柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌的多樣性及功能分析

牛營(yíng)超， 崔立星， 丁 露， 戴小華，2， 郭青云，2

(1.贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院潛葉昆蟲研究組，江西贛州 341000； 2.國(guó)家臍橙工程技術(shù)研究中心，江西贛州 341000)

昆蟲中腸是昆蟲進(jìn)行食物消化吸收的重要場(chǎng)所，棲息于中腸的微生物與寄主昆蟲協(xié)同進(jìn)化、互惠共生，對(duì)昆蟲的生命活動(dòng)具有重要的影響[1-2]。中腸微生物的群落結(jié)構(gòu)和代謝活動(dòng)不僅受到宿主昆蟲中腸微環(huán)境的影響，還在宿主的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫反應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)代謝、抵御病害和農(nóng)藥抗性等方面發(fā)揮著重要作用[1，3-5]。16S rRNA基因文庫(kù)技術(shù)和Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)極大地推動(dòng)了昆蟲腸道微生物領(lǐng)域的研究。目前，昆蟲中腸細(xì)菌多樣性的研究主要集中在鱗翅目、鞘翅目、等翅目和膜翅目等昆蟲中，已經(jīng)取得不少進(jìn)展，其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的種類因昆蟲種類而異[6]。

柑橘潛葉甲(PodagricomelanigricollisChen)隸屬于鞘翅目(Coleoptera)葉甲科(Chrysomelidae)，是潛食性柑橘害蟲，主要分布在我國(guó)南部柑橘產(chǎn)地[7]。柑橘潛葉甲于每年4月上中旬孵化成幼蟲潛入柑橘類植物葉片中，取食葉片的幼嫩組織，僅留下葉片的上下表皮細(xì)胞，且具有轉(zhuǎn)潛道行為，大量暴發(fā)時(shí)會(huì)嚴(yán)重降低葉片的光合作用，進(jìn)而影響柑橘的產(chǎn)量，造成經(jīng)濟(jì)損失[8]。柑橘潛葉甲幼蟲，因其潛食在葉片內(nèi)，藥物很難直接接觸蟲體，防治較為困難。近年來(lái)有大量報(bào)道顯示，腸道微生物可能作為防治害蟲的新型靶標(biāo)，研究者已在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出新的防控技術(shù)。目前，柑橘潛葉甲的研究主要集中在形態(tài)、生理生化和防治上，有關(guān)腸道微生物的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究選擇枳葉片上的柑橘潛葉甲幼蟲為研究對(duì)象，基于16S rRNA基因的高通量測(cè)序技術(shù)研究柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌的種類組成及多樣性，以期為該害蟲的防治提供新策略。同時(shí)，本研究利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法從柑橘潛葉甲幼蟲中腸中分離細(xì)菌，以期為未來(lái)利用生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證柑橘潛葉甲幼蟲中腸微生物的功能提供菌株材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)ハx為2021年4月在江西省龍南市柑橘園采集的柑橘潛葉甲幼蟲，寄主為枳[Poncirustrifoliata(L.) Raf.]。

1.2 柑橘潛葉甲幼蟲中腸的分離及總基因組DNA的提取

取40頭柑橘潛葉甲幼蟲，饑餓處理48 h后在無(wú)菌環(huán)境下用75%乙醇對(duì)幼蟲體表進(jìn)行3 min的消毒，用無(wú)菌水清洗幼蟲體表的乙醇3次，使用無(wú)菌鑷子和眼剪將幼蟲中腸取出，置于無(wú)菌的1.5 mL EP管內(nèi)，10頭蟲的中腸為1個(gè)重復(fù)，共設(shè)3個(gè)重復(fù)[9]。用Mag-Bind Soil DNA extraction kit(Omega)試劑盒提取柑橘潛葉甲幼蟲腸道細(xì)菌總DNA，將檢測(cè)合格的樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌16S rRNA基因的高通量測(cè)序

以提取的腸道總基因組為模板，采用通用引物338F(5′-A C T C C T A C G G G A G G C A G C A-3′)、806R(5′-G G A C T A C H V G G G T W T C T A A T-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)[10]。50 μL PCR擴(kuò)增體系如下：2 μL基因組DNA模板，0.5 μL TaKaRa LATaqDNA Polymerase，5 μL 10×Buffer，上、下游引物(10 mmol/L)各1 μL，4 μL dNTPs(各2.5 mmol/L)，36.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)重復(fù)3次。將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，濃度和特異性合格后送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行雙端測(cè)序(使用Illumina HiSeq 2500平臺(tái))。

1.4 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)用QIIME2(2019年4月)的qiime cutadapt trim-paired切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列[11-12]；通過(guò)調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體，得到有效序列[13]。用USEARCH(v 7.0.1090)軟件在97%的相似度下進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，并用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)擴(kuò)增獲得的柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌16S rRNA序列進(jìn)行物種注釋[14]。用PICRUSt2 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析柑橘潛葉甲幼蟲中腸菌群在第1、2級(jí)功能通路水平上的豐度，預(yù)測(cè)菌群對(duì)宿主的潛在功能[15]。

1.5 柑橘潛葉甲幼蟲中腸可培養(yǎng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)

取10頭柑橘潛葉甲幼蟲，參照“1.2”節(jié)的方法取出中腸，置于滅菌的1.5 mL EP管內(nèi)，加入 100 μL 無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，用滅過(guò)菌的研磨棒將中腸研磨至勻漿狀，將研磨好的勻漿用無(wú)菌水稀釋至10-1～10-6。取稀釋度為10-4、10-5、10-6的3個(gè)勻漿溶液均勻涂抹至LB培養(yǎng)基(分別稱取10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl、20 g瓊脂，用蒸餾水定容至1 L，pH值為7.0)上進(jìn)行分離培養(yǎng)，各稀釋度重復(fù)3次。將平板于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d。通過(guò)觀察菌落的顏色、大小和形態(tài)分離純化單菌落，經(jīng)多次純化，得到純單克隆菌株，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 柑橘潛葉甲幼蟲中腸可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rRNA基因擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

用TIANamp Bacteria DNA Kit(DP-302)提取細(xì)菌總DNA。采用細(xì)菌通用引物27F(A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G)、1492 R(C G G T T A C C T T G T T A C G A C)擴(kuò)增16S rRNA基因[16]。50 μL PCR反應(yīng)體系：1 μL 基因組DNA，上、下游引物(10 mmol/L)各 2 μL，25 μL PrimeSTAR MAX DNA聚合酶，20 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增結(jié)束后用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，切取目標(biāo)DNA條帶，用Omega D2500-02 Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化后測(cè)序。將所獲序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源比對(duì)[17]，選取各個(gè)菌株的近緣序列，采用最大似然(ML)算法，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用bootstrap驗(yàn)證進(jìn)化樹的可靠性[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果和OTU聚類分析

通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序，共得到219 003條柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌的原始序列，通過(guò)質(zhì)控拼接，共得到203 864條優(yōu)質(zhì)序列，序列的平均長(zhǎng)度為425 bp。基于97%的相似水平，柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌通過(guò)聚類分析共獲得550個(gè)OTU，隸屬于11門、21綱、42目、71科、99屬。

2.2 柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌的種類組成與豐度

基于OTU的分類結(jié)果，分別從門、綱、目、科、屬5種不同分類等級(jí)上對(duì)柑橘潛葉甲幼蟲中腸菌群種類和相對(duì)豐度進(jìn)行分析。由圖1可以看出，在門分類水平上，注釋到的優(yōu)勢(shì)菌有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、埃普西隆桿菌門(Epsilonbacteraeota)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、Patescibacteria等，其中以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，相對(duì)豐度占比分別為90.83%、4.80%、2.30%和1.04%。

在綱分類水平上，柑橘潛葉甲幼蟲中腸菌群由γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、梭菌綱(Clostridia)、放線菌綱(Actinobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、丹毒絲菌綱(Erysipelotrichia)、異常球菌綱(Deinococci)、β-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、OLB14等21個(gè)綱組成。其中γ-變形菌綱、α-變形菌綱是優(yōu)勢(shì)菌，占比分別為73.71%、16.97%。

在目分類水平上，柑橘潛葉甲幼蟲中腸菌群由腸桿菌目(Enterobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、海螺菌目(Oceanospirillales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、伯克氏菌目(Betaproteobacteriales)、梭菌目(Clostridiales)、黃色單胞菌目(Xanthomonadales)、微球菌目(Micrococcales)、柄桿菌目(Caulobacterales)、丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)等42個(gè)目組成。其中主要的優(yōu)勢(shì)菌群是腸桿菌目，相對(duì)豐度占比為53.59%，而根瘤菌目、海螺菌目和假單胞菌目次之，相對(duì)豐度占比分別為15.52%、9.28%和5.49%。

在科分類水平上，柑橘潛葉甲幼蟲中腸菌群隸屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、德沃斯氏菌科(Devosiaceae)、鹽單胞菌科(Halomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、單胞菌科(Xanthomonadaceae)、丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)、生絲單胞菌科(Hyphomonadaceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)等71個(gè)科。其中主要的優(yōu)勢(shì)菌是腸桿菌科，相對(duì)豐度占比為53.59%，其次是德沃斯氏菌科、鹽單胞菌科、根瘤菌科、假單胞菌科，相對(duì)豐度分別為9.73%、9.28%、5.52%、5.14%。

在屬分類水平上，柑橘潛葉甲幼蟲中腸菌群主要由沙雷氏菌屬(Serratia)、Pelagibacterium、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)、Rosenbergiella、Ralstonia等99個(gè)屬組成。其中優(yōu)勢(shì)菌群為沙雷氏菌屬、Pelagibacterium、嗜鹽單胞菌屬、假單胞菌屬，相對(duì)豐度占比分別為45.52%、9.73%、9.28%、5.14%。

2.3 柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌功能分析

利用PICRUSt2預(yù)測(cè)柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌在KEGG第1、2分類層次功能通路的豐度，其中第1分類層次功能通路有6種，分別為代謝(80.67%)、遺傳信息處理(10.03%)、細(xì)胞過(guò)程(4.98%)、環(huán)境信息處理(3.8%)、生物體系統(tǒng)(0.33%)和人類疾病(0.19%)(圖2)。由于代謝功能通路對(duì)應(yīng)的豐度占比是一級(jí)通路豐度占比的4倍，因此預(yù)測(cè)柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌的主要功能是代謝。柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌代謝功能的二級(jí)通路共有28種(圖2)。各二級(jí)通路在全部樣本中的占比如下：糖類代謝占14.36%，氨基酸代謝占12.85%，輔助因子和維生素代謝占11.76%，萜類和多酮代謝占8.10%，生物降解和代謝占7.70%，其他氨基酸代謝占7.68%，脂質(zhì)代謝占6.58%，能量代謝占5.13%，細(xì)胞活性占3.21%，糖類生物合成和代謝占2.84%，其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成占2.06%。預(yù)測(cè)柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌的功能是代謝體內(nèi)各種物質(zhì)，主要參與糖類、氨基酸和維生素的代謝，同時(shí)次要參與外源化學(xué)物質(zhì)、萜類和多酮類化合物的降解。

2.4 柑橘潛葉甲幼蟲中腸可培養(yǎng)細(xì)菌的分離和鑒定

從LB固體培養(yǎng)基中共分離得到5株形狀有差異的細(xì)菌菌落，分別編號(hào)為PN1、PN2、PN3、PN4、PN5。菌落形態(tài)均為圓形且邊緣整齊，其中PN2、PN4為濕潤(rùn)光滑的乳白色菌落，PN1、PN2、PN5為小的白色菌落。將從柑橘潛葉甲幼蟲中腸中分離的5株可培養(yǎng)細(xì)菌用通用引物進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，測(cè)序后將序列上傳至GenBank。將得到的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析序列的同源性，并構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明，PN2、PN4菌株與沙雷氏菌(Serratia)的親緣關(guān)系最近，聚為1支，鑒定為沙雷氏菌(圖3-A)。PN1、PN3和PN5菌株與不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)的親緣關(guān)系最近，聚為1支，鑒定為不動(dòng)桿菌。從可培養(yǎng)微生物數(shù)量來(lái)看，以沙雷氏菌為優(yōu)勢(shì)菌(圖3-B)。

3 討論與結(jié)論

本研究基于16S rRNA和Illumina MiSeq開(kāi)展了潛食性害蟲柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌多樣性組成分析，共注釋到11門、21綱、42目、71科、99屬。柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌主要以變形菌門(91%)、厚壁菌門(5%)、放線菌門(2%)和擬桿菌門(1%)為主。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲的腸道共生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門雖然存在各式差異，但是變形菌門細(xì)菌是腸道的主要菌群之一[19]。如Cui等發(fā)現(xiàn)，潛食性昆蟲黃黑趾鐵甲(Dactylispaxanthospila)成蟲腸道細(xì)菌主要分為30門、64綱、135目、207科、369屬，其中以變形菌門(92%)、擬桿菌門(3.4%)和厚壁菌門(2.5%)為優(yōu)勢(shì)菌群[9]。張某等研究發(fā)現(xiàn)，專性寄生內(nèi)食性昆蟲澤蘭實(shí)蠅(Procecidocharesutilis)幼蟲腸道細(xì)菌注釋到13門、4綱、6目、7科、10屬，其中變形菌門細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌群(99%)[20]。陳宏健等研究發(fā)現(xiàn)，鞘翅目昆蟲松墨天牛(Monochamusalternatus)成蟲中腸細(xì)菌主要分為22門、48綱、112目、172科、285屬，其中變形菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌群(93%)[21]。

在屬分類水平上，柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌以沙雷氏菌屬為優(yōu)勢(shì)屬(45.52%)，該屬細(xì)菌在許多昆蟲腸道中作為優(yōu)勢(shì)菌存在，能夠幫助宿主昆蟲高效降解纖維素、單萜或雙萜等物質(zhì)[22-23]。在已有的其他鞘翅目昆蟲研究中，昆蟲腸道優(yōu)勢(shì)菌屬存在物種、蟲態(tài)差異，如黃黑趾鐵甲成蟲腸道細(xì)菌以腸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬[9]；國(guó)內(nèi)室內(nèi)飼養(yǎng)的松墨天牛的成蟲中腸細(xì)菌以沙雷氏菌屬為優(yōu)勢(shì)屬，室外成蟲腸道細(xì)菌以腸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬[21]；寄生于櫟屬的象甲腸道細(xì)菌以假單胞菌屬為主[24]。腸桿菌屬、沙雷氏菌屬屬于腸桿菌科變形菌門細(xì)菌，普遍存在于動(dòng)物腸道中，主要在纖維素、碳水化合物等代謝中起作用[25]。

本研究利用傳統(tǒng)微生物學(xué)分離法對(duì)柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)沙雷氏菌為優(yōu)勢(shì)菌，其次是不動(dòng)桿菌，與16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果一致。沙雷氏菌作為條件致病菌，在很多昆蟲如小菜蛾、黃粉蟲、椰心葉甲等腸道中被離體培養(yǎng)分離出來(lái)[26-28]，該類細(xì)菌可能長(zhǎng)期參與昆蟲的共進(jìn)化并對(duì)昆蟲的生命活動(dòng)有重要作用。不動(dòng)桿菌具有協(xié)助宿主消化食物和轉(zhuǎn)化氮素的功能，該類菌也在蜜蜂、斜紋夜蛾和褐飛虱腸道中分離培養(yǎng)出來(lái)[29-31]。柑橘潛葉甲幼蟲主要潛食在柑橘類植物葉片里，以葉肉為食，腸道菌群可能受到柑橘植物與土壤微生物的影響，其影響程度和相關(guān)性還需進(jìn)一步通過(guò)其他試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。這些優(yōu)勢(shì)腸道細(xì)菌的功能值得我們關(guān)注和研究，以期能發(fā)掘出與柑橘潛葉甲潛食性相關(guān)的腸道細(xì)菌或特定基因，用于該類害蟲的綜合防控。

昆蟲腸道菌群多樣性豐富，許多菌群與宿主昆蟲之間相互依賴、協(xié)同進(jìn)化[2]，影響著昆蟲的生命活動(dòng)。本研究還利用PICRUSt2預(yù)測(cè)柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌的潛在功能，結(jié)果顯示，柑橘潛葉甲幼蟲中腸細(xì)菌有80%執(zhí)行代謝功能，主要通過(guò)代謝碳水化合物和氨基酸等為寄主提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也有參與對(duì)外源化學(xué)物質(zhì)、萜類和多酮類化合物及其他次生代謝物質(zhì)的降解功能，同時(shí)腸道菌群也參與宿主遺傳信息處理過(guò)程。研究結(jié)果表明，柑橘潛葉甲腸道細(xì)菌多樣性豐富，多數(shù)菌群不僅參與了營(yíng)養(yǎng)代謝，還可能幫助宿主昆蟲解毒。該研究結(jié)果有利于了解內(nèi)食性潛葉昆蟲的生命活動(dòng)過(guò)程，為今后進(jìn)一步研究和利用腸道微生物開(kāi)發(fā)新型防控技術(shù)提供基礎(chǔ)。