pH條件對(duì)肌原纖維蛋白乳液微凝膠性質(zhì)的影響

陳佳詩(shī)，張利平，王旭峰，林可情，繆松，鄭寶東，張龍濤*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.中國(guó)-愛(ài)爾蘭國(guó)際合作食品物質(zhì)學(xué)與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)研究中心，福建 福州 350002；3.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；4.Teagasc 食品研究中心，愛(ài)爾蘭科克 P61C 996）

乳液微凝膠（emulsion microgels）是一個(gè)或多個(gè)乳狀液滴被軟固體包裹形成的微米級(jí)軟顆粒，特殊的物理形態(tài)使其兼具乳液的脂肪包埋功能[1]和微凝膠軟顆粒的機(jī)械性能，能提供類似于脂肪的邊界潤(rùn)滑作用[2]?，F(xiàn)有制備方法包括乳液凝膠破碎法、乳液擠出外部凝膠化法、多步驟乳液模板化法及流體凝膠法[3]。以蛋白質(zhì)為乳化、凝膠材料，采用流體凝膠技術(shù)，可以通過(guò)調(diào)整工藝參數(shù)對(duì)微凝膠的粒度、形貌和模量等進(jìn)行控制，近年來(lái)得到較多關(guān)注[4-5]，Moakes 等采用該技術(shù)，制成尺寸在微米級(jí)（25 μm）、乳液封裝效率達(dá)99%的乳清分離蛋白乳液微凝膠顆粒[5]。形成和維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的作用力主要有靜電相互作用、疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等[6]。肌原纖維蛋白是動(dòng)物蛋白凝膠形成的主要成分，pH 通過(guò)影響肌原纖維蛋白氨基酸側(cè)鏈電荷分布，改變蛋白質(zhì)分子間的相互作用，影響蛋白質(zhì)及其熱誘導(dǎo)凝膠的非共價(jià)鍵作用力和結(jié)構(gòu)[7]。研究pH 對(duì)肌原纖維蛋白乳液微凝膠性質(zhì)的影響，對(duì)于其制備過(guò)程及應(yīng)用研究具有十分重要的意義。

以蛋白質(zhì)乳液為原料制備的凝膠，其凝膠層主體來(lái)自水相中的蛋白質(zhì)，pH 變化導(dǎo)致氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的電離或質(zhì)子化狀態(tài)發(fā)生改變，改變了蛋白質(zhì)分子的電荷分布，蛋白質(zhì)分子間的靜電相互作用也因此改變[8]。肌原纖維蛋白凝膠非共價(jià)鍵作用力、二級(jí)結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)與pH 密切相關(guān)，pH 從7.0 降到5.0，會(huì)導(dǎo)致靜電排斥力降低，而疏水相互作用、氫鍵等吸引力基本不變；另外α-螺旋含量降低，β-折疊含量增多，凝膠微觀結(jié)構(gòu)變得無(wú)序，孔徑減小[7]。以乳清分離蛋白和蛋清蛋白為原料制備微凝膠顆粒的研究表明，可通過(guò)制備時(shí)改變pH 條件，調(diào)控其顆粒粒徑和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對(duì)流變特性產(chǎn)生影響。蛋清蛋白流體凝膠（pH 7.5）與乳清分離蛋白流體凝膠（pH 3.5 和pH 8.0）顯示出高黏度和良好的潤(rùn)滑性能，而在各自的等電點(diǎn)附近，流體凝膠潤(rùn)滑性能均降低，可能與顆粒聚集導(dǎo)致流體凝膠在等電點(diǎn)時(shí)的粒徑增大有關(guān)[9]。由此推測(cè)，在不同的pH 條件下制備乳液微凝膠，可能會(huì)對(duì)乳液微凝膠顆粒的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其機(jī)械性能和功能特性。然而，迄今為止未見(jiàn)制備時(shí)改變pH 條件對(duì)乳液微凝膠性質(zhì)影響的報(bào)道。作者以肌原纖維蛋白為原料，采用流體凝膠法制備乳液微凝膠顆粒，探究不同pH 條件對(duì)乳液微凝膠顆粒性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金線魚(yú)魚(yú)糜：福建海欣食品股份有限公司提供；大豆油：泉州福海糧油工業(yè)有限公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸：上海Solarbio 生物科技有限公司產(chǎn)品；十二水磷酸二氫鈉、二水磷酸二氫鈉、氯化鈉、五水硫酸銅、六水氯化鎂、酒石酸鉀鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；尼羅紅：Acros Organics 公司產(chǎn)品；尼羅藍(lán)：Alfa Aesar 化學(xué)有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-E 冷凍離心機(jī)：美國(guó)Beckman 公司產(chǎn)品；SCIENTZ-950E 超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；FDU-1200 冷凍干燥機(jī)：上海愛(ài)朗儀器有限公司產(chǎn)品；T18 Basic 高速分散機(jī)：德國(guó)IKA 公司產(chǎn)品；pH 700 測(cè)量?jī)x：美國(guó)Eutech 公司產(chǎn)品；BAS 系列電子天平：德國(guó)Sartorius 公司產(chǎn)品；Zeiss LSM 700 激光共聚焦顯微鏡：德國(guó)Leica 公司產(chǎn)品；UV/V-1800 紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；MCR 301 高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀：奧地利Anton Paar 公司產(chǎn)品；Mastersizer3000 激光粒度儀：英國(guó)Malvern 公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取稱取適量的金線魚(yú)魚(yú)糜，加入4 倍體積磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L 磷酸鈉、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA，pH 7）勻漿60 s，4 ℃、3 000g離心15 min，得到沉淀，重復(fù)以上步驟2 次；向沉淀中加入4 倍體積0.1 mol/L NaCl 溶液，勻漿60 s 后，4 ℃、3 000g離心15 min，得到沉淀，調(diào)節(jié)pH 至6.25 后，重復(fù)一次，得到的沉淀即為肌原纖維蛋白。將蛋白質(zhì)分散于磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L 磷酸鈉、0.6 mol/L NaCl，pH 6.25），調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為15 mg/mL，備用。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度采用雙縮脲法測(cè)定。

1.3.2 不同pH 條件下肌原纖維蛋白乳液微凝膠的制備將15 mg/mL 肌原纖維蛋白溶液超聲處理（300 W，6 min）后，加入油相，使最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，在13 000 r/min 下高速分散3 min，得到穩(wěn)定的肌原纖維蛋白乳液。使用0.1 mol/L NaOH 溶液或HCl 溶液，以每分鐘20 滴的滴加速率和100 r/min的攪拌速率，將乳液pH 分別調(diào)至3、4、5、6、7、8、9，將不同pH 的乳液在40 ℃平衡5 min 后，以2 ℃/min的加熱速率將乳液加熱至80 ℃，保溫15 min 后，冰浴冷卻，整個(gè)過(guò)程施加剪切。

1.3.3 粒度測(cè)定采用靜態(tài)光散射技術(shù)，通過(guò)Mastersizer 3000 激光粒度儀測(cè)定顆粒的平均粒徑和粒度分布。顆粒采用蛋白質(zhì)的相對(duì)折射率1.46，顆粒吸收率0.001，水相折射率1.330，樣品池中攪拌的轉(zhuǎn)速控制在2 000 r/min 用于分散樣品，加入樣品直至遮光度為10%，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次取平均值。

1.3.4 ζ 電位使用Zetasizer nano series 粒度儀測(cè)定不同pH 條件下肌原纖維蛋白的ζ 電位，測(cè)量樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2 mg/mL。

1.3.5 微觀結(jié)構(gòu)將樣品與等份的尼羅藍(lán)（0.1 g/L）和尼羅紅（0.1 g/L）溶液充分混合。染色后的樣品使用Zeiss LSM 880 激光共聚焦顯微鏡觀察，在488 nm 和633 nm 激發(fā)波長(zhǎng)收集圖像，物鏡倍數(shù)40 倍。

1.3.6 流變性質(zhì)測(cè)定使用Anton Parr MCR 301旋轉(zhuǎn)流變儀對(duì)微凝膠流變特性進(jìn)行測(cè)試，使用PP25平行板，板間距設(shè)定為1 mm。為了消除顆粒相體積對(duì)流變特性的影響，凝膠在10 000g下離心10 min，去除游離水。樣品在4 ℃儲(chǔ)存24 h 后進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)用硅油密封，防止溶劑損失或大氣水分的吸附。所有的乳液微凝膠樣品均在20 ℃下進(jìn)行分析，所有樣品均采用相同的程序標(biāo)準(zhǔn)。

1）溫度掃描 量取19 mL 不同pH 的乳液倒入同心圓筒中，在40 ℃平衡5 min 后，以2 ℃/min 速率升至80 ℃后保溫10 min，后降至40 ℃，整段過(guò)程中持續(xù)施加剪切，記錄過(guò)程中黏度的變化。

2）振幅掃描 頻率設(shè)為1 Hz，應(yīng)變范圍為0.1%～100%，記錄儲(chǔ)存模量（G′）和損耗模量（G″）隨應(yīng)變的變化，測(cè)出樣品的線性黏彈區(qū)域。

3）頻率掃描 在角頻率變化范圍為0.1～100 rad/s 時(shí)，施加0.1%恒定應(yīng)變進(jìn)行頻率掃描，記錄G′、G″隨頻率的變化，并對(duì)曲線進(jìn)行冪率擬合，公式如下：

式中：G′為儲(chǔ)存模量，Pa；k為冪律常數(shù)；ω 為角頻率，rad/s；n為頻率指數(shù)。

4）黏度測(cè)定 采用對(duì)數(shù)取點(diǎn)方式，剪切速率從0.01 s-1到600 s-1再到0.01 s-1進(jìn)行穩(wěn)態(tài)速率掃描，記錄黏度變化，并計(jì)算兩次掃描形成的滯后環(huán)面積。剪切黏度隨速率變化采用Power-Law 模型進(jìn)行流動(dòng)曲線擬合，方程如下：

式中：η 為黏度，Pa·s；γ 為剪切速率，s-1；a為一致性指數(shù)，Pa·sn；n為流動(dòng)行為指數(shù)。

5）恢復(fù)力測(cè)試 三階剪切流動(dòng)測(cè)量如下：首先對(duì)樣品施加1 s-1的剪切速率，持續(xù)120 s；之后對(duì)樣品施加300 s-1的剪切速率，持續(xù)120 s；最后對(duì)樣品施加1 s-1的剪切速率，持續(xù)120 s；記錄過(guò)程中黏度變化，計(jì)算恢復(fù)率。

6）時(shí)間掃描 對(duì)樣品施加1 s-1和200 s-1的剪切速率，剪切時(shí)間為600 s。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)使用Origin Pro8.6 繪圖。使用SPSS 做數(shù)據(jù)分析，并進(jìn)行ANOVA 差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ζ 電位

蛋白質(zhì)含有可電離基團(tuán)，許多功能受到電荷水平的影響[10]，蛋白質(zhì)的聚集或分散是表面電荷相互作用的結(jié)果。ζ 電位是表征膠體體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，通過(guò)吸引力或排斥力誘導(dǎo)短程粒子間的相互作用[11]。蛋白質(zhì)電荷的pH 依賴性主要?dú)w因于羧基和氨基對(duì)蛋白質(zhì)分子電離狀態(tài)的影響。pH 通過(guò)影響肌原纖維蛋白氨基酸側(cè)鏈電荷分布，改變蛋白質(zhì)分子間的相互作用，影響蛋白質(zhì)及其熱誘導(dǎo)凝膠的非共價(jià)鍵作用力和結(jié)構(gòu)[12]。由圖1可知，pH 為3、4時(shí)蛋白質(zhì)帶正電荷，pH 大于5 時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，等電點(diǎn)約為5，與張興等研究結(jié)果相同[7]。

圖1 肌原纖維蛋白ζ 電位隨pH 的變化Fig.1 Effect of pH on the ζ potencial of myofibrillar protein

2.2 粒度分布

如圖2所示，不同pH 條件制備的乳液微凝膠的粒徑主要分布在10～1 000 μm，pH 3～9 時(shí)平均粒徑分別為156、164、158、57.7、54.9、54.2、50.7 μm。不同pH 條件對(duì)乳化油滴的大小有影響，在低pH 及等電點(diǎn)附近，由于靜電相互作用的影響，形成的油滴較大[13]，進(jìn)一步影響到以油滴為核的乳液微凝膠的粒徑大小。pH 的改變引起蛋白質(zhì)電荷的變化，從而影響蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)和聚集。

圖2 不同pH 條件制備的肌原纖維蛋白乳液微凝膠的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of myofibrillar protein emulsion microgels prepared under different pH values

由圖可知，pH 3～5 時(shí)粒徑較大，分布較寬，粒徑分布圖形成寬峰，向右偏移，由于以大油滴作為凝膠成核的點(diǎn)，并且在等電點(diǎn)附近時(shí)，表面靜電荷較小，靜電相互作用較小，疏水基團(tuán)暴露等，在形成凝膠的過(guò)程中，蛋白質(zhì)的聚集速度較快，同時(shí)低pH 條件下油滴也較大，易形成較大粒徑的微凝膠。而pH大于等電點(diǎn)時(shí)，作為凝膠成核點(diǎn)的油滴較小，同時(shí)由于靜電相互作用，蛋白質(zhì)之間斥力較大，蛋白質(zhì)聚集速度慢且聚集受到抑制，易形成較小粒徑的微凝膠。因此，pH 在3～5 時(shí)粒徑較大，分布于150 μm附近，pH 6～9 時(shí)，粒徑較小，分布于50～60 μm。

2.3 微觀結(jié)構(gòu)分析

油相呈現(xiàn)綠色熒光，蛋白質(zhì)呈現(xiàn)紅色熒光。由圖3可知，pH 為5、6、7 時(shí)，油滴周圍形成相對(duì)致密的殼層，球形油滴被肌原纖維蛋白凝膠包封?？赏茰y(cè)微凝膠的形成遵循成核和生長(zhǎng)模型，以油滴作為成核和生長(zhǎng)的點(diǎn)，在油滴周圍乳化形成膜的蛋白質(zhì)經(jīng)加熱誘導(dǎo)變性充分展開(kāi)，與水相中變性的蛋白質(zhì)相遇后聚集，形成一個(gè)蛋白質(zhì)殼層，將油滴包裹住。同時(shí)，在高于等電點(diǎn)的環(huán)境中，使帶電的蛋白質(zhì)顆粒呈現(xiàn)短距離靜電作用。因此，在此亞穩(wěn)態(tài)的乳液微滴，處于靜電作用、剪切作用和由加熱導(dǎo)致的化學(xué)鍵合作用的平衡中。在pH 為5、6、7 時(shí)，剪切作用、化學(xué)鍵合作用強(qiáng)于靜電作用所導(dǎo)致的顆粒間的斥力，因此，形成了以油滴為核心的微凝膠的成長(zhǎng)。在pH 為8、9 時(shí)，靜電斥力較強(qiáng)，蛋白質(zhì)顆粒之間的聚集受到抑制，因此，油滴與帶電的蛋白質(zhì)顆粒以相對(duì)松散的形態(tài)存在，通過(guò)空間阻隔作用，形成油滴與蛋白質(zhì)顆粒之間的亞穩(wěn)態(tài)平衡。

圖3 肌原纖維蛋白乳液微凝膠顆粒的微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Microstructure of myofibrillar protein emulsion microgels

2.4 流變測(cè)試分析

2.4.1 溫度掃描圖4顯示了不同pH 條件下制備肌原纖維蛋白乳液微凝膠過(guò)程中的黏度變化。初始階段，pH＞6 時(shí)微凝膠的黏度顯著增加，pH 3～5 的微凝膠黏度趨于平穩(wěn)，之后系統(tǒng)的表觀黏度緩慢下降。到達(dá)80 ℃時(shí)黏度保持相對(duì)穩(wěn)定，在降溫過(guò)程中，黏度持續(xù)上升。

圖4 肌原纖維蛋白乳液微凝膠形成過(guò)程中黏度變化Fig.4 Viscosity change during the formation of myofibrillar protein emulsion microgels

pH＞6 的微凝膠在初始階段，以乳液的油滴為核，富集周圍展開(kāi)的蛋白質(zhì)，形成初級(jí)粒子。初級(jí)粒子的數(shù)量和體積分?jǐn)?shù)增加是導(dǎo)致黏度增加的主要原因[4，14]，然后在凝膠溫度附近，多個(gè)初級(jí)粒子聚集形成凝膠核[15]，微粒體積分?jǐn)?shù)下降，導(dǎo)致黏度下降。

而對(duì)于pH 3～5 的微凝膠，低pH 的環(huán)境已經(jīng)使蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致疏水性增加，蛋白質(zhì)已經(jīng)聚集，所以前期黏度沒(méi)有明顯變化。加熱時(shí)弱凝膠開(kāi)始形成，此時(shí)肌球蛋白頭部相互交聯(lián)，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)初步形成，而后在加熱過(guò)程中，凝膠黏度隨溫度升高而降低。加熱至凝膠溫度以上時(shí)，水和蛋白質(zhì)之間的作用被破壞，蛋白質(zhì)發(fā)生進(jìn)一步變性，促進(jìn)了蛋白質(zhì)之間的相互作用，微粒開(kāi)始聚集，形成較大顆粒，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠黏度降低[9]，同時(shí)在剪切的作用下，蛋白質(zhì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)難以形成，最終形成分散的粒子，在降溫冷卻時(shí)，通過(guò)疏水作用、氫鍵等非共價(jià)鍵來(lái)加強(qiáng)微凝膠特性，形成穩(wěn)定的微凝膠顆粒[16]。

2.4.2 振幅掃描不同pH 下乳液微凝膠顆粒樣品的振幅掃描見(jiàn)圖5。所有乳液微凝膠樣品都表現(xiàn)出一定程度的黏彈性，并且在測(cè)試區(qū)域內(nèi)G′大于G″，呈現(xiàn)出固體樣行為，這是顆粒本身的性質(zhì)及不同顆粒之間的相互作用引起的。彈性網(wǎng)絡(luò)是通過(guò)吸附在油滴上的蛋白質(zhì)凝膠層的重疊而產(chǎn)生的，由于空間約束迫使液滴相互接觸[17]。在臨界應(yīng)變下，微凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)開(kāi)始分解，pH 為5 的樣品臨界應(yīng)變最小，為0.3%，此時(shí)pH 接近等電點(diǎn)，顆粒的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)稀疏，結(jié)構(gòu)空隙大，剛性較小，顆粒容易變形，形成的凝膠較弱[18]，且在應(yīng)變?yōu)?0%時(shí)，材料響應(yīng)發(fā)生了變化，由偽固體變?yōu)榱黧w。pH 為3、4 時(shí)臨界應(yīng)變?cè)?%附近，pH 6～9 的線性黏彈區(qū)域比pH 3～5 大，這是由于顆粒具有可變性，即當(dāng)顆粒接觸緊密時(shí)，顆粒間相互作用大，它們會(huì)被壓縮變形，因此有著更大的接觸面積、更大的摩擦力[19]，此時(shí)需要更大的應(yīng)力來(lái)破壞結(jié)構(gòu)。pH 3～5 時(shí)凝膠結(jié)構(gòu)更大、更松散，在較小應(yīng)變下就可以破壞結(jié)構(gòu)，同時(shí)G′也較低。

圖5 不同pH 的肌原纖維蛋白乳液微凝膠線性黏彈區(qū)域Fig.5 Linear viscoelastic region of myofibrillar protein emulsion microgels prepared at different pH values

2.4.3 頻率掃描為了進(jìn)一步探究乳液微凝膠顆粒的力學(xué)性能，在小變形流變學(xué)下對(duì)肌原纖維蛋白乳液微凝膠顆粒進(jìn)行了表征。圖6為不同pH 的乳液微凝膠模量隨角頻率的變化。隨著角頻率的增加，模量也隨之上升，G′和G″均表現(xiàn)出弱頻率依賴性。所有pH 的乳液微凝膠顆粒的G′恒大于G″，并且在頻率掃描范圍內(nèi)G′與G″變化曲線沒(méi)有交點(diǎn)，說(shuō)明加熱過(guò)程中形成了凝膠網(wǎng)絡(luò)。

圖6 不同pH 的肌原纖維蛋白乳液微凝膠頻率掃描圖Fig.6 Frequency dependency of G′ and G″ for myofibrillar protein emulsion microgels prepared at different pH values

蛋白質(zhì)凝膠可以分為3 類：生物聚合物、交聯(lián)凝膠以及非共價(jià)連接凝膠[20]。生物聚合物的頻率依賴性很強(qiáng)，并且在頻率掃描中，G′和G″有交點(diǎn)，這類軟凝膠在低頻率和高頻率下均顯示為流體狀。交聯(lián)凝膠具有永久的共價(jià)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，幾乎沒(méi)有頻率依賴性。非共價(jià)連接凝膠的頻率依賴性較小，G′和G″掃描曲線沒(méi)有交點(diǎn)。

根據(jù)頻率掃描冪律擬合結(jié)果，可以判斷出凝膠的類型[21]。對(duì)G′曲線進(jìn)行冪律擬合，得出不同pH 的乳液微凝膠顆粒的n為0.06～0.11。當(dāng)n為正數(shù)時(shí)，可以判定凝膠為非共價(jià)連接的物理凝膠[22-23]。因此，不同pH 下的乳液微凝膠均為非共價(jià)連接的物理凝膠。

從整體來(lái)看，pH 為6 的微凝膠，G′大于其他pH的微凝膠；而隨著角頻率的增加，pH 為8、9 的微凝膠模量也隨之上升；在pH 為3～5 時(shí)，顆粒的G′與G″較低。pH 為3、4 時(shí)蛋白質(zhì)帶正電，且電勢(shì)值大，強(qiáng)烈的靜電相互作用削弱了凝膠強(qiáng)度。pH 為5 時(shí)處于等電點(diǎn)附近，形成的粒徑較大，多孔結(jié)構(gòu)松散，與水的結(jié)合能力較弱，形成的凝膠較軟。在pH 6～9時(shí)，其模量相對(duì)于其他pH 凝膠的模量更高，因?yàn)閜H 大于pI，靜電斥力增加，初級(jí)粒子聚集的速度下降，蛋白質(zhì)有序成鏈，蛋白質(zhì)形成的結(jié)構(gòu)比較細(xì)致，由此形成剛性更強(qiáng)的微凝膠顆粒，而隨著pH 增加，凝膠模量均低于pH 為6 的凝膠，可能是由于pH 增加，蛋白質(zhì)分子負(fù)凈電荷量提高，分子之間的靜電排斥力增加，限制了蛋白質(zhì)的聚集，導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度降低。

表1 不同pH 條件下肌原纖維蛋白乳液微凝膠頻率掃描的冪律參數(shù)Table 1 Power-Law parameters for frequency sweep of myofibrillar protein emulsion microgels at different pH values

2.4.4 黏度測(cè)定所有pH 條件下的微凝膠都顯示出剪切稀化的特征（見(jiàn)圖7），這是微凝膠顆粒典型的特征。在低剪切速率時(shí)，會(huì)出現(xiàn)剪切增厚的現(xiàn)象，直至出現(xiàn)第一個(gè)峰值，這可能是由于剛開(kāi)始測(cè)量時(shí)產(chǎn)生的瞬態(tài)效應(yīng)[24]，也可能是低剪切速率時(shí)，粒子幾乎不發(fā)生流動(dòng)，粒子間相互作用導(dǎo)致的。而后，隨著剪切速率增加，微凝膠的黏度降低，可能因?yàn)樵诩羟凶饔孟?，粒子產(chǎn)生流動(dòng)，微凝膠顆粒的結(jié)構(gòu)被破壞，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)弱化，導(dǎo)致這些分子在一定程度上被分離出來(lái)[25]，最初的團(tuán)簇被分解成單個(gè)更小的絮凝體，從而降低其流動(dòng)阻力，分子不再具有與以前相同的緊密接觸，最終形成單個(gè)粒子，因此幾乎獨(dú)立地運(yùn)動(dòng)。也可能是懸浮粒子沿著剪切流動(dòng)方向進(jìn)行排列[26]。

圖7 不同pH 條件下肌原纖維蛋白乳液微凝膠黏度隨剪切速率變化Fig.7 Viscosity of myofibrillar protein emulsion microgels varies with the shearing rate at different pH values

對(duì)比不同pH 乳液微凝膠的第一個(gè)峰值，pH 為6 時(shí)黏度最大，為18 400 Pa·s，pH 為3～5 時(shí)黏度明顯比其他低，這與頻率掃描結(jié)果一致。高濃度體系在微尺度上的黏度表現(xiàn)為粒子相互“擠壓”。對(duì)于相同程度的空間填充，聚合粒子越多產(chǎn)生的黏度越高，在這種情況下，黏度更多是由顆粒的變形性和形態(tài)學(xué)驅(qū)動(dòng)的[27]。而整體的黏度還是隨著pH 的增加而增加。在pI 附近，凝膠化過(guò)程分子排斥力減小，在蛋白質(zhì)開(kāi)始排序之前，就已經(jīng)形成了較弱的凝膠結(jié)構(gòu)，更軟的顆粒比更硬的顆粒更易變形、流動(dòng)，所以整體的黏度更低，這種快速聚集使蛋白質(zhì)與水結(jié)合受限。

兩次掃描中的遲滯現(xiàn)象說(shuō)明樣品存在觸變性，觸變行為表示在剪切力作用下，結(jié)構(gòu)強(qiáng)度減弱，在隨后的靜置過(guò)程中，結(jié)構(gòu)或快或慢地恢復(fù)，最終會(huì)完全恢復(fù)。觸變性是由于粒子間的相互作用或者結(jié)構(gòu)的分解破壞引起的。遲滯現(xiàn)象的存在表明了剪切導(dǎo)致相體積的變化，從而致使黏度降低。所有凝膠都存在遲滯現(xiàn)象，遲滯環(huán)面積越小，結(jié)構(gòu)損傷就越小。pH 為6 時(shí)滯后面積最大，這與頻率掃描pH 為6 時(shí)模量最大的結(jié)果相符合。

對(duì)剪切稀化部分進(jìn)行冪律擬合，k為黏度系數(shù)，n為流動(dòng)指數(shù)，k與持水能力成正比，n對(duì)應(yīng)于凝膠的假塑性程度。對(duì)比不同pH 凝膠的k得知，pH 3～5時(shí)持水能力明顯低于pH 6～9，其中pH 為5 的持水能力最差，可能是由于處于等電點(diǎn)，疏水作用增強(qiáng)，形成了失水顆粒。不同pH 乳液微凝膠水結(jié)合能力的差異與凝膠強(qiáng)度的不同有關(guān)，所有微凝膠的n均較小（n＜0.2），體現(xiàn)出非牛頓流體的特征。

2.4.5 剪切恢復(fù)力測(cè)試剪切恢復(fù)力測(cè)試用于評(píng)估樣品結(jié)構(gòu)變形以及回收程度。第一階段，在處理步驟之前，在低剪切速率下，測(cè)量樣品靜止時(shí)的流變特性；第二階段，樣品隨高剪切速率而變形；第三階段，在與第一階段相同的低剪切速率下，測(cè)量樣品的流變特性，根據(jù)間隔時(shí)間確定樣品的結(jié)構(gòu)恢復(fù)率[28]。第三段體現(xiàn)出樣品結(jié)構(gòu)恢復(fù)的速度和樣品結(jié)構(gòu)恢復(fù)程度，當(dāng)剪切速率突然上升或下降時(shí)，隨后的黏度瞬變反映了受控流動(dòng)條件下凝膠結(jié)構(gòu)的變化，在剪切恢復(fù)力測(cè)試下，微凝膠顆粒的流動(dòng)行為符合其微觀結(jié)構(gòu)和黏彈性[29]。

表2 不同pH 下肌原纖維蛋白乳液微凝膠黏度曲線的冪律參數(shù)Table 2 Power-Law parameters for viscosity of myofibrillar protein emulsion microgels at different pH values

第三個(gè)階段中，所有pH 乳液微凝膠的黏度與第一步剪切時(shí)的黏度相比都明顯降低。結(jié)構(gòu)的恢復(fù)有兩個(gè)過(guò)程：蛋白質(zhì)分子黏度快速提升，后逐漸趨于平衡，此時(shí)構(gòu)象重新排列。在一定的時(shí)間內(nèi)，pH為5 時(shí)恢復(fù)能力最好，可能是pH 最接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，顆粒結(jié)構(gòu)相對(duì)來(lái)說(shuō)更大、更松散，顆粒間相互作用弱，在施加剪切的時(shí)候，結(jié)構(gòu)被破壞的少，等剪切撤去時(shí)，未被破壞的結(jié)構(gòu)會(huì)隨時(shí)間而重建，被破壞的結(jié)構(gòu)多，恢復(fù)時(shí)間較長(zhǎng)，恢復(fù)的程度和速率與微凝膠的黏彈性有關(guān)。

2.4.6 時(shí)間掃描由圖9可以得出，不論是高剪切速率還是低剪切速率，不同pH 的乳液微凝膠黏度的變化趨勢(shì)一致。在低剪切速率下，受到的剪切力對(duì)凝膠結(jié)構(gòu)影響不大，蛋白質(zhì)分子能夠快速重組排列，所以黏度達(dá)到平衡所需的時(shí)間少。在高剪切速率下，凝膠受到的剪切力大，凝膠結(jié)構(gòu)一定程度上被破壞，凝膠重新排列需要一定時(shí)間，故黏度趨于平衡的時(shí)間比低剪切速率長(zhǎng)。

圖8 不同pH 下肌原纖維蛋白乳液微凝膠的剪切恢復(fù)力Fig.8 Shear recovery of myofibrillar protein emulsion microgels at different pH values

圖9 不同pH 下肌原纖維蛋白乳液微凝膠在兩種剪切速率下黏度隨時(shí)間的變化Fig.9 Time dependency of viscosity for myofibrillar protein emulsion microgels at different pH values under two different shear rates

3 結(jié) 語(yǔ)

不同pH 條件下加熱處理乳液所形成的乳液微凝膠均為非共價(jià)連接的物理凝膠，呈假塑性流體特征，pH 條件不會(huì)改變?nèi)橐何⒛z的流體類型。在酸性條件下及等電點(diǎn)附近，粒徑明顯大于其他pH 下的乳液微凝膠顆粒。pH 為6 時(shí)球形油滴被肌原纖維蛋白凝膠包封的最好。在低頻率掃描時(shí)，pH 為6時(shí)肌原纖維蛋白乳液微凝膠呈現(xiàn)最高的黏彈性。黏度隨pH 的升高呈現(xiàn)出先減小后增大的趨勢(shì)，pH 為6 時(shí)最高黏度最大，觸變性也最好。在剪切恢復(fù)力測(cè)試中，微凝膠顆粒的結(jié)構(gòu)均有一定程度被破壞，其中pH 為5 時(shí)被破壞程度最小，具有更高的結(jié)構(gòu)恢復(fù)率。