基于通用DNA條形碼序列的黃精屬藥用植物分子鑒定

張明英，李依民，程文萍，高 靜，顏永剛，楊 琳，胡錦航，張 崗*

基于通用DNA條形碼序列的黃精屬藥用植物分子鑒定

張明英1, 3，李依民1，程文萍1，高 靜1，顏永剛1，楊 琳1，胡錦航2*，張 崗1, 3*

1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 712046 2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083 3. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中醫(yī)藥管理局“秦藥”研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 712046

分析4個(gè)通用植物DNA條形碼序列（H-A、K、L和ITS2）及其組合對(duì)黃精屬藥用植物的物種鑒定分辨率，挖掘適用于黃精屬種間鑒定的高分辨率分子標(biāo)記。以《中國藥典》2020年版中收錄的黃精屬藥用植物黃精、滇黃精、多花黃精、玉竹及其地方常見同屬替代品、混偽品共12種79個(gè)野生個(gè)體為對(duì)象，將4個(gè)通用DNA條形碼序列獨(dú)立、聯(lián)合分析，評(píng)估其種間、種內(nèi)變異情況，并分別基于建樹法（tree-based method）和PWG距離法（PWG-distance method）評(píng)估不同條形碼及其組合的物種鑒定分辨率。ITS2序列擴(kuò)增成功率低，H-A、K、L序列的引物在黃精屬植物中通用性較好；3組葉綠體序列的種間變異依次為K＞H-A＞L，種內(nèi)變異差異不顯著，種間、種內(nèi)遺傳距離無明顯的Barcoding gap；各條形碼獨(dú)立及聯(lián)合分析的物種鑒定分辨率普遍偏低，其中，組合條形碼H-A＋K＋L在建樹法分析中的分辨率最高，為25%，H-A＋L在距離法分析中的分辨率最高，為50%。4個(gè)通用DNA條形碼序列及其組合都并非黃精屬藥用植物不同種間有效區(qū)分鑒定的理想分子標(biāo)記，但多序列聯(lián)合分析能在一定程度上提高物種鑒定成功率。

黃精屬；DNA條形碼；藥用植物；物種鑒定；黃精；滇黃精；多花黃精；玉竹

黃精屬M(fèi)ill.隸屬于天門冬科（Asparagaceae）是一個(gè)具有重要藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的草本植物類群。中國分布有黃精屬植物39種[1]，其中31種可入藥使用[2]，是中藥材的重要來源。《中國藥典》2020年版收載的大宗中藥材黃精和玉竹均來源于黃精屬藥用植物。其中，黃精來源于滇黃精Coll. et Hemsl.、黃精Red.或多花黃精Hua的干燥根莖，具補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎之功效；玉竹則來源于玉竹(Mill.) Druce的干燥根莖，可養(yǎng)陰潤燥、生津止渴，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中曾被列為上品，中醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛。此外，黃精屬植物含多糖、甾體皂苷、黃酮、生物堿等多種活性成分，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、調(diào)血脂、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[2-5]，在藥物開發(fā)研究中占據(jù)重要地位。

黃精屬也是一個(gè)物種分類鑒定研究中的“困難”類群。自1754年Miller建立黃精屬以來，其屬下物種劃分鑒定與種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系問題長期受到關(guān)注。由于該屬植物具有較高的形態(tài)多樣性，自然野生狀態(tài)下，不同種間、同種不同居群個(gè)體間的形態(tài)特征常存在過渡類型，且種間地理分布交叉重疊，導(dǎo)致依據(jù)形態(tài)性狀不易對(duì)不同物種進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分鑒定[6-10]。目前，黃精屬種間分類鑒定問題仍有待澄清。此外，由于多以根狀莖入藥，生藥性狀相似，若經(jīng)加工后，更是難以對(duì)其物種來源進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別[7,11]。在我國不同地區(qū)，卷葉黃精(Wall.) Royle、湖北黃精Pamp.、長梗黃精Merr. ex C. Jeffrey et McEwan、輪葉黃精(L.) All.、新疆黃精(Ledeb.) Kunth等多種非正品基原代用、混用、誤用，甚至偽品入藥現(xiàn)象普遍存在[2, 7, 11]，給該屬植物來源中藥材的用藥安全和臨床療效帶來隱患。

DNA條形碼技術(shù)從分子遺傳學(xué)角度為藥用植物及中藥材的客觀準(zhǔn)確鑒定提供了一條有效途徑[12]。國際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組（CBOL Plant Working Group）通過對(duì)7個(gè)葉綠體片段（L、K、C1、B、H-A、F-H和K-I）通用性（包括擴(kuò)增成功率、測(cè)序成功率、序列質(zhì)量）和物種鑒定分辨率的綜合分析評(píng)估，推薦L＋K組合可作為陸地植物鑒定的核心DNA條形碼[13]，并建議將ITS（包括ITS2）和HA作為輔助條形碼。中國植物條形碼研究團(tuán)隊(duì)（China Plant BOL Group）基于對(duì)種子植物75科141屬1757種共6 286個(gè)代表個(gè)體的分析結(jié)果提出將ITS（或ITS2）納入種子植物鑒定的核心條形碼[14]。陳士林及其團(tuán)隊(duì)在藥用植物及中藥材研究中建立了以ITS2序列為主、HA序列為輔的DNA條形碼分子鑒定體系[15]。這些條形碼已被廣泛用于藥用植物類群如柴胡屬L.[16]、五味子科（Schisandraceae）[17]、烏頭屬L.[18]、商陸屬L.[19]等及其來源的中藥材、飲片等的分子鑒定研究[20-22]。

目前，黃精屬DNA條形碼種間分子鑒定研究相對(duì)較少，楊培等[7]利用上述條碼對(duì)黃精屬8種44份樣品的分子鑒定研究發(fā)現(xiàn)，ITS和ITS2序列擴(kuò)增成功率低，HA、K及L序列的種間、種內(nèi)變異均較小，物種分辨率不足。Jiao等[23]利用ITS2和HA對(duì)39份不同地區(qū)來源中藥材黃精及其混偽品的鑒定分析表明，ITS2序列未能被成功擴(kuò)增，HA序列雖能夠?qū)⒅兴幉狞S精的基原物種與同屬其他物種區(qū)分開來，但由于較低的遺傳變異，對(duì)黃精屬種間鑒別的分辨率依然有限。

本實(shí)驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上，以《中國藥典》2020年版中收錄的中藥材黃精、玉竹基原植物及其在不同地區(qū)常見同屬替代品、偽品來源植物為研究對(duì)象，從物種和種內(nèi)個(gè)體水平增加取樣量，利用上述4個(gè)DNA條形碼序列（HA、K、L和ITS2）分別進(jìn)行獨(dú)立和聯(lián)合分析，基于建樹法（tree-based method）和PWG距離法（plant working group distance，PWG-distance method）開展分子鑒定研究，旨在評(píng)估各條碼及其不同組合的物種鑒定分辨率，篩選適用于黃精屬藥用植物種間有效鑒定的分子標(biāo)記，為該屬植物來源中藥材的準(zhǔn)確鑒定、用藥安全和藥用植物資源保護(hù)及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

以《中國藥典》2020版中收錄的黃精屬藥用植物黃精、滇黃精、多花黃精和玉竹，及文獻(xiàn)資料中記載的其同屬常見替代品、偽品共12個(gè)物種為研究對(duì)象，采集野外自然生長狀態(tài)下的健康葉片，每種至少采集3個(gè)來自不同分布地點(diǎn)或居群的代表個(gè)體，硅膠快速脫水干燥保存，用于DNA提取，同時(shí)采集憑證標(biāo)本。本研究共采集到57個(gè)代表個(gè)體，標(biāo)本經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定，保存于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本館。另有22個(gè)代表個(gè)體的序列數(shù)據(jù)由中國西南野生生物種質(zhì)資源庫提供，即總共79個(gè)代表個(gè)體（表1）。

表1 材料信息

2 方法

2.1 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

采用改良的CTAB法提取基因組總DNA，TE緩沖液溶解，得到的DNA溶液用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，Delaware，美國）檢測(cè)質(zhì)量與濃度。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在GeneAmp PCR System 9700 thermal cycle（Applied Biosystems, Foster City，CA，美國）上進(jìn)行。引物信息見表2。PCR反應(yīng)體系均為50 μL，包括2×Taq Plus PCR MasterMix 25 μL，10 μmol/L的正、反向引物各2 μL，模板DNA 10 μL，ddH2O補(bǔ)齊。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選用的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30～45 s，54.5～57.0 ℃退火30 s（各引物退火溫度詳見表2），72 ℃延伸60 s，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，結(jié)束后4 ℃保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。PCR引物合成和測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司西安分部完成。

2.2 序列拼接、比對(duì)及特征分析

測(cè)序原始結(jié)果利用Sequencher軟件進(jìn)行序列拼接，并根據(jù)測(cè)序峰圖對(duì)堿基進(jìn)行校正，去除引物區(qū)及兩端低質(zhì)量序列，將得到的所有序列分別在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn（https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)，驗(yàn)證序列的正確性。對(duì)拼接得到的ITS序列采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8 S和26 S區(qū)，獲得ITS2間隔區(qū)序列[29]。由于ITS2序列擴(kuò)增成功率較低，最終獲得的序列數(shù)量低于實(shí)驗(yàn)個(gè)體總數(shù)的50%，因而未將其納入后續(xù)分析。

表2 PCR擴(kuò)增引物信息

最終得到的3組葉綠體序列（HA、K、L）分別構(gòu)建多序列矩陣，利用MAFFT完成序列比對(duì)，并在Geneious軟件中進(jìn)行必要的人工檢查校正。將3組葉綠體序列分別獨(dú)立和兩兩、3個(gè)聯(lián)合進(jìn)行分析，即HA、K、L、HA＋K、HA＋L、K＋L和HA＋K＋L，共7組條形碼序列。對(duì)于3組獨(dú)立條形碼序列，利用MEGA軟件統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)（variable sites）和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（parsimony informative sites），并計(jì)算種間、種內(nèi)K2P（kimura 2-parameter distance）遺傳距離，利用IMB SPSS Statistics 25進(jìn)行Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)，分析各組序列的種間、種內(nèi)遺傳變異差異顯著性。聯(lián)合分析，即將3組獨(dú)立序列按不同組合分別進(jìn)行串聯(lián)合并，若某個(gè)體有序列缺失情況（如2條序列聯(lián)合時(shí)，某個(gè)體只有1條序列；或3條序列聯(lián)合時(shí)，某個(gè)體只有1條或2條序列），則將該個(gè)體在分析中去除。

2.3 物種鑒定分析

利用MEGA軟件分別計(jì)算上述7組條形碼序列的種間、種內(nèi)K2P距離，利用TaxonDNA結(jié)合統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)種間、種內(nèi)K2P距離分布頻度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪圖，評(píng)估種間和種內(nèi)遺傳距離間是否存在“Barcoding gap”。

采用建樹法和PWG距離法2種分析方法評(píng)估7組條形碼的物種鑒定分辨率。對(duì)于建樹法，利用MEGA軟件基于K2P距離和配對(duì)刪除（pair-deletion）模型，構(gòu)建鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹（neighbor-joining tree，NJ tree），系統(tǒng)發(fā)育樹各分支節(jié)點(diǎn)的靴帶支持率（bootstrap values，BS）通過進(jìn)行1000次自展重復(fù)分析獲得。當(dāng)同一物種的所有個(gè)體在系統(tǒng)樹上聚為一個(gè)單系，且支持率高于50%，則視為該物種鑒定成功[14, 30]。對(duì)于PWG距離法，利用MEGA軟件分別計(jì)算各物種的種間、種內(nèi)遺傳距離，當(dāng)某一物種與其他物種間的最小遺傳距離大于該物種種內(nèi)個(gè)體間的最大遺傳距離時(shí)，則表示該物種鑒定成功[13]。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR擴(kuò)增、測(cè)序結(jié)果及序列特征

PCR擴(kuò)增、測(cè)序結(jié)果及各序列相關(guān)信息見表3。3組葉綠體條形碼序列中，HA的擴(kuò)增和測(cè)序成功率均達(dá)到100%；L的擴(kuò)增成功率為100%，有2個(gè)個(gè)體測(cè)序失敗，即測(cè)序成功率為97.5%；K的擴(kuò)增成功率為88.6%，擴(kuò)增成功的個(gè)體全部成功測(cè)序。ITS2僅41個(gè)樣品擴(kuò)增成功，即擴(kuò)增成功率為51.9%，其中2個(gè)個(gè)體測(cè)序失敗，最終僅得到39條序列。擴(kuò)增失敗的樣品經(jīng)調(diào)整擴(kuò)增反應(yīng)條件（退火溫度、酶及引物、模板DNA量等）后電泳，仍未檢測(cè)到明亮、單一的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。

3組葉綠體序列比對(duì)后的長度為499～751 bp，變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)含量分別為1.5%～4.53%和1.2%～1.86%，其中K序列長度最長，且變異和信息位點(diǎn)含量均為最高。玉竹有9個(gè)個(gè)體（BS73～75、BS77、2020_13～17）的HA序列在60～67 bp位置發(fā)生8 bp的倒位（GTTTTCAT→ ATGAAAAC）。

3.2 Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)

Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)結(jié)果見表4，3組葉綠體序列的種間變異由大到小依次為K＞HA＞L，而種內(nèi)差異不顯著，即K＝HA＝L。

3.3 Barcoding gap檢驗(yàn)

Barcoding gap檢驗(yàn)結(jié)果見圖1，所有7組條形碼序列的種間、種內(nèi)遺傳距離均存在一定程度重疊，即沒有明顯的Barcoding gap存在。種內(nèi)距離分布較為集中，主要在0～0.004，種間遺傳距離相對(duì)離散，主要在0.003～0.01，序列聯(lián)合分析的種間、種內(nèi)遺傳距離重疊程度小于獨(dú)立分析。

表3 PCR擴(kuò)增、測(cè)序結(jié)果及比對(duì)后各組序列特征

表4 TrnH-psbA、matK及rbcL序列的種間、種內(nèi)變異Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)

3.4 物種鑒定分辨率

2種分析方法所得的各條形碼的物種鑒定分辨率見表5。建樹法分析結(jié)果中，獨(dú)立及聯(lián)合分析的分辨率為8.33%～25.00%，成功鑒定1～3個(gè)物種。其中，HA和K序列分別以74%和85%的支持率支持黃精種內(nèi)所有個(gè)體聚為單系，與其他物種區(qū)分開來，L序列分析結(jié)果支持長梗黃精所有個(gè)體單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)單系，與其他物種相區(qū)別，支持率為94%。聯(lián)合分析中，2個(gè)條形碼組合HA＋K、HA＋L及K＋L成功鑒別的物種數(shù)均為2個(gè)，依次分別為滇黃精（支持率為51%）和黃精（97%）、長梗黃精（95%）和滇黃精（80%）及長梗黃精（57%）和黃精（88%），鑒定成功率為16.66%。而長梗黃精、滇黃精和黃精3個(gè)物種同時(shí)被HA＋K＋L組合成功鑒定，支持率依次為94%、69%和96%（圖2）。

圖1 各條形碼序列及其不同組合的種間、種內(nèi)遺傳距離分布圖

表5 基于建樹法和PWG距離法分析的各條形碼序列及其不同組合的物種鑒定分辨率

圖2 TrnH-psbA、matK和rbcL序列聯(lián)合分析構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹

PWG距離法分析的物種鑒定分辨率為8.33%～50%，成功鑒定的物種數(shù)為1～6個(gè)。3個(gè)條形碼獨(dú)立分析的物種鑒定成功率依次為41.67%（K）、16.66%（L）和8.33%（HA）。組合條形碼中，HA+L共包含12種77個(gè)個(gè)體，其中，多花黃精、長梗黃精、二苞黃精、滇黃精、新疆黃精和輪葉黃精6個(gè)物種的種內(nèi)最大遺傳距離均小于其與其他物種間的最小遺傳距離而被成功鑒定，其余條形碼組合成功鑒定的物種數(shù)量均為5個(gè)（41.67%）。

4 討論

通用性高、測(cè)序質(zhì)量好、物種分辨率高是評(píng)價(jià)DNA條形碼序列的重要指標(biāo)[13-14]。本研究結(jié)果中，3個(gè)葉綠體條形碼序列HA、K、L的PCR擴(kuò)增成功率分別為100%、88.6%和100%，除L有2個(gè)個(gè)體測(cè)序失敗外，其余擴(kuò)增成功的個(gè)體全部成功測(cè)序，說明這3條序列的引物在黃精屬植物中通用性較好。

Chen等[15]對(duì)藥用植物（包括藻類、真菌及高等植物）753屬4800種6600個(gè)代表個(gè)體的分析結(jié)果表明，ITS2序列在物種水平的鑒定率高達(dá)92.7%，因此推薦將ITS2作為藥用植物分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列。然而，ITS/ITS2在一些類群中仍然存在難以成功擴(kuò)增和測(cè)序的問題[31]，黃精屬便是這樣一個(gè)類群。本研究結(jié)果顯示，ITS2的PCR擴(kuò)增成功率遠(yuǎn)低于其他3個(gè)葉綠體序列，僅為51.9%，調(diào)整擴(kuò)增反應(yīng)條件后仍未得到改善，79個(gè)個(gè)體最終只成功測(cè)序獲得39條序列。Jiao等[23]對(duì)不同產(chǎn)地來源中藥材黃精樣品及其混偽品的分子鑒定研究也發(fā)現(xiàn)ITS2序列不能被特異性擴(kuò)增成功，楊培等[7]對(duì)黃精屬藥用植物的分子鑒定研究亦曾得出相似的結(jié)論。PCR擴(kuò)增結(jié)果主要受到引物通用性和實(shí)驗(yàn)材料個(gè)體序列變異的影響。研究表明，利用基因組淺層測(cè)序（genome skimming）方法可以有效避免這些問題而獲取核基因組中的ITS序列[30, 32]，這將是解決黃精屬分子鑒定及相關(guān)研究中ITS2序列獲取問題的一個(gè)新選擇。

理想的DNA條形碼序列種內(nèi)遺傳距離應(yīng)明顯小于種間，即具有明顯的Barcoding gap，而本研究所有7組條形碼序列的種間、種內(nèi)遺傳距離均存在一定程度重疊，無明顯的Barcoding gap。此外，在建樹法分析結(jié)果中，HA＋K＋L組合的物種鑒定成功率最高，為25%，即所有12個(gè)物種中僅3個(gè)物種被同時(shí)成功鑒定；HA＋L組合在距離法中的物種分辨率最高，為50%，僅6個(gè)物種被同時(shí)成功鑒定。說明葉綠體序列HA、K、L及其組合都并非黃精屬藥用植物不同種間有效區(qū)分鑒定的理想分子標(biāo)記。盡管如此，從本研究兩種分析結(jié)果可以明顯看出，隨著序列數(shù)量的增加，物種鑒定分辨率也相應(yīng)提高。建樹法分析結(jié)果中，3個(gè)葉綠體序列獨(dú)立分析的物種鑒定分辨率均為8.33%（1/12），兩兩組合（HA＋K、HA＋L、K＋L）后分辨率提高為16.66%（2/12），HA＋K＋L三者聯(lián)合分析的物種鑒定分辨率提高至25%（3/12）。距離法分析結(jié)果中K獨(dú)立分析的物種分辨率最高，為41.67%，HA和L分別為16.66%和8.33%，而序列組合HA＋L的物種分辨率提高至50%。說明多個(gè)條形碼序列聯(lián)合分析能夠提供更多的物種演化信息位點(diǎn)，在一定程度上提高物種鑒定分辨率，這也與五味子科[17]、地黃屬Libosch. ex Fisch. & C. A. Mey.[33]等藥用植物類群的DNA條形碼分子鑒定研究結(jié)果一致。

被子植物葉綠體基因組大小一般在115～165 kb，編碼約110～130個(gè)基因，由于其序列進(jìn)化速率適中，極少發(fā)生重組、基因含量和順序高度保守，而所包含的物種演化信息量遠(yuǎn)大于單一或多個(gè)普通的DNA條形碼序列，作為“超級(jí)條形碼（ultra-barcode），近年來，在藥用植物分子鑒定研究中廣泛應(yīng)用。如Zhang等[34]利用葉綠體全基因組序列將通用DNA條形碼K＋L、ITS＋H-A聯(lián)合分析未能區(qū)分鑒定的菊科Compositae紫錐菊屬M(fèi)oench 9個(gè)物種有效鑒別開來，為具有藥用價(jià)值的紫錐菊(L.) Moench、狹葉紫錐菊DC.和白色紫錐菊(Nutt.) Nutt.及其混偽品的準(zhǔn)確鑒定提供了可靠依據(jù)。Zhu等[35]利用葉綠體全基因組序列將ITS2及K＋L均不能有效區(qū)分鑒定的名貴中藥材鐵皮石斛Kimura et Migo與其同屬5個(gè)近緣物種黃石斛Makino、始興石斛Z. L. Chen，S. J. Zeng & J. Duan、曲莖石斛Z. H. Tsi, S. C. Sun & L. G. Xu、滇桂石斛W. W. Sm.和鉤狀石斛Wall. ex Lindl.以≥99%的分辨率成功鑒定，為鐵皮石斛的入藥安全和有效性提供了重要保障。Yin等[36]的研究結(jié)果也表明利用葉綠體全基因組序列可以將薔薇屬L.藥用植物金櫻子Michx.、玫瑰Thunb.、犬薔薇L.以及月季花Jacq.與同屬其他物種有效區(qū)分鑒別。此外，F(xiàn)lodena等[37]對(duì)黃精屬19個(gè)代表物種的分子系統(tǒng)發(fā)育分析也進(jìn)一步表明，相比于單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因序列的分析結(jié)果，利用葉綠體基因組中的全部蛋白編碼基因序列聯(lián)合分析所得的系統(tǒng)發(fā)育樹分辨率明顯提高。因此，葉綠體全基因序列將有可能是解決黃精屬藥用植物種間鑒定困難問題的一條有效途徑，有待后續(xù)進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Molecular authentication of medicinalSpecies utilizing the universal DNA barcode sequences

ZHANG Ming-ying1, 3, LI Yi-min1, CHENG Wen-ping1, GAO Jing1, YAN Yong-gang1, YANG Lin1, HU Jin-hang2, ZHANG Gang1, 3

1. Shaanxi Qinling Application Development and Engineering Center of Chinese Herbal Medicine, College of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China 2. Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712083, China 3. Key Laboratory for Research of "Qin Medicine" of Shaanxi Administration of Traditional Chinese Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China

To investigate the species discrimination power of the four universal plant DNA barcodes (H-A,K,L and ITS2) and corresponding multi-barcode combinations in, and to explore high-resolution molecular markers suitable for.Seventy-nine wild individuals from 12 species, representing all the four medicinal species of(,,,) included in the(2020 Edition) and their local commonly used substitutions and inauthentic adulterants, were sampled. The interspecific and intraspecific genetic variation were estimated, tree-based and PWG-distance methods were applied to evaluate the species discrimination efficiency of each barcode sequence and their combinations.The primers ofH-A,K andL all showed good universality while most of the individuals failed to obtain ITS2 sequence in PCR amplification. The interspecific genetic variation of the three chloroplast sequences wasK>H-A>L, while their intraspecific genetic difference was not significant, and no obvious Barcoding gap was detected. All these barcode sequences including their combinations only get limited species resolution. Among which, the combination ofH-A+K+L possessed the best species-resolving power of 25% in tree-based method,H-A+L showed the highest resolution degree of 50% in PWG-distance method.None of the four barcode sequences nor their combinations were ideal molecular markers to address the problems of medicinalspecies authentication. Nonetheless, as the number of sequence increases, the degree of species resolution improves.

Mill.; DNA barcode; medicinal plant; species discrimination;Red;Coll. et Hemsl.;Hua;L.

R286.12

A

0253 - 2670(2023)01 - 0235 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.025

2022-06-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82003898）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2022JM-458）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研課題（2020GP34）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)博士科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)（104080001）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)“秦藥”品質(zhì)評(píng)價(jià)及資源開發(fā)學(xué)科創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2019-QN01）

張明英（1988—），女，講師，博士，研究方向?yàn)榉肿由帉W(xué)。E-mail: zhangmy@sntcm.edu.cn

通信作者：張 崗，教授，研究方向?yàn)樗幱弥参锷锛夹g(shù)與分子生物學(xué)。E-mail: jay_gumling2003@aliyun.com

胡錦航，講師，博士，研究方向?yàn)榭鼓[瘤藥物藥理。E-mail: hujinhanghi@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]