黃連-干姜有效組分自微乳給藥系統(tǒng)的制備與評(píng)價(jià)

李 鑫，余 玲，劉 葭，梅 凱，李婷婷，郝逗逗，王昕怡，王靈敏，吳 清*

·藥劑與工藝·

黃連-干姜有效組分自微乳給藥系統(tǒng)的制備與評(píng)價(jià)

李 鑫1，余 玲2，劉 葭1，梅 凱1，李婷婷1，郝逗逗1，王昕怡1，王靈敏1，吳 清1*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488 2. 江西醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，江西 上饒 334000

研究黃連-干姜有效組分自微乳給藥系統(tǒng)（-effective component self-microemulsion drug deliverysystem，Cop-Gin-SMEDDS）的處方與制備工藝，并且進(jìn)行體外質(zhì)量評(píng)價(jià)。通過(guò)溶解度實(shí)驗(yàn)、偽三元相圖的繪制和D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)確定Cop-Gin-SMEDDS的最佳處方組成；通過(guò)單因素考察，確定最佳制備工藝，并對(duì)Cop-Gin-SMEDDS理化性質(zhì)、穩(wěn)定性、體外釋放等進(jìn)行評(píng)價(jià)。最終確定Cop-Gin-SMEDDS的最優(yōu)處方（不含黃連總生物堿）為油酸5%，1,2-丙二醇41%，聚氧乙烯（40）氫化蓖麻油49%，干姜油5%；黃連總生物堿的投藥量為5%；最佳制備工藝為在37 ℃、轉(zhuǎn)速300 r/min條件下磁力攪拌10 min。得到的Cop-Gin-SMEDDS為深紅色澄清透明液體，稀釋后為黃色、均一透明的微乳溶液；透射電鏡下為圓球形，大小均勻，形態(tài)規(guī)則；平均粒徑大小為（22.21±0.45）nm、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.195±0.019、ζ電位為（?2.67±0.11）mV。Cop-Gin-SMEDDS中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿、表小檗堿及6-姜辣素的載藥量分別為（13.51±0.71）、（1.37±0.06）、（2.36±0.27）、（0.83±0.14）、（6.34±0.04）mg/g，包封率分別為（96.36±0.34）%、（95.49±0.59）%、（92.56±0.81）%、（95.17±0.39）%、（94.39±1.63）%。Cop-Gin-SMEDDS中鹽酸小檗堿在pH 7.4 PBS緩沖液、蒸餾水和pH 1.2鹽酸溶液中的24 h累積釋放率分別為（70.80±0.04）%、（96.17±0.10）%、（85.77±0.10）%；6-姜辣素在相應(yīng)釋放介質(zhì)中的24 h累積釋放率分別為（27.70±0.14）%、 （32.48±0.14）%、（32.96±0.07）%。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，將Cop-Gin-SMEDDS在不同溫度下放置30 d后其指標(biāo)成分及外觀性狀均無(wú)明顯變化。制備的Cop-Gin-SMEDDS外觀良好，載藥量和包封率高，能提高藥物的穩(wěn)定性和釋放量，有望進(jìn)一步開(kāi)發(fā)制備成口服給藥制劑。

干姜油；黃連總生物堿；自微乳給藥系統(tǒng)；偽三元相圖；D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)；黃連；干姜；鹽酸小檗堿；鹽酸巴馬??；鹽酸黃連堿；表小檗堿；6-姜辣素

黃連-干姜藥對(duì)最早出自于張仲景《傷寒論》，黃連苦寒清熱、厚腸止利，干姜辛溫散寒、溫中止瀉，二藥合用，一寒一熱，辛開(kāi)苦降，多用于治療痢疾、泄瀉等病[1]?，F(xiàn)代研究表明，黃連中的黃連總生物堿[2-3]和干姜中的姜辣素與揮發(fā)油[4]均具有抗炎、抗氧化等作用[5-12]，這些成分聯(lián)合使用時(shí)能明顯增強(qiáng)潰瘍性結(jié)腸炎等疾病的治療效果[13]。然而黃連總生物堿和干姜油均具有水溶性差的特點(diǎn)，并且干姜中姜酚類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)成分性質(zhì)不穩(wěn)定，會(huì)導(dǎo)致局部藥物濃度低，影響其藥效作用發(fā)揮[14-17]。因此，改善黃連總生物堿和干姜油的溶解度，提高姜辣素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)成分的穩(wěn)定性，對(duì)于這兩種有效組分聯(lián)合使用具有重要意義。但查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前關(guān)于這2種有效成分的增溶增穩(wěn)方面的研究較少。

自微乳給藥系統(tǒng)（self-microemulsion drug delivery system，SMEDDS）[18-19]是由表面活性劑、助表面活性劑和油組成的均勻混合體系。有研究報(bào)道，用中藥揮發(fā)油作為油相制備的自微乳包裹難溶性藥物，不僅能提高藥物的溶解度和揮發(fā)油的穩(wěn)定性，而且還能提升藥物的生物利用度[20]。因此，本研究根據(jù)自微乳給藥系統(tǒng)的性質(zhì)特點(diǎn)，結(jié)合“藥輔合一”的原則，首次將干姜油作為油相，與黃連總生物堿共載于同一體系中，制備黃連-干姜有效組分自微乳給藥系統(tǒng)（-effective component self-microemulsion drug deliverysystem，Cop-Gin-SMEDDS），以期實(shí)現(xiàn)提高黃連總生物堿和干姜油的溶解度和穩(wěn)定性的目的，為未來(lái)二者的聯(lián)合用藥提供參考。

1 材料

LC-10AD型高效液相色譜儀、SPD1020A檢測(cè)器，日本島津國(guó)際貿(mào)易有限公司；756PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；BT125D型電子天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；ZNCL-S-5D多點(diǎn)智能磁力攪拌器，河南愛(ài)博特科技發(fā)展有限公司；G16型醫(yī)用高速離心機(jī)，河北安新白洋離心機(jī)廠；Zetasize Nano ZS納米粒徑儀，英國(guó)馬爾文公司；JEM-1400 plus型透射式電子顯微鏡（TEM），日本JEOL公司。

黃連總生物堿提取物，批號(hào)20200915，鹽酸小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)22.39%，鹽酸巴馬汀質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.69%，鹽酸黃連堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.32%，表小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.64%，實(shí)驗(yàn)室自制；干姜油提取物，6-姜辣素質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.52%，批號(hào)GON1010L20-2020041701，湖南和廣生物科技有限公司；對(duì)照品鹽酸小檗堿，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)S13M9D55861，上海源葉生物科技有限公司；6-姜辣素，批號(hào)MUST-16122205，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.65%，成都曼斯特生物科技有限公司；蓖麻油，批號(hào)Z24O11Y128870，上海源葉生物科技有限公司；油酸，批號(hào)C10005653，上海麥克林生化科技有限公司；聚氧乙烯（40）氫化蓖麻油（Cremophor RH40，RH40），批號(hào)2822716860，北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司；辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯（Labrasol，批號(hào)175459）、二乙二醇單乙基醚（Transcutol P，批號(hào)159651），法國(guó)Gattefosse公司；1,2-丙二醇（1,2-propanediol，PG），批號(hào)20200427，天津福晨化學(xué)試劑有限公司；異丙醇，批號(hào)20180614，北京化工廠；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃連總生物堿飽和溶解度的測(cè)定

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定 稱(chēng)取適量鹽酸小檗堿、黃連總生物堿提取物、干姜油及其他輔料分別用甲醇溶解，以甲醇為空白對(duì)照溶液，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)設(shè)定波長(zhǎng)200～800 nm，掃描間隔為1 nm，對(duì)鹽酸小檗堿溶液、黃連總生物堿溶液及各輔料溶液進(jìn)行吸收波長(zhǎng)掃描。結(jié)果（圖1）顯示，對(duì)照品和供試品峰形基本一致，雖然在350 nm和425 nm處都有較大吸收，但部分輔料在350 nm處有干擾，因此確定測(cè)定波長(zhǎng)為425 nm。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)定適量鹽酸小檗堿對(duì)照品，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻后濾過(guò)，得492.9 μg/mL鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。精密吸取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液各0.05、0.10、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，以甲醇為空白對(duì)照，測(cè)定吸光度（）。以鹽酸小檗堿對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿的回歸方程為＝0.013 8＋0.001 4，＝1.000 0。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在2.47～98.98 μg/mL線性關(guān)系良好。

圖1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖

2.1.3 黃連總生物堿在各項(xiàng)中飽和溶解度的測(cè)定 依次精密移取各油相、表面活性劑、助表面活性劑2 mL至離心管中，分別向其中加入黃連總生物堿提取物，渦旋5 min，超聲20 min，并在37 ℃水浴中振蕩48 h，平衡后的樣品在離心半徑5.7 cm的離心機(jī)中以10 000 r/min離心30 min，取適量上層輔料用甲醇稀釋?zhuān)瑴y(cè)量其值，并按照“2.1.2”項(xiàng)下建立的方法計(jì)算黃連總生物堿飽和溶解度。由表1可知，油酸對(duì)黃連總生物堿溶解性最好；表面活性劑中Labrasol、RH40對(duì)黃連總生物堿溶解度較高；助表面活性劑中PG對(duì)黃連總生物堿的溶解度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他助表面活性劑。

2.2 偽三元相圖篩選各相用量范圍

通過(guò)考察各輔料之間的相容性確定表面活性劑為RH40、助表面活性劑為PG，結(jié)合課題組前期均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和投藥量預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定油相為干姜油-油酸（1∶1）。取篩選后確定的油相、表面活性劑和助表面活性劑配成系列不同比例（1∶1∶8、1∶2∶7、1∶3∶6、…、8∶1∶1）的混合輔料，共36組，處方總量固定為1 g。磁力攪拌混勻后加入37 ℃、100 mL蒸餾水中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為200 r/min繼續(xù)磁力攪拌，觀察能否形成澄清透明并帶有少許藍(lán)色乳光的溶液，記錄能形成該溶液的比例。使用Origin 8.0軟件繪制偽三元相圖，用于確定各相輔料用量范圍。將能形成符合要求的溶液的比例記錄并繪制偽三元相圖，結(jié)果如圖2所示。其中，灰色區(qū)域代表可形成自微乳的區(qū)域，在此范圍內(nèi)自微乳乳化迅速，沒(méi)有分層現(xiàn)象，乳化時(shí)間小于1 min，且能產(chǎn)生丁達(dá)爾效應(yīng)。初步確定自微乳處方輔料用量范圍（以質(zhì)量計(jì)）為10%～20%的干姜油-油酸（1∶1）、20%～70% RH40和20%～70% PG。

表1 黃連總生物堿在不同輔料中飽和溶解時(shí)的溶解度(, n = 3)

圖2 自微乳處方的偽三元相圖

2.3 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)優(yōu)化自微乳處方

2.3.1 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì) 參考偽三元相圖的結(jié)果，

將油相、表面活性劑、助表面活性劑的總量定為100%，用Design Expert 11.1軟件設(shè)計(jì)D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)的比例，根據(jù)該設(shè)計(jì)比例制備自微乳。固定黃連總生物堿提取物投藥量為5%，制備溫度為37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，攪拌5 min后于37 ℃條件下用50倍量蒸餾水稀釋自微乳，溫和攪拌乳化后考察微乳的粒徑、PDI及乳化時(shí)間，確定最優(yōu)處方比例。設(shè)計(jì)的比例及考察結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 數(shù)據(jù)模型擬合及響應(yīng)面分析 運(yùn)用Design Expert 11.1軟件，以油相用量（1）、表面活性劑RH40用量（2）、助表面活性劑PG用量（3）為影響因素，分別以粒徑（1）、PDI（2）、乳化時(shí)間（3）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行模型擬合，回歸分析結(jié)果見(jiàn)表3。模型＜0.05，表明該模型對(duì)于所有響應(yīng)參數(shù)都是顯著的。

結(jié)果表明自變量對(duì)粒徑、PDI、乳化時(shí)間都有顯著影響，粒徑最優(yōu)擬合符合特殊四次模型（special quartic model），PDI、乳化時(shí)間的最優(yōu)擬合符合立方模型（cubic model）。方程中的各變量系數(shù)為正值，表示因子與響應(yīng)值呈正相關(guān)，而負(fù)值表示負(fù)相關(guān)。其中擬合方程分別為1＝?753.201＋28.882＋90.143＋950.5112＋1 205.9013－140.5523＋694.841223－571.411223＋1 060.311232，2＝0.974 1；2＝78.751＋0.316 92＋0.298 63－136.7812－132.3013－0.369 723＋128.66123－62.6312(1－2)－55.5313(1－3)＋0.011 523(2－3)，2＝0.965 4；3＝?667.971＋9.162＋0.388 23＋1 146.8112＋1 100.9313－14.0723－962.95123＋516.0712(1－2)＋443.7013(1－3)－18.2623(2－3)，2＝0.988 1。

表2 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)回歸分析結(jié)果，分別得到各自變量與粒徑、PDI及乳化時(shí)間作為因變量的二維等高線和三維響應(yīng)圖，結(jié)果如圖3所示。由結(jié)果可知，表面活性劑和助表面活性劑的用量對(duì)自微乳成型的影響較大，乳化效率隨著表面活性劑含量增大而下降，適量的助表面活性劑有助于調(diào)節(jié)自微乳自乳化效率。因此，適宜的用量是保證乳化效率和粒徑大小的關(guān)鍵。

表3 粒徑、PDI及乳化時(shí)間模型擬合匯總

圖3 粒徑(A)、PDI (B) 和乳化時(shí)間(C)的二維等高線圖及三維響應(yīng)面

2.3.3 最優(yōu)處方及驗(yàn)證試驗(yàn) 運(yùn)用Design Expert 11.1軟件預(yù)測(cè)得到的最優(yōu)處方為油相10.0%、表面活性劑49.0%、助表面活性劑41.0%，預(yù)測(cè)所得微乳粒徑為23.080 nm，PDI為0.229，乳化時(shí)間為1.215 min。按照預(yù)測(cè)所得優(yōu)化處方進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，并計(jì)算偏差。結(jié)果如表4所示，指標(biāo)的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值之間的偏差均小于5%，說(shuō)明方程預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性良好。因此，得到最優(yōu)自微乳處方：油相為干姜油-油酸（1∶1）10.0%、表面活性劑為RH40 49.0%、助表面活性劑為PG 41.0%。

表4 D-最優(yōu)混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)的驗(yàn)證(, n = 3)

2.4 自微乳投藥量的考察

選擇投藥量分別為1%、3%、5%、6%、9%、10%、12%、15%的自微乳進(jìn)行投藥量的考察。根據(jù)D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)得到的最優(yōu)處方精密稱(chēng)取各輔料，共計(jì)3 g，將黃連總生物堿提取物加入助表面活性劑中，經(jīng)磁力攪拌、超聲助溶溶解后攪拌均勻，加入表面活性劑和油相，制備得不同投藥量自微乳。分別取不同投藥量自微乳1 g，以37 ℃蒸餾水稀釋50倍后得到不同載藥量的微乳，使用粒度儀測(cè)其粒徑、PDI，以10 000 r/min離心（離心半徑5.7 cm）30 min測(cè)量其離心穩(wěn)定性。

不同投藥量的粒徑和PDI結(jié)果如表5所示，隨著載藥的增加，自微乳乳化后其微乳粒徑、PDI逐漸增大；當(dāng)投藥量≥10%時(shí)，PDI大于0.3，提示投藥量≥10%的自微乳放置后可能出現(xiàn)不穩(wěn)定、粒徑增大的現(xiàn)象。離心穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同投藥量的微乳溶液離心后均未出現(xiàn)相分離，外觀仍呈現(xiàn)澄清、透明，但投藥量≥6%的微乳溶液出現(xiàn)少許沉淀物，并且隨著投藥量增加沉淀物逐漸增多。因此，選擇黃連總生物堿的投藥量為5%。

表5 不同投藥量自微乳乳化后的粒徑及PDI (, n = 3)

2.5 自微乳的最優(yōu)制備工藝考察

根據(jù)D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)得到的最優(yōu)處方精密稱(chēng)取各輔料共3 g，確定黃連總生物堿的投藥量為5%，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，保持其他工藝不變，分別考察在不同溫度（15、25、37、50、60 ℃）、不同磁力攪拌轉(zhuǎn)速（100、200、300、400、500 r/min）和不同攪拌時(shí)間（1、5、10、20、40 min）的條件下制備得到的自微乳，測(cè)量乳化時(shí)間、觀察乳化外觀的均勻性并測(cè)定乳液粒徑大小。結(jié)果顯示，當(dāng)制備溫度為37 ℃時(shí)，乳化時(shí)間最短，且粒徑與PDI最小（表6）；當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到300 r/min以上時(shí)，自乳化時(shí)間幾乎達(dá)到穩(wěn)定，PDI＜0.3（表7）；當(dāng)攪拌時(shí)間超過(guò)10 min時(shí)，微乳的粒徑及PDI均較小，且趨于穩(wěn)定（表8）。因此，Cop-Gin-SMEDDS的最佳工藝為在37 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min條件下磁力攪拌10 min。

2.6 含量測(cè)定方法的建立

2.6.1 黃連總生物堿的含量測(cè)定方法 由于干姜油在425 nm處的吸收會(huì)對(duì)黃連總生物堿的含量測(cè)定產(chǎn)生干擾，因此，選擇用HPLC法測(cè)量鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿和表小檗堿的含量來(lái)評(píng)價(jià)Cop-Gin-SMEDDS的載藥量和穩(wěn)定性。色譜條件：色譜柱為Inertsil?ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100毫升中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）；體積流量1 mL/min；洗脫方式：等度洗脫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；理論塔板數(shù)按照鹽酸小檗堿計(jì)算不低于5000。該方法專(zhuān)屬性、線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好，加樣回收率為101.05%，RSD為0.48%，符合要求，表明方法準(zhǔn)確度良好。色譜圖見(jiàn)圖4。以鹽酸小檗堿對(duì)照品的峰面積為對(duì)照，分別計(jì)算鹽酸小檗堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿和鹽酸巴馬汀的含量。

表6 制備溫度對(duì)自微乳的影響(, n = 3)

表7 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)自微乳的影響(, n = 3)

表8 攪拌時(shí)間對(duì)自微乳的影響(, n = 3)

2.6.2 6-姜辣素的含量測(cè)定方法 色譜條件：色譜柱為Inertsil?ODS-3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-甲醇-水（40∶5∶55）；體積流量1 mL/min；等度洗脫；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；理論塔板數(shù)按照6-姜辣素計(jì)算不低于5000。該方法專(zhuān)屬性、線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好，平均加樣回收率為99.67%，RSD為0.76%，符合要求，表明方法準(zhǔn)確度良好。色譜圖見(jiàn)圖5。

1-表小檗堿 2-鹽酸黃連堿 3-鹽酸巴馬汀 4-鹽酸小檗堿

圖5 6-姜辣素對(duì)照品(a)、Cop-Gin-SMEDDS供試品(b)和陰性對(duì)照(c)的HPLC圖

2.7 黃連總生物堿和干姜油自微乳給藥系統(tǒng)質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.7.1 形態(tài)觀察 制備的Cop-Gin-SMEDDS為澄清透明、流動(dòng)性較好的深紅色濃縮液，稀釋后得到的微乳溶液為澄清透明、流動(dòng)性好的黃色溶液（圖6）。在TEM下，呈圓球形，形態(tài)規(guī)則，大小較均勻，粒徑大小普遍在10～30 nm，乳滴之間無(wú)黏連（圖7）。

2.7.2 粒徑分布及ζ電位測(cè)定 將Cop-Gin- SMEDDS加水乳化后，測(cè)得其微乳溶液平均粒徑大小為（22.21±0.45）nm、PDI為0.195±0.019、ζ電位為（?2.67±0.11）mV，說(shuō)明其粒徑較小且分布均勻，穩(wěn)定性良好。Cop-Gin-SMEDDS溶液粒徑分布及ζ電位分布結(jié)果如圖8所示。

圖6 Cop-Gin-SMEDDS (A) 和乳化后微乳溶液(B)的外觀形態(tài)

圖7 Cop-Gin-SMEDDS乳化后TEM圖

圖8 Cop-Gin-SMEDDS的粒徑分布(a)和ζ電位分布(b)

2.7.3 載藥量和包封率的測(cè)定 精密稱(chēng)取Cop-Gin- SMEDDS 50 mg（），置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，超聲10 min，微孔濾膜過(guò)濾后，按照“2.6”項(xiàng)項(xiàng)建立的方法測(cè)定鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿、表小檗堿和6-姜辣素含量，測(cè)定結(jié)果記作1。精密稱(chēng)取微乳溶液0.25 g，置5 mL棕色量瓶中，加37 ℃的蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，置于離心管中，5000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，精密量取上清液1 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲助溶10 min，冷卻至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果記作2。按照下列公式計(jì)算載藥量和包封率[21]。

載藥量＝1/

包封率＝2/1

鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸黃連堿、表小檗堿和6-姜辣素的載藥量和包封率結(jié)果見(jiàn)表9，從結(jié)果可知各指標(biāo)成分均具有較高的載藥量和包封率，說(shuō)明自微乳處方及制備工藝達(dá)到目標(biāo)要求。

2.7.4 穩(wěn)定性考察 將Cop-Gin-SMEDDS于4、25、40 ℃條件下，放置30 d。在實(shí)驗(yàn)的第0、10、20、30天分別取樣適量，觀察其外觀性狀并測(cè)定指標(biāo)成分的含量以及微乳溶液的平均粒徑大小、PDI。結(jié)果表明，Cop-Gin-SMEDDS的外觀仍無(wú)明顯變化，含量測(cè)定結(jié)果也顯示該自微乳給藥系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性（表10、11）。

表9 載藥量、包封率檢測(cè)結(jié)果(, n = 3)

表10 Cop-Gin-SMEDDS粒徑、PDI和形狀外觀的變化(, n = 3)

2.8 體外釋放

分別精密稱(chēng)取黃連總生物堿提取物、干姜油提取物及含有相同藥量的Cop-Gin-SMEDDS，裝于透析袋中，分別以蒸餾水、pH 7.4 PBS沖液和pH 1.2鹽酸溶液做釋放介質(zhì)并加入1%聚山梨酯-80作為漏槽條件，置于（37±5）℃恒溫水浴中，100 r/min轉(zhuǎn)速磁力攪拌。于放樣后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72 h時(shí)分別從錐形瓶中取出1 mL接收溶液并加入等量的釋放介質(zhì)，以鹽酸小檗堿和6-姜辣素作為指標(biāo)成分，根據(jù)“2.6”項(xiàng)建立的含量測(cè)定方法分別測(cè)定其含量，指標(biāo)成分的累積釋放率計(jì)算公式[22]如下所示。

Q為第個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積釋放率，為接收液的體積，V為每次取樣體積，C和C分別為第次和第次取樣時(shí)接收液中藥物濃度，為制劑中所含藥物質(zhì)量

結(jié)果如圖9所示，Cop-Gin-SMEDDS中鹽酸小檗堿在蒸餾水、pH 7.4 PBS沖液和pH 1.2鹽酸溶液中的24 h最終累積釋放率分別為（96.17±0.10）%、（70.80±0.04）%、（85.77±0.10）%，Cop-Gin- SMEDDS中6-姜辣素在3種釋放介質(zhì)中的24 h最終累積釋放率分別為（32.48±0.14）%、（27.7±0.14）%、（32.96±0.07）%，而黃連總生物堿提取物中鹽酸小檗堿在相應(yīng)釋放介質(zhì)中的累釋放率分別為（86.79±0.21）%、（48.67±0.36）%、（49.77±0.10）%，干姜油提取物中6-姜辣素在相應(yīng)釋放介質(zhì)中的累積釋放率分別為（26.78±0.64）%、（22.21±0.05）%、（28.41±0.12）%。自微乳給藥系統(tǒng)中各指標(biāo)成分24 h累積釋放率均高于提取物，說(shuō)明自微乳給藥系統(tǒng)可改善藥物的溶出度和釋放速率。

表11 Cop-Gin-SMEDDS中各指標(biāo)成分含量的變化(, n = 3)

圖9 黃連和干姜有效組分提取物和Cop-Gin-SMEDDS指標(biāo)成分鹽酸小檗堿(a)和6-姜辣素(b)的體外釋放曲線(, n = 3)

3 討論

黃連-干姜作為中藥方劑中的常用藥對(duì)[23]，研究其藥效組分黃連總生物堿和干姜油的連用對(duì)其治療痢疾、泄瀉具有重大意義。然而由于黃連總生物堿和干姜油溶解度低、姜酚類(lèi)成分性質(zhì)不穩(wěn)定等限制了其聯(lián)合應(yīng)用。自微乳給藥系統(tǒng)是一種由油相、表面活性劑和助表面活性劑組成的給藥系統(tǒng)。研究顯示[20]，中藥的芳香油如丁香油等，可以用來(lái)作為油相來(lái)制備自微乳，包裹其他藥物進(jìn)行聯(lián)合用藥。因此本研究結(jié)合“藥輔合一”的思想，考慮將干姜油作為油相，與黃連總生物堿共載制備自微乳，以期提高黃連總生物堿和干姜油的溶解度以及姜酚類(lèi)成分的穩(wěn)定性。

油相是影響自微乳成型的處方的重要因素。篩選油相的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相對(duì)于油相的種類(lèi)，油相的用量對(duì)自微乳的成型影響較大，并且所有油相的最佳用量都在10%左右。投藥量的預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示黃連總生物堿的最大投藥量為5%，當(dāng)投藥量大于5%時(shí)，自微乳給藥系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生沉淀。課題組在均勻設(shè)計(jì)的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)干姜油與黃連總生物堿比例為1∶1時(shí)，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果最好，因此在本研究中按該比例來(lái)制備自微乳。因此綜合考慮下，選擇對(duì)黃連總生物堿溶解度最大的油酸與干姜油以1∶1比例的混合油作為油相。

篩選表面活性劑時(shí)，除了考慮其對(duì)藥物的溶解能力外，還應(yīng)考察表面活性劑與油相形成微乳的能力[24]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)RH40的乳化性能最好，質(zhì)量占比為70%時(shí)就能形成符合要求的微乳溶液，而其他表面活性劑則需要占比80%以上才能形成。雖然所有的助表面活性劑與RH40均相容，但考慮到PG對(duì)黃連總生物堿溶解度最大，因此選擇PG作為自微乳的助表面活性劑。

自微乳乳化后的粒徑與藥物釋放密切相關(guān)，一般認(rèn)為粒徑越小藥物的跨膜運(yùn)輸效果可能越好[25]。本研究制備的自微乳用水稀釋后自乳化形成的微乳液滴粒徑為（22.21±0.45）nm，PDI為0.195±0.019，提示乳化后的粒徑很小且粒徑分布均勻性好。體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cop-Gin-SMEDDS中鹽酸小檗堿和6-姜辣素在3種釋放介質(zhì)中的24 h內(nèi)的累計(jì)釋放率和釋放速率均高于提取物，表明自微乳給藥系統(tǒng)能夠提升藥物的溶出度和釋放速率。

由于干姜油在425 nm處有吸收，會(huì)對(duì)黃連總生物堿的測(cè)量有影響，所以載藥量和包封率的考察沒(méi)有選用紫外分光光度法測(cè)定黃連總生物堿含量，而是用HPLC在350 nm處檢測(cè)表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿4種生物堿含量，以此代表黃連總生物堿含量；姜辣素是干姜的主要成分，其中姜酚類(lèi)是姜辣素的主要成分，而6-姜辣素是在姜酚中含量最高[26]，因此，選擇6-姜辣素代表干姜油的含量。結(jié)果顯示，Cop-Gin-SMEDDS中各指標(biāo)成分的載藥量均良好，各成分的包封率也都在92%以上，表明Cop-Gin-SMEDDS具有良好的載藥量和包封率。在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中Cop-Gin-SMEDDS中各指標(biāo)成分含量與外觀性狀均無(wú)明顯變化，表明自微乳給藥系統(tǒng)能提升藥物的穩(wěn)定性。

綜上所述，本研究制備的Cop-Gin-SMEDDS具有較小的粒徑和較高的載藥量與釋藥速率，能夠提高黃連總生物堿和干姜油的溶解度、增強(qiáng)姜酚類(lèi)成分的穩(wěn)定性。未來(lái)將以Cop-Gin-SMEDDS為基礎(chǔ)，制備口服結(jié)腸靶向制劑，進(jìn)一步其提高穩(wěn)定性和使用方便性，以期更好地應(yīng)用于潰瘍性結(jié)腸炎等疾病的治療。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and evaluation of self-microemulsion drug delivery system for effective components of-

LI Xin1, YU Ling2, LIU Jia1, MEI Kai1,LI Ting-ting1, HAO Dou-dou1, WANG Xin-yi1, WANG Ling-min1, WU Qing1

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2.Jiangxi Medical College, Shangrao 334000, China

To study the formulation and preparation technology of self-microemulsion drug delivery system of effective components of Huanglian ()-Ganjiang () (Cop-Gin-SMEDDS), and evaluate it.The best prescription composition of Cop-Gin-SMEDDS was determined by solubility experiment, pseudo ternary phase diagram drawing and D-optimal mixture design. Through single factor investigation, the optimal preparation process was determined, and the physicochemical properties, stability andrelease of Cop-Gin-SMEDDS were evaluated.The optimal prescription of Cop-Gin-SMEDDS (excluding total alkaloids of) was oleic acid 5%, 1,2-propanediol 41%, polyoxyethylene (40) hydrogenated castor oil 49%, dried ginger oil 5%. The dosage of coptis alkaloids was 5%. The optimum preparation process was magnetic stirring at 37 ℃ and 300 r/min for 10 min. The obtained Cop-Gin-SMEDDS was a dark red clear and transparent concentrate, and after dilution, it was a yellow, homogeneous and transparent microemulsion solution. Under transmission electron microscope, it was round and spherical, with uniform size and regular shape. The average particle size was (22.21 ± 0.45) nm, PDI was 0.195 ± 0.019, and ζ potential was (?2.67 ± 0.11) mV. The drug loading of berberine hydrochloride, palmatine hydrochloride, coptisine hydrochloride, epiberberine and 6-gingerol in Cop-Gin-SMEDDS were (13.51 ± 0.71), (1.37 ± 0.06), (2.36 ± 0.27), (0.83 ± 0.14) and (6.34 ± 0.04) mg/g, respectively. The encapsulation efficiency were (96.36 ± 0.34)%, (95.49 ± 0.59)%, (92.56 ± 0.81)%, (95.17 ± 0.39)% and (94.39 ± 1.63)%, respectively. The 24 h cumulative release rates of berberine hydrochloride in Cop-Gin- SMEDDS in pH7.4 PBS buffer, water and pH 1.2 hydrochloric acid solution were (70.80 ± 0.04)%, (96.17 ± 0.10)%, and (85.77 ± 0.10)%, respectively; the 6-gingerol in corresponding release media were (27.7 ± 0.14)%, (32.48 ± 0.14)% and (32.96 ± 0.07)%, respectively. The stability experiment showed that there was no significant change in the index components and appearance properties of cop-gin-SMEDDS after it was placed at different temperatures for 30 d.The prepared Cop-Gin-SMEDDS has good appearance, high drug loading and encapsulation efficiency. It can improve the stability and release of drugs. It is expected to be further developed into oral drug delivery preparations.

dried ginger oil; total alkaloids of; self-microemulsion drug delivery system; pseudo ternary phase diagram; D-optimal mixture design;;; berberine hydrochloride; palmatine hydrochloride; coptisine hydrochloride; epiberberine; 6-gingerol

R283.6

A

0253 - 2670(2023)01 - 0051 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.008

2022-06-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81773915）

李 鑫（1997—），男，碩士研究生，從事中藥新劑型的研究。Tel: 17354008830 E-mail: xinzhizhu54946@163.com

通信作者：吳 清（1965—），女，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥新劑型與新技術(shù)的研究。Tel: (010)84738603 E-mail: qwu@vip.sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]