啶蟲(chóng)脒分子印跡熒光傳感器的構(gòu)建及檢測(cè)研究

毛家洛，韓奕奕，王 震，王勝潔，魏子奇，曹 慧，袁 敏，葉 泰，徐 斐*

（1.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093；2.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201708；3.上海皓信生物科技有限公司，上海 201100）

啶蟲(chóng)脒（acetamiprid）是一種新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，由于其具有高效、低毒、殺蟲(chóng)譜廣、用量低、內(nèi)吸傳導(dǎo)性好、與常規(guī)農(nóng)藥無(wú)交互抗性等化學(xué)及生物特性，已被用來(lái)替代有機(jī)磷、有機(jī)氯等常規(guī)高毒農(nóng)藥用于果蔬等農(nóng)產(chǎn)品中。啶蟲(chóng)脒通過(guò)食物鏈在體內(nèi)長(zhǎng)期累積，可能對(duì)身體造成極大的危害[1]，因此我國(guó)出臺(tái)了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蔬菜中的啶蟲(chóng)脒殘留進(jìn)行限量規(guī)定。根據(jù)國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)（GB2763—2021）：啶蟲(chóng)脒在冬瓜、大白菜以及番茄等果蔬中的殘留限量為0.2～1.0 mg/kg。因此亟待開(kāi)發(fā)高靈敏度的啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)[2]。

分子印跡聚合物具有高度的選擇性，不僅可以從復(fù)雜食品基質(zhì)中特異性的富集痕量目標(biāo)物，還具有耐高溫高壓、耐酸堿、不易被破壞且能重復(fù)使用等優(yōu)良特性，因而已被廣泛應(yīng)用于待測(cè)樣品中目標(biāo)物的選擇性富集和檢測(cè)[3]。Boontongto 等使用磁性雙模板印跡聚合物對(duì)果蔬中的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行富集，回收率為81.3%～110.6%[4]；Immaferrer 等以特丁嗪為模板合成了一系列分子印跡聚合物，這些聚合物對(duì)6 種氯三嗪農(nóng)藥的回收率達(dá)到80%，進(jìn)一步結(jié)合LC-DAD 技術(shù)，能夠?qū)Νh(huán)境樣品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行高效檢測(cè)[5]；Zhao 等結(jié)合分子印跡技術(shù)和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了黃瓜樣品中的20 種三唑類(lèi)農(nóng)藥，檢出限小于0.4 μg/L，可用于農(nóng)產(chǎn)品中三唑類(lèi)農(nóng)藥的定量分析[6]。這些方法雖然具有較高的靈敏度，但需要配備氣相色譜、高效液相色譜以及氣/液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/LC-MS）[4]等大型分析儀器，存在儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜及對(duì)樣品前處理要求高等不足。

鑭系金屬有機(jī)框架（LMOF）[7]、量子點(diǎn)[8]、發(fā)光染料[9]等熒光材料已被作為信號(hào)探針包埋于印跡聚合物基質(zhì)中，以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜食品樣品中痕量目標(biāo)物的定量速測(cè)。在這些標(biāo)記物中，量子點(diǎn)熒光探針因具有高效的發(fā)光性能、可協(xié)調(diào)的激發(fā)光譜、高度的靈敏性以及優(yōu)秀的抗光漂白特性，已受到廣泛關(guān)注[10]。程序森等將碳量子點(diǎn)包埋于制備的分子印跡聚合物中，并應(yīng)用于蜂蜜中甲硝唑的檢測(cè)，在最優(yōu)條件下，檢出限低至7.2 nmol/L，樣品的加標(biāo)回收率為92.3%～95.1%[11]；趙曉磊等使用碳量子點(diǎn)制備的分子印跡材料對(duì)多巴胺展現(xiàn)出了高靈敏的響應(yīng)，該方法的線性范圍為0.02～0.30 mg/L，檢出限為0.01 mg/L，實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為76.7%～118.4%，且可應(yīng)用于復(fù)雜樣品中多巴胺的定量分析[12]?；诖?，以啶蟲(chóng)脒為模板分子，并結(jié)合分子印跡聚合材料的專(zhuān)一性、構(gòu)效預(yù)定性和廣泛適用性，以及改性硅碳量子點(diǎn)的高度靈敏性，采用改進(jìn)的溶膠-凝膠策略制備了啶蟲(chóng)脒分子印跡熒光傳感器，同時(shí)對(duì)該傳感器的檢測(cè)性能及機(jī)理進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；RF-6000 熒光分光光度計(jì)：日本島津儀器公司產(chǎn)品；特氟龍高壓反應(yīng)釜：鄭州博科儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；K-Alpha X 射線光電子能譜儀、FEI Inspect F50 掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；PerkinElmer 傅里葉紅外變換光譜儀：珀金埃爾默儀器有限公司產(chǎn)品；FLS1000 熒光壽命測(cè)定儀：英國(guó)愛(ài)丁堡儀器公司產(chǎn)品。

啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪、噻蟲(chóng)胺（均為標(biāo)準(zhǔn)樣品）：上海市農(nóng)藥研究所提供；二苯基二乙氧基硅烷（DPDS） 、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES） 、硅酸四乙酯（TEOS）、環(huán)己烷、正己醇、曲拉通、無(wú)水乙醇（均為分析純）：阿拉丁化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；氨水、檸檬酸三鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 啶蟲(chóng)脒分子印跡熒光傳感器的制備及表征

1.2.1 硅碳量子點(diǎn)（SiCDs）的合成將0.4 g 檸檬酸三鈉置于兩頸燒瓶中，加入8 mL 去離子水溶解，脫氣15 min；向上述溶液中加入2.0 mL APTES，攪拌10 min 后轉(zhuǎn)移至50 mL 特氟龍高壓反應(yīng)釜中，并在200 ℃下反應(yīng)2 h；反應(yīng)完畢后將反應(yīng)溶液冷卻至室溫，再用透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量1 000）透析24 h，得到藍(lán)色的硅碳量子點(diǎn)；收集量子點(diǎn)，并置于4 ℃冰箱下保存。

1.2.2 啶蟲(chóng)脒分子印跡熒光傳感器（SiCDs@MIPs）的制備二氧化硅納米微球的合成[13]：在磁力攪拌下將5 mL Triton X-100、20 mL 環(huán)己烷和5 mL 正己醇混合，劇烈攪拌15 min；接下來(lái)依次將50 μL TEOS 和135 μL NH3·H2O（體積分?jǐn)?shù)25%～28%）添加到上述混合液中，攪拌8 h；向反應(yīng)體系加入20 mL 丙酮破乳，用無(wú)水乙醇和超純水洗滌幾次后，避光置于60 ℃真空干燥箱內(nèi)干燥，備用。

SiCDs@MIPs 的制備[14]：將30 mg 二氧化硅納米微球分散于20 mL 無(wú)水乙醇和7.5 mL 水中，再加入13 mg 啶蟲(chóng)脒、27 μL APTES 和31 μL DPDS，攪拌20 min 后，依次加入1 mL 0.2 mol/L CTAB 溶液、50 μL TEOS、100 μL 0.2 mol/L NaOH 溶液和SiCDs，并在室溫黑暗下磁力攪拌12 h；反應(yīng)完畢后采用乙腈和乙醇混合液（體積比2∶8）洗脫模板，直至無(wú)啶蟲(chóng)脒紫外吸收峰出現(xiàn)，然后將獲得的SiCDs@MIPs在60 ℃下烘干，備用。SiCDs@NIPs 的制備過(guò)程與SiCDs@MIPs 一致，只是不加入啶蟲(chóng)脒模板。制備原理見(jiàn)圖1。

圖1 基于SiCDs 的分子印跡熒光傳感器制備原理圖Fig.1 Schematic diagram of preparation of molecularly imprinted fluorescence sensor based on SiCDs

1.2.3 SiCDs@MIPs 的表征采用TEM 透射電鏡、X 射線光電子譜（XPS）、SEM 掃描電子顯微鏡及傅里葉紅外光譜對(duì)制備的SiCDs@MIPs 表面形態(tài)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.3 SiCDs@MIPs 對(duì)啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)過(guò)程及檢測(cè)性能評(píng)價(jià)

1.3.1 檢測(cè)過(guò)程將10.0 mg SiCDs@MIPs 分散于30 mL 超純水中，超聲處理5 min；取600 μL 超聲分散后的SiCDs@MIPs 與300 μL 啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥進(jìn)行混合，漩渦振蕩反應(yīng)20 min；反應(yīng)完畢后在345 nm激發(fā)波長(zhǎng)下記錄反應(yīng)溶液在437 nm 處的相對(duì)熒光強(qiáng)度。猝滅率（C）的計(jì)算公式為C=（F0-F）/F0×100%，其中F和F0分別代表加入和不加入啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥時(shí)SiCDs@MIPs 的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.3.2 熒光穩(wěn)定性評(píng)價(jià)將10 mg SiCDs@MIPs 超聲分散于30 mL 超純水中，并在437 nm 處每隔10 min 測(cè)定一次加入與不加入啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥（1.0 μg/mL）時(shí)SiCDs@MIPs 的相對(duì)熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以F0/F表示。

1.3.3 選擇性與特異性評(píng)價(jià)將 10 mg SiCDs@MIPs 或SiCDs@NIPs 超聲分散于30 mL 超純水中，分別取600 μL 的1 μg/mL 啶蟲(chóng)脒、吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)胺和噻蟲(chóng)嗪進(jìn)行反應(yīng)，以考察SiCDs@MIPs的選擇性和特異性。

1.4 樣品處理

將5.00 g 攪碎后的蔬菜樣品置于50 mL 離心管中，加標(biāo)靜置30 min，再加入6 mL 乙腈（含體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸）進(jìn)行振蕩提取3 min；在離心管中加入5.00 g MgSO4和0.50 g NaCl 固體，渦旋振蕩120 s 后，加入300 mg GCB、300 mg PSA 和300 mg C18，并劇烈振蕩3 min；取上清液加入600 μL 氯仿進(jìn)行液液微萃取，并將下層有機(jī)相置于玻璃試管中，于80 ℃水浴中蒸干，再用200 μL 水復(fù)溶；在處理好的樣液中加入SiCDs@MIPs，并按照1.3 中的步驟進(jìn)行熒光測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 SiCDs@MIPs 的表征

采用X 射線光電子譜對(duì)SiCDs@MIPs 進(jìn)行表征。圖2中清晰地顯示了N1s（399 eV）、C1s（285 eV）、O1s（532 eV）和Si2p（103 eV）的信號(hào)峰，表明模板分子和功能單體APTES 在交聯(lián)劑TEOS 的作用下發(fā)生了溶膠-凝膠反應(yīng)，并形成了二氧化硅印跡層。在1 080 eV 和165 eV 處出現(xiàn)的Na1s 和S2p 的信號(hào)峰則證明了SiCDs 已經(jīng)被成功包裹到印跡聚合物中。

圖2 SiCDs@MIPs 的XPS 圖Fig.2 XPS spectra of SiCDs@MIPs

采用傅里葉紅外光譜對(duì)SiCDs@MIPs 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。由圖3可見(jiàn)，在794.78、3 186.82 cm-1和1 561.22 cm-1處出現(xiàn)的峰分別歸因于Si—O 的伸縮振動(dòng)、N—H 的伸縮振動(dòng)和Si—O—Si 的不對(duì)稱拉伸振動(dòng)，表明啶蟲(chóng)脒分子印跡熒光探針已被成功合成。

圖3 SiCDs@MIPs 的FT-IR 圖Fig.3 FT-IR spectra of SiCDs@MIPs

采用掃描電子顯微鏡和透射電鏡對(duì)SiCDs@MIPs 的形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。由圖4（a）可見(jiàn)，合成的SiCDs@MIPs 微球大小均一且外表面較粗糙。由圖4（b）可見(jiàn)，SiCDs@MIPs 呈現(xiàn)出典型的核殼結(jié)構(gòu)，中間的黑色部分為二氧化硅納米核，外殼的淺色部分為印跡層。結(jié)果均表明，SiCDs@MIPs 微球已經(jīng)被成功合成。

圖4 SiCDs@MIPs 的形貌結(jié)構(gòu)Fig.4 Morphological structure of SiCDs@MIPs

2.2 SiCDs@MIPs 制備條件的優(yōu)化

2.2.1 模板與功能單體的物質(zhì)的量比優(yōu)化為了提高聚合物的識(shí)別性能，采用APTES 和DPDS 作為雙功能單體，并考察了模板與功能單體物質(zhì)的量比對(duì)SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響。由圖5可見(jiàn)，隨著功能單體與模板物質(zhì)的量比的增加，F(xiàn)0/F呈先增加后減小的趨勢(shì)，這是因?yàn)楫?dāng)功能單體的添加量不足時(shí)，導(dǎo)致分子印跡聚合物中形成較少的空穴位點(diǎn)，進(jìn)而降低了檢測(cè)的靈敏性。當(dāng)啶蟲(chóng)脒與功能單體的物質(zhì)的量比為1∶4 時(shí)，F(xiàn)0/F達(dá)到最高，為1.33。隨著功能單體添加量的進(jìn)一步增加，F(xiàn)0/F反而下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)量的功能單體導(dǎo)致自身發(fā)生交聯(lián)，使得傳質(zhì)困難[15]。因此，啶蟲(chóng)脒與功能單體的最適物質(zhì)的量比選擇為1∶4。

圖5 模板與功能單體物質(zhì)的量比對(duì)SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響Fig.5 Effect of the ratio of template to functional monomers on the fluorescence quenching of SiCDs@MIPs

2.2.2 交聯(lián)劑添加量的優(yōu)化進(jìn)一步考察了交聯(lián)劑TEOS 的添加量（25、50、100、150 μL）對(duì)SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響。由圖6可知，當(dāng)TEOS 的添加量為25 μL 時(shí)，F(xiàn)0/F達(dá)到最大，為1.43。當(dāng)TEOS 的添加量小于25 μL 時(shí)難以形成印跡層，而過(guò)量的TEOS 則可能導(dǎo)致過(guò)厚的印跡層，使啶蟲(chóng)脒不易接觸到包裹在印跡層內(nèi)部的量子點(diǎn)，進(jìn)而影響檢測(cè)的靈敏度[16]。因而，TEOS 的最優(yōu)加入量確定為25 μL。

圖6 TEOS 添加量對(duì)SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響Fig.6 Effect of the amount of TEOS on the fluorescence quenching of SiCDs@MIPs

2.2.3 SiCDs 包埋量的優(yōu)化SiCDs 在SiCDs@MIPs中的包埋量也會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度，因而，考察了SiCDs 的包埋量對(duì)SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響。由圖7可知，當(dāng)SiCDs 的包埋量為10 mg/kg 時(shí)，F(xiàn)0/F最大。隨著SiCDs 包埋量的增加，F(xiàn)0/F顯著降低。這是因?yàn)楫?dāng)SiCDs 在SiCDs@MIPs 中的包埋量較高時(shí)，需要將SiCDs@MIPs 稀釋至合適的熒光值才能進(jìn)行檢測(cè)，稀釋后的SiCDs@MIPs 對(duì)啶蟲(chóng)脒的吸附量也降低，因而影響了檢測(cè)的靈敏度。

圖7 SiCDs 包埋量對(duì)SiCDs@MIPs 熒光猝滅的影響Fig.7 Effect of the embedding amount of SiCDs on the fluorescence quenching of SiCDs@MIPs

2.3 SiCDs@MIPs 對(duì)啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥檢測(cè)性能的評(píng)價(jià)

在最優(yōu)條件下，對(duì)SiCDs@MIPs 的檢測(cè)性能進(jìn)行了研究。由圖8（a）可知，在0～4.5 μmol/L 時(shí)，隨著啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥濃度的逐漸增加，SiCDs@MIPs 的相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸降低。進(jìn)一步以F0/F為縱坐標(biāo)，啶蟲(chóng)脒濃度為橫坐標(biāo)繪制熒光猝滅曲線圖（見(jiàn)圖8（b））。如圖8（c）所示，范圍為0.045～0.450 μmol/L 時(shí)，F(xiàn)0/F與啶蟲(chóng)脒濃度呈線性關(guān)系y=0.445 6x+1.109 5 （r2=0.989），檢出限根據(jù)3Sb與K比值（Sb是空白標(biāo)準(zhǔn)偏差，K是校準(zhǔn)曲線的斜率）計(jì)算為0.086 μmol/L。

圖8 SiCDs@MIPs 對(duì)不同濃度啶蟲(chóng)脒響應(yīng)的熒光圖譜和猝滅線性曲線圖Fig.8 Fluorescence spectra and fluorescence quenching linear curve of SiCDs@MIPs in response to acetamiprid at different concentrations

進(jìn)一步將啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥加入SiCDs@MIPs 中，每隔10 min 測(cè)定一次其在437 nm 處的相對(duì)熒光強(qiáng)度，以評(píng)價(jià)其檢測(cè)穩(wěn)定性。由圖9（a）所示，在120 min 內(nèi)F0/F較為穩(wěn)定，表明SiCDs@MIPs 具有良好的檢測(cè)穩(wěn)定性。進(jìn)一步選取啶蟲(chóng)脒的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物噻蟲(chóng)嗪、吡蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)胺來(lái)驗(yàn)證所建立方法的特異性。由圖9（b）可知，啶蟲(chóng)脒對(duì)SiCDs@MIPs 的猝滅響應(yīng)最強(qiáng)，這是因?yàn)猷はx(chóng)脒可以通過(guò)氫鍵特異性結(jié)合到SiCDs@MIPs 的印跡空腔中，進(jìn)而通過(guò)光致電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致其部分熒光猝滅。噻蟲(chóng)嗪、噻蟲(chóng)胺與啶蟲(chóng)脒具有相似的分子結(jié)構(gòu)，因而也有一小部分通過(guò)氫鍵吸附到SiCDs@MIPs 中，造成其MIPs 和NIPs 之間的響應(yīng)差異，但這些結(jié)構(gòu)類(lèi)似物對(duì)SiCDs@MIPs 的猝滅響應(yīng)均較弱。Yu 等研究也發(fā)現(xiàn)，由于結(jié)構(gòu)的高度相似，噻蟲(chóng)嗪和噻蟲(chóng)胺對(duì)啶蟲(chóng)脒的印跡聚合物會(huì)表現(xiàn)出一定的響應(yīng)效果[17]。

圖9 SiCDs@MIPs 的熒光穩(wěn)定性以及選擇特異性Fig.9 Fluorescence stability and selective specificity of SiCDs@MIPs

2.4 啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥對(duì)SiCDs@MIPs 的猝滅機(jī)理研究

為了探究啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥對(duì)SiCDs@MIPs 的猝滅機(jī)理，首先采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定了啶蟲(chóng)脒的紫外吸收峰，結(jié)果見(jiàn)圖10。其出峰位置在245 nm 左右，這與SiCDs@MIPs 的熒光激發(fā)峰和發(fā)射峰都不重疊，因此可以排除熒光共振能量轉(zhuǎn)移和內(nèi)濾作用[18-19]。進(jìn)一步以時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制SiCDs@MIPs 的熒光衰減曲線圖。由圖11可知，SiCDs 的熒光壽命為5.335 ns，當(dāng)加入啶蟲(chóng)脒后，SiCDs 的熒光壽命降至4.972 ns，表明啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥使SiCDs 發(fā)生了動(dòng)態(tài)電子轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致其熒光猝滅。

圖10 啶蟲(chóng)脒的紫外吸收和SiCDs 的熒光發(fā)射圖Fig.10 Ultraviolet absorbance spectrum of acetamiprid and fluorescent emission diagram of SiCDs

圖11 SiCDs 的熒光衰減曲線Fig.11 Fluorescence decay curve of SiCDs

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

將制備的SiCDs@MIPs 應(yīng)用于白菜、冬瓜和番茄中啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)，以驗(yàn)證其在實(shí)際樣品中應(yīng)用的可行性。由表1可知，SiCDs@MIPs 對(duì)不同加標(biāo)樣品中啶蟲(chóng)脒的回收率為73.0%～109.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）為1.21%～7.49%，表明SiCDs@MIPs 可應(yīng)用于蔬菜中啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥的測(cè)定。

表1 SiCDs@MIPs 對(duì)蔬菜樣品中啶蟲(chóng)脒的加標(biāo)回收驗(yàn)證（n=3）Table 1 Standard recovery of acetamiprid in the vegetable samples by SiCDs@MIPs（n=3）

3 結(jié) 語(yǔ)

結(jié)合熒光量子點(diǎn)技術(shù)和分子印跡技術(shù)，采用改進(jìn)的溶膠-凝膠策略制備了可應(yīng)用于實(shí)際樣品中啶蟲(chóng)脒檢測(cè)的分子印跡熒光傳感器SiCDs@MIPs。SiCDs@MIPs 表現(xiàn)出典型的核殼結(jié)構(gòu)，較薄的印跡層可加速模板分子在其中的傳質(zhì)效率。在最優(yōu)檢測(cè)條件下，SiCDs@MIPs 對(duì)啶蟲(chóng)脒的檢出限為0.086 μmol/L，線性范圍為0.045～0.450 μmol/L，相關(guān)系數(shù)為0.989，檢測(cè)時(shí)間僅需25 min，回收率可達(dá)到73.0%～109.0%，能夠滿足對(duì)蔬菜中啶蟲(chóng)脒農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求。