發(fā)酵乳桿菌SS-31培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化

秦雅莉，于福田，趙笑潁，沈圓圓，董詩瑜，劉小玲*，2

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西水牛乳工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530004）

發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）是常見的乳酸菌之一，廣泛存在于各類發(fā)酵制品中，是異型發(fā)酵乳酸菌[1]。美國食品和藥物管理局和歐洲食品安全局均將發(fā)酵乳桿菌評(píng)估為食品用微生物菌種，并且我國也將其列為《可用于食品的菌種名單》。近年來，隨著研究深入，發(fā)酵乳桿菌的功能和益生特性不斷被人們所證實(shí)。眾多研究結(jié)果表明，發(fā)酵乳桿菌在胃腸道中具有高存活率[2]、對(duì)病原體的抗菌活性[3]、調(diào)節(jié)腸道菌群[4]以及抗氧化能力[5]，此外還具有免疫調(diào)節(jié)能力[6]。

乳酸菌廣泛存在于自然界，例如食品、植物、動(dòng)物或人體腸道等多種生活環(huán)境中，是潛在的益生菌。作者所在課題組致力于挖掘柳州酸筍中乳酸菌資源，從酸筍中篩選得到一株具有較強(qiáng)降低RAW264.7 細(xì)胞分泌NO 能力的發(fā)酵乳桿菌SS-31[7]。該菌株具有較強(qiáng)耐酸能力、耐1 g/L 牛膽鹽、耐人工胃腸液以及高黏附性等特性；此外還可以顯著下調(diào)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-6的含量。綜上，該菌株具有優(yōu)良生理特性和抗炎活性。而乳酸菌要在體內(nèi)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，才能產(chǎn)生一定的益生效果。世界衛(wèi)生組織規(guī)定，益生菌食品的益生菌活菌總數(shù)須超過1×107CFU/g 才可以有益生作用。但目前乳酸菌的較低發(fā)酵水平限制了其擴(kuò)大應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)菌株低成本、高效率培養(yǎng)的核心是優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。乳酸菌的生長繁殖需要碳源、氮源、無機(jī)鹽、營養(yǎng)因子等營養(yǎng)物質(zhì)，并且生長過程中需要不斷與外界進(jìn)行物質(zhì)、能量交換，受到外界環(huán)境（溫度、pH 等）影響。與普通培養(yǎng)相比，低成本、高效率的培養(yǎng)既可以更快速提高菌體密度，縮短生產(chǎn)周期，又能降低生產(chǎn)成本[8-9]。呂秀明等通過單因素結(jié)合響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)和流加補(bǔ)料培養(yǎng)優(yōu)化長雙歧桿菌L80培養(yǎng)基，得到活菌數(shù)為1.21×1010CFU/mL[10]。Magdalena 等通過響應(yīng)面法優(yōu)化鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)基，優(yōu)化后菌體密度達(dá)到5 g/L，是相同條件下MRS培養(yǎng)基中菌體密度（1.9 g/L）的2.63 倍[11]。

以發(fā)酵乳桿菌SS-31 為研究對(duì)象，以活菌數(shù)為指標(biāo)，通過單因素、響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最佳培養(yǎng)基成分和含量。然后對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)條件（溫度、接種體積分?jǐn)?shù)、pH）進(jìn)行優(yōu)化，最后將優(yōu)化得到的最佳條件應(yīng)用于15 L 發(fā)酵罐，篩選中和劑以進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌低成本、高效率的發(fā)酵培養(yǎng)方式，并為開發(fā)以乳酸菌作為主要成分的功能性食品，以及使飼料中益生菌達(dá)到相應(yīng)數(shù)量的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

發(fā)酵乳桿菌SS-31（L.fermentumSS-31）：分離自酸筍發(fā)酵液，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.24925。

MRS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：每1 L 含葡萄糖20 g、胰蛋白胨20 g、磷酸氫二鉀0.9 g、硫酸錳0.50 g、硫酸鎂1.00 g、吐溫80 1.00 g，調(diào)節(jié)pH 至6.5，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 主要試劑

葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、蛋白胨、牛肉浸粉、牛肉胨、胰蛋白胨（均為生物試劑）：上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、檸檬酸銨、醋酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂、碳酸銨、氨水、碳酸鈉（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

15 L 發(fā)酵罐：上海寶興生物設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品；GI80TW 立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器：致微儀器有限公司產(chǎn)品；DZKW-D-1 電熱恒溫水浴鍋：北京市光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-2F 潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SQP 電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Sherlock 微生物計(jì)數(shù)儀：美國MIDI 公司產(chǎn)品；DW25-560 恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；SUNRISE 酶標(biāo)儀：帝肯（上海）貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵乳桿菌增殖培養(yǎng)基成分的優(yōu)化以平板涂布法測定的活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在MRS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，替換培養(yǎng)基中碳源，添加量為20 g/L，探究不同種類碳源（葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖）對(duì)發(fā)酵乳桿菌SS-31 生長的影響，篩選出最佳碳源。以蛋白胨、牛肉浸粉、牛肉胨、胰蛋白胨為氮源，替換上述已優(yōu)化培養(yǎng)基中的氮源，以20 g/L 為添加量，篩選得到最優(yōu)氮源。同樣以磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、檸檬酸銨、醋酸鈉為無機(jī)鹽，添加量為9 g/L，篩選出最優(yōu)無機(jī)鹽，以確定最佳增殖培養(yǎng)基成分。

1.4.2 發(fā)酵乳桿菌增殖培養(yǎng)基成分質(zhì)量濃度的優(yōu)化以平板涂布法測定的活菌數(shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在上述最佳增殖培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇碳源的添加量為5、10、15、20、25、30 g/L，探究其最適添加量。選取上述最適碳源添加量，設(shè)置氮源添加量為5、10、15、20、25、30 g/L，確定其最適添加量。選取最佳碳源和氮源添加量，設(shè)置無機(jī)鹽添加量為3、5、7、9、11、13 g/L，確定其最適添加量。

1.4.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵乳桿菌增殖培養(yǎng)基選擇上述最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。碳源質(zhì)量濃度為10、15、20 g/L；氮源質(zhì)量濃度為15、20、25 g/L，無機(jī)鹽質(zhì)量濃度為7、9、11 g/L，采用三因素三水平（見表1），應(yīng)用Design-Expert V 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化出增殖培養(yǎng)基最佳配方。

表1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Box-Behnken design test factors and levels

1.4.4 發(fā)酵乳桿菌SS-31 高密度培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1）接種體積分?jǐn)?shù)的選擇 將已活化3 代后的發(fā)酵乳桿菌SS-31 37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，按接種體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%，分別接種于增殖培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始pH 為6.8，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，測定其活菌數(shù)，確定菌體最佳接種體積分?jǐn)?shù)。

2）初始pH 的選擇 調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基初始pH為5.8、6.3、6.8、7.3、7.8，按最佳接種體積分?jǐn)?shù)接種于增殖培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定其活菌數(shù)，確定增殖培養(yǎng)基最佳初始pH。

3）溫度的選擇 調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基初始pH 至最佳，按最佳接種體積分?jǐn)?shù)接種于增殖培養(yǎng)基中，分別置于31、34、37、40、43 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，測定其活菌數(shù)，確定最佳培養(yǎng)溫度。

4）中和劑的選擇 為了更快測定菌體濃度，選用OD600為指標(biāo)反映菌體濃度。選擇常用的Na2CO3溶液和氨水為中和劑，質(zhì)量濃度均為20 g/L，通過流加中和劑維持培養(yǎng)基pH 為6.8±0.02，以不流加中和劑作空白對(duì)照，每隔3 h 測定OD600，并利用平板記數(shù)法測定24 h 活菌數(shù)。利用15 L 全自動(dòng)發(fā)酵罐，按最終確定的培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵并比較兩種中和劑對(duì)發(fā)酵乳桿菌SS-31 高密度培養(yǎng)的影響。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。顯著性（P＜0.05）分析使用Duncan 檢驗(yàn)。使用Origin 9.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分的確定

為了篩選出最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽，以MRS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用平板涂布法測定活菌數(shù)，以確定最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽，結(jié)果見圖1。在葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖4 種碳源中，麥芽糖是L.fermentumSS-31 生長繁殖的最佳碳源，此時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值1.64×109CFU/mL，而碳源為葡萄糖的MRS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中活菌數(shù)僅為4.67×108CFU/mL。孫媛媛分析了7 種碳源對(duì)異型發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1 生長的影響，發(fā)現(xiàn)其對(duì)單糖（葡萄糖）利用率最高[12]。張興昌等發(fā)現(xiàn)以雙糖 （蔗糖） 作為碳源時(shí)，Lactobacillus fermentumF6 菌體密度顯著高于其他碳源[13]。但在該實(shí)驗(yàn)中，L.fermentumSS-31 對(duì)麥芽糖的利用程度顯著高于其他碳源，說明不同菌株對(duì)碳源的利用有差異。

由圖1（b）可知，在胰蛋白胨、牛肉胨、蛋白胨和酵母浸粉4 種氮源中，酵母浸粉是菌體生長繁殖的最佳氮源，此時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值3.21×109CFU/mL。洪梅等對(duì)發(fā)酵乳桿菌BLF01 研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)酵母粉作為氮源時(shí)，獲得的活菌數(shù)更高[14]。Gao 等發(fā)現(xiàn)酵母粉作為發(fā)酵乳桿菌的氮源時(shí)，對(duì)其菌體生長具有顯著促進(jìn)作用[15]，這也與該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相同。由于酵母浸粉中富含多種氨基酸，還含有較高的尼克酸、葉酸、鈷胺酸，且它們在中、酸性環(huán)境中對(duì)熱穩(wěn)定[16]，所以酵母浸粉對(duì)L.fermentumSS-31 生長有顯著促進(jìn)作用。

由圖1（c）可知，在磷酸氫二鉀、檸檬酸銨、醋酸鈉、磷酸二氫鉀4 種無機(jī)鹽中，磷酸氫二鉀是最適無機(jī)鹽，此時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值3.05×109CFU/mL。無機(jī)鹽在一定范圍內(nèi)可中和菌體在生長過程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，并且參與細(xì)胞的合成代謝，調(diào)節(jié)滲透壓穩(wěn)定[17]。呂佳璐等研究4 種無機(jī)鹽對(duì)干酪乳桿菌YQ336 生長的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)磷酸氫二鉀最適宜該菌株的增殖培養(yǎng)[18]，這與該實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

圖1 不同碳源、氮源、無機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵乳桿菌SS-31 生長的影響Fig.1 Effects of different carbon sources,nitrogen sources and inorganic salts on the growth of L.fermentum SS-31

2.2 碳源、氮源、無機(jī)鹽質(zhì)量濃度的確定

探究了不同質(zhì)量濃度麥芽糖、酵母浸粉、磷酸氫二鉀對(duì)發(fā)酵乳桿菌SS-31 活菌數(shù)的影響，結(jié)果見圖2。碳源質(zhì)量濃度對(duì)乳酸菌生長起到關(guān)鍵作用，隨著麥芽糖由5 g/L 提高到25 g/L，L.fermentumSS-31活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在15 g/L 時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值4.92×109CFU/mL。糖質(zhì)量濃度過高時(shí)，菌株前期大量增殖生長，發(fā)酵產(chǎn)生大量酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基環(huán)境偏酸性化，抑制菌株的生長代謝。因此選擇15 g/L 作為麥芽糖的最適添加量。

氮源為菌體生長代謝提供必要元素，富含氨基酸、無機(jī)鹽和維生素。從圖2（b）可知，隨著酵母浸粉由5 g/L 提高到25 g/L，L.fermentumSS-31 活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在添加量為20 g/L時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值5.87×109CFU/mL。前人研究認(rèn)為[19]氮源質(zhì)量濃度過低時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不足，導(dǎo)致菌體生長緩慢；氮源質(zhì)量濃度過高時(shí)，菌體生長過快，導(dǎo)致菌體老化、自溶[20]。因此選擇20 g/L作為酵母浸粉的最適添加量。

無機(jī)鹽也是菌體生長代謝的重要因素，能夠構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)以及調(diào)節(jié)滲透壓。從圖2（c）可知，隨著磷酸氫二鉀由1 g/L 提高到11 g/L，活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在9 g/L 時(shí)，L.fermentumSS-31活菌數(shù)達(dá)到最大值5.47×109CFU/mL。由于乳酸菌在生長代謝過程中分解糖類產(chǎn)生大量乳酸，隨著時(shí)間延長，乳酸大量堆積導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)pH 下降，乳酸菌生長受到抑制。無機(jī)鹽可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，中和過量的酸，促進(jìn)菌體的生長，并為其生長補(bǔ)充微量元素。因此選擇9 g/L 作為磷酸氫二鉀的最適添加量。

圖2 不同質(zhì)量濃度麥芽糖、酵母浸粉、磷酸氫二鉀對(duì)發(fā)酵乳桿菌SS-31 生長的影響Fig.2 Effects of different concentrations of maltose,yeast extract powder and potassium hydrogen phosphate on the growth of L.fermentum SS-31

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 10.0 軟件對(duì)麥芽糖質(zhì)量濃度（A）、酵母浸粉質(zhì)量濃度（B）、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度（C）設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

通過對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次項(xiàng)擬合，以L.fermentumSS-31 活菌數(shù)作為響應(yīng)值，對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到回歸方程：活菌數(shù)（×109CFU/mL）=6.920+0.559A-0.014B+0.532C+0.786AB+0.636AC-0.467BC-1.440A2-1.534B2-2.028C2。

表2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and its experimental results

由表3可知模型P＜0.000 1，表明該模型建立成功；失擬項(xiàng)為0.148 6，大于0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著；模型的R2=0.977 0，Radj2=0.947 5，說明預(yù)測值和實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)性高，可以解釋94.75%的響應(yīng)值變化。該模型變異系數(shù)（0.73%）小，具有較高精確度。綜上，該回歸模型可對(duì)L.fermentumSS-31 在培養(yǎng)基的生長情況進(jìn)行有效分析和預(yù)測。3 個(gè)因素交互作用的響應(yīng)曲面及等高線見圖3。

表3 RSM 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of RSM regression model

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

回歸模型得出Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的最優(yōu)結(jié)果見表4。在麥芽糖16.20 g/L、酵母浸粉20.16 g/L、磷酸氫二鉀9.33 g/L 時(shí)，在此優(yōu)化條件下的活菌數(shù)預(yù)測值為7.03×109CFU/mL。為了驗(yàn)證模型所得優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性，依照優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行培養(yǎng)基的配制及發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測定24 h 時(shí)L.fermentumSS-31 的活菌數(shù)，3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值為6.51×109CFU/mL，和模型預(yù)測值接近，驗(yàn)證了此模型的準(zhǔn)確性。

表4 Box-Benhnken 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與結(jié)果Table 4 Box-Benhnken verification experiments and results

楊瑞冬等對(duì)Lactobacillus buchneriIMAU80233培養(yǎng)基中碳源、氮源、無機(jī)鹽體系進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，后經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化后，菌體活菌數(shù)僅有3.81×109CFU/mL，約為優(yōu)化前的1.59 倍[21]；李納對(duì)鼠李糖乳桿菌RG2 培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化后，活菌數(shù)達(dá)到7.1×109CFU/mL，是未優(yōu)化前活菌數(shù)的7 倍[22]；高志敏采用正交法結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化Lactobacillus fermentumIMAU 10129 的培養(yǎng)基，優(yōu)化后活菌數(shù)為4.21×109CFU/mL，為優(yōu)化前活菌數(shù)的6 倍[23]。而在該實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)化后L.fermentumSS-31活菌數(shù)為6.51×109CFU/mL，是優(yōu)化前MRS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基活菌數(shù)（4.67×108CFU/mL）的13.94 倍，活菌數(shù)提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)，高于目前文獻(xiàn)已報(bào)道的活菌數(shù)水平，說明效果較好。

2.5 高密度培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.5.1 接種體積分?jǐn)?shù)的選擇菌體接種體積分?jǐn)?shù)的多少通常影響其生長到穩(wěn)定期的時(shí)間以及濃度[24]。作者探究了不同接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)L.fermentumSS-31活菌數(shù)的影響，結(jié)果見圖4。在接種體積分?jǐn)?shù)為1%～5%時(shí)，L.fermentumSS-31 的活菌數(shù)隨接種體積分?jǐn)?shù)升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在接種體積分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值6.83×109CFU/mL。這可能是初始接種體積分?jǐn)?shù)過大，菌體大量繁殖消耗更多營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致后期培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不足，從而呈現(xiàn)下降趨勢。綜上，選擇3%為L.fermentumSS-31 的接種體積分?jǐn)?shù)。

圖4 接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)發(fā)酵乳桿菌SS-31 生長的影響Fig.4 Effects of inoculum on the growth of L.fermentum SS-31

2.5.2 初始pH 的選擇乳酸菌的最適生長pH 一般為5.0～7.0，不同種類乳酸菌有不同的最適生長pH。作者探究了不同初始pH 對(duì)L.fermentumSS-31活菌數(shù)的影響，結(jié)果見圖5。隨著初始pH 的增加，L.fermentumSS-31 的活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在pH 為6.8 時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值7.30×109CFU/mL。在過酸的環(huán)境下，會(huì)破壞細(xì)胞膜滲透壓平衡和干擾細(xì)胞內(nèi)外酶的活性，限制乳酸菌的生長；當(dāng)pH 過高時(shí)，也不利于其生長[25-26]。綜上，選擇pH 6.8 為初始pH。

圖5 初始pH 對(duì)發(fā)酵乳桿菌SS-31 生長的影響Fig.5 Effects of initial pH on the growth of L.fermentum SS-31

2.5.3 溫度的選擇溫度的變化對(duì)乳酸菌的影響較大，溫度過高或過低均不利于其生長繁殖。作者探究了不同溫度對(duì)L.fermentumSS-31 活菌數(shù)的影響，結(jié)果見圖6。隨著溫度升高，L.fermentumSS-31的活菌數(shù)呈現(xiàn)顯著增加后降低的趨勢，在溫度為37 ℃時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大值8.15×109CFU/mL。這可能因?yàn)樵诘蜏貤l件下菌體失活，高溫使其酶失活，從而影響其生長速度。綜上，選擇37 ℃為發(fā)酵乳桿菌SS-31 的最佳培養(yǎng)溫度。

圖6 溫度對(duì)發(fā)酵乳桿菌SS-31 生長的影響Fig.6 Effects of temperature on the growth of L.fermentum SS-31

2.5.4 中和劑的選擇分批培養(yǎng)菌體時(shí)，抑制菌體生長的主要原因是菌體自身代謝會(huì)產(chǎn)生較多的有機(jī)酸，大量有機(jī)酸的累積會(huì)形成酸抑制，從而使菌體生長較為緩慢。但是通過在發(fā)酵過程中加入中和劑調(diào)節(jié)pH，保持恒定pH 則可以解除酸抑制[27-28]。作者利用15 L 發(fā)酵罐探究了不同中和劑對(duì)L.fermentumSS-31 活菌數(shù)的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 中和劑對(duì)發(fā)酵乳桿菌SS-31 生長的影響Fig.7 Effects of neutralizer type on the growth of L.fermentum SS-31

如圖7所示，與未添加中和劑組相比，當(dāng)添加碳酸鈉和氨水，使發(fā)酵液pH 恒定為6.8 后，L.fermentumSS-31 菌液OD600顯著增加（P＜0.05）；但氨水和碳酸鈉作為中和劑時(shí)，二者對(duì)L.fermentumSS-31 生長的影響無顯著性差異 （P＞0.05）。氨水作為中和劑時(shí)，既可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)的pH，又可以為菌體生長提供氮源，用量比碳酸鈉少，且氨水較為廉價(jià)，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。因此，選用氨水作為L.fermentumSS-31 高密度培養(yǎng)的中和劑，此時(shí)37 ℃培養(yǎng)24 h 后活菌數(shù)達(dá)到1.19×1010CFU/mL。

另外，孫媛媛對(duì)發(fā)酵乳桿菌FXJCJ6-1 最適生長pH 進(jìn)行研究，結(jié)果顯示在pH 恒定為6.0 并分批培養(yǎng)時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到9.5×109CFU/mL，較初始MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)（1.7×109CFU/mL）提高了4.6 倍[27]；李江等對(duì)發(fā)酵乳桿菌L1 高密度培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示通過流加中和劑NaOH，維持恒定pH，較分批培養(yǎng)時(shí)的活菌數(shù)（1.55×1010CFU/mL）顯著提高18.52 倍[29]；聶黔麗等采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵乳桿菌LF-8001 進(jìn)行高密度培養(yǎng)優(yōu)化后，活菌數(shù)達(dá)到了1.08×1010CFU/mL，提高了5.32 倍[24]。作者對(duì)L.fermentumSS-31 進(jìn)行培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后，活菌數(shù)達(dá)到1.19×1010CFU/mL，相比優(yōu)化前活菌數(shù)（4.67×108CFU/mL）提高了25.48 倍，活菌數(shù)提升了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，高于目前大部分已報(bào)道的活菌數(shù)水平，說明效果良好。

3 結(jié) 語

實(shí)現(xiàn)乳酸菌高密度培養(yǎng)的核心是發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，作者以活菌數(shù)為指標(biāo)，通過對(duì)L.fermentiumSS-31 發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，最終確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：麥芽糖16.20 g/L、酵母浸粉20.16 g/L、磷酸氫二鉀9.33 g/L、硫酸錳0.50 g/L、硫酸鎂1.00 g/L、吐溫80 1.00 g/L；最佳發(fā)酵條件為：接種體積分?jǐn)?shù)3%、初始pH 6.8，期間添加氨水保持發(fā)酵液pH 穩(wěn)定，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，活菌數(shù)可達(dá)到1.19×1010CFU/mL，是優(yōu)化前4.67×108CFU/mL 的25.48 倍。發(fā)酵乳桿菌SS-31 菌體濃度顯著提高，為今后大規(guī)模短期快速生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。