItUGTs的系統(tǒng)發(fā)育與結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)糖基轉(zhuǎn)移酶的底物催化特異性，將擬南芥、大豆、人參、蒺藜苜蓿、梔子等植物中已表征功能的糖基轉(zhuǎn)移酶與ItUGT349和ItUGT419進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（圖4）。結(jié)果顯示，ItUGT419聚類在第3支（Group III），與人參和麥藍(lán)菜中的三萜類糖基轉(zhuǎn)移酶聚類在一起；而ItUGT349聚類在第2支（Group II），與已知功能的三萜類，黃酮類等糖基轉(zhuǎn)移酶聚類在一起。

使用NCBI-CD-Search和Tbtools工具對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)ItUGT349和ItUGT419與已知功能的三萜類糖基轉(zhuǎn)移酶具有相同的結(jié)構(gòu)域（GTB-type superfamily）。進(jìn)一步使用pfam在線軟件對(duì)其結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行分析，并使用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)（圖5），發(fā)現(xiàn)ItUGT349和ItUGT419與三萜類糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列具有較高的一致性，結(jié)構(gòu)域全長(zhǎng)約150個(gè)氨基酸。在與黃酮類糖基轉(zhuǎn)移酶的序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)域較三萜類的更長(zhǎng)，約330個(gè)氨基酸；ItUGT349和ItUGT419在C端區(qū)域較為保守，在N端存在大片段的缺失。

3.4 ItUGTs的組織差異表達(dá)分析

以鳶尾為內(nèi)參基因，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)和基因在鳶尾根狀莖、葉片和花中的差異表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖6，在葉片中有最高表達(dá)；在花中的表達(dá)量最高。

AtUGT-擬南芥 SrUGT-甜葉菊 PgUGT-人參 MpUGT-蒺藜苜蓿 GjUGT-梔子 GuCGAT-麥藍(lán)菜 GmUGT-大豆 BvUGT-歐洲山芥

3.5 ItUGTs的原核表達(dá)

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32a(+)-ItUGT349、pET32a(+)-ItUGT419轉(zhuǎn)入宿主菌BL21(DE3)，通過(guò)菌液PCR篩選轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌液進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。在IPTG的誘導(dǎo)作用下，和在大腸桿菌體系中進(jìn)行異源表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖7。ItUGT349重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量理論值為74 230，通過(guò)與空載表達(dá)情況對(duì)照，發(fā)現(xiàn)成功表達(dá)出較大量的可溶性蛋白；ItUGT419重組蛋白大小理論值為75 310，通過(guò)與空載表達(dá)情況對(duì)照，發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白達(dá)較少，蛋白主要表達(dá)在沉淀中。

4 討論

糖基轉(zhuǎn)移酶是植物次生代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾酶，可催化三萜、黃酮、甾體生物堿等眾多化合物進(jìn)行糖基化修飾。藥用植物中的主要次生代謝產(chǎn)物通常為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，糖基化修飾對(duì)藥效成分生化活性及藥理作用具有顯著的影響。如穿心蓮中經(jīng)糖基化修飾后生成的新穿心蓮內(nèi)酯，其水溶性增加了數(shù)倍[21]。人參中含有的多種人參皂苷，其糖基化修飾的差異會(huì)使得同種皂苷產(chǎn)生不同甚至截然相反的藥理作用[22]。當(dāng)前對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的研究還有很多未知，一直是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。鳶尾作為一種傳統(tǒng)的藥用植物，其中含有多種三萜及其皂苷類成分，具有重要的藥理活性[1-3]。本研究基于鳶尾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選并克隆了2條糖基轉(zhuǎn)移酶基因，經(jīng)進(jìn)化樹(shù)分析，初步推測(cè)ItUGT349和ItUGT419可能以三萜類化合物作為底物進(jìn)行糖基化反應(yīng)，但I(xiàn)tUGT349可能具有更寬泛的底物選擇性。有研究指出，糖基轉(zhuǎn)移酶的底物選擇性與Ｎ端結(jié)構(gòu)域序列的差異高度相關(guān)[23-25]。如從茶樹(shù)中分離得到的糖基轉(zhuǎn)移酶CsUGT78A14可專一性的催化黃酮類化合物的糖基化反應(yīng)；而另一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶Cs UGT72AM1則可催化黃酮醇、花青素、木質(zhì)素等多種底物進(jìn)行糖基化反應(yīng)，二者C端序列高度保守但在Ｎ端則存在顯著差異[26-27]。進(jìn)一步對(duì)鳶尾糖基轉(zhuǎn)移酶ItUGT349 和ItUGT419結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)ItUGT349和ItUGT419的N端結(jié)構(gòu)域與三萜類的糖基轉(zhuǎn)移酶相似度更高，較黃酮類的糖基轉(zhuǎn)移酶則存在大片段的缺失，其可能導(dǎo)致對(duì)黃酮類底物的選擇性降低。

PhF3GT-矮牽牛F3GT Cp3GT-葡萄柚3GT CsUGT-茶樹(shù)UGT FiF3GT-連翹F3GT PfF3GT-紫蘇F3GT PjGAT-竹節(jié)參GAT

采用單因素方差分析，*P＜0.01 存在顯著性差異

M-Marker 1～3依次為BL21(DE3)-pET32a(+)全蛋白、可溶性蛋白、沉淀 4～6依次為ItUGTs全蛋白、可溶性蛋白、沉淀

吳世丹[28]對(duì)鳶尾中的幾種重要的三萜類成分進(jìn)行了含量分析，發(fā)現(xiàn)其在葉片中含量非常高，而根狀莖中的含量較低。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)和基因在鳶尾根狀莖、葉片和花組織中的表達(dá)情況；和基因差異表達(dá)與鳶尾各組織中三萜類化合物的積累趨勢(shì)較為一致，故推測(cè)ItUGT349和ItUGT419糖基轉(zhuǎn)移酶更可能參與鳶尾地上部分組織中的糖基化反應(yīng)。進(jìn)一步驗(yàn)證糖基轉(zhuǎn)移酶基因功能，需要通過(guò)蛋白原核表達(dá)，獲得相應(yīng)的酶蛋白，并與各種類型的底物進(jìn)行體外酶促反應(yīng)；其中可溶性融合蛋白的成功表達(dá)對(duì)后續(xù)鑒定酶的功能至關(guān)重要。

本研究通過(guò)構(gòu)建ItUGT349和ItUGT419原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中進(jìn)行蛋白表達(dá)，ItUGT349和ItUGT419均表達(dá)出可溶性蛋白，但I(xiàn)tUGT419可溶性蛋白表含量較低。有研究指出，融合蛋白可能會(huì)以包涵體的形式聚集在沉淀中，這與蛋白是否含有跨膜區(qū)及是否為分泌蛋白有關(guān)[29]；除此之外，蛋白的溶解性還與基因序列、蛋白空間結(jié)構(gòu)、表達(dá)載體、菌株及誘導(dǎo)條件等有關(guān)[30]。本課題組在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度和誘導(dǎo)劑（IPTG）的使用量等參數(shù)進(jìn)行了摸索，依然不能很好的提高ItUGT419的可溶性蛋白含量；下一步將繼續(xù)優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)或使用發(fā)酵罐增大菌體的誘導(dǎo)量，來(lái)獲得較大量的ItUGT419可溶性蛋白，為后續(xù)體外酶促反應(yīng)鑒定酶功能提供足夠的酶蛋白。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Genes clone and features analysis of glycosyltransferase genesandfrom

ZHANG Li-bing, LI Jing, TAO Wu-yang, HUANG Zi-lu, CHEN Jia-jie, DUAN Li-xin, JI Ai-jia

Guangdong Provincial Key Laboratory of Translational Cancer Research of Chinese Medicines, Joint International Research Laboratory of Translational Cancer Research of Chinese Medicines, International Institute for Translational Chinese Medicine, School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, China

To clone the glycosyltransferase genesandfromand conduct bioinformatics analysis, gene differential expression analysis and protein prokaryotic expression analysis.Gene-specific primers were designed based on the open reading frame (ORF) of, which were screened from the transcriptome data; And the gene products were obtained by PCR amplification. After sequencing identification, bioinformatics analysis was performed. Moreover, the different expression of both genes among various tissues were detected by real-time qPCR. Finally, the target gene was constructed into the prokaryotic expression vector pET-32a (+) and the soluble proteins were obtained in.The length of open reading frame (ORF) ofandwere 1461 bp and 1488 bp, respectively; And the molecular weight of the encoding proteins were 53 830 and 54 910. The fluorescence quantitative PCR results showed that the expression level ofwas highest in leaves, whilewas highly expressed in flowers. The phylogenetic tree showed that ItUGT419 was clustered with the UGTs, which were related to triterpene biosynthesis; And ItUGT349 was clustered with the UGTs, which were involved in the biosynthesis of triterpene, flavonoids and lignin. Finally, ItUGT349 and ItUGT419 were successfully expressed in.The full-length ORF cloning, sequences analysis, differential gene expression detection and prokaryotic expression ofandlay a foundation for the subsequent identification of their catalytic function in.

Maxim.; glycosyltransferase; gene cloning; bioinformatics analysis; prokaryotic expression; qRT-PCR

R286.12

A

0253 - 2670(2023)01 - 0254 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.027

2022-05-06

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（82003895）；廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金項(xiàng)目（2019A1515110594，2020A1515010926）；廣東省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（S202110572094，S202110572055）

張李兵，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱弥参锕δ芑蚪M學(xué)。

通信作者：季愛(ài)加，女，副研究員，藥用植物功能基因組學(xué)。E-mail: ajji@gzucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]