DNA分子檢測(cè)技術(shù)定量評(píng)估捕食性天敵對(duì)棉蚜的控害功能

王冬梅，潘洪生，李海強(qiáng)，丁瑞豐，阿克旦·吾外士，劉 建，李號(hào)賓

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】害蟲(chóng)防治的對(duì)策主要集中在有害生物綜合防治與害蟲(chóng)生態(tài)調(diào)控[1]。充分利用自然天敵對(duì)害蟲(chóng)的控制作用受到越來(lái)越多的關(guān)注[2-4]。運(yùn)用以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA檢測(cè)技術(shù)研究昆蟲(chóng)的捕食作用，基于分子檢測(cè)的結(jié)果，為自然界中復(fù)雜的種間捕食關(guān)系提供參考依據(jù)，同時(shí)為田間天敵控害作用提供科學(xué)的證據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自然天敵對(duì)害蟲(chóng)控制作用的評(píng)估方法主要包括田間系統(tǒng)調(diào)查、直接觀察法、標(biāo)記法等，傳統(tǒng)方法只是定性研究，很難定量評(píng)價(jià)天敵與害蟲(chóng)的捕食關(guān)系[5]。在綠盲蝽(Apolyguslucorum)體內(nèi)成功檢測(cè)到棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)的DNA片段[6]；步甲等捕食性天敵對(duì)麥蚜[7]、鞍癭蚊(Haplodiplosismarginata)[8]具有捕食作用；異色瓢蟲(chóng)(Harmoniaaxyridis)、草蛉、東亞小花蝽(Oriussauteri)等捕食性天敵中腸大豆蚜(Aphisglycines)的檢出率與大豆蚜的種群密度呈顯著正相關(guān)[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】瓢蟲(chóng)、草蛉和食蚜蠅等是新疆棉田的主要捕食性天敵，發(fā)生數(shù)量多、時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)蚜蟲(chóng)、粉虱、螨類等害蟲(chóng)具有很好的控制作用[10]。目前，利用DNA分子檢測(cè)技術(shù)定量評(píng)價(jià)新疆棉田捕食性天敵的控害作用報(bào)道較少[11]。需定量評(píng)價(jià)新疆棉田重要捕食性天敵對(duì)棉蚜的控害作用。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】運(yùn)用DNA分子檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定棉田和苜蓿條帶捕食性天敵對(duì)蚜蟲(chóng)的檢出率，評(píng)價(jià)捕食性天敵的控害作用及鄰近棉田苜蓿條帶對(duì)捕食性天敵的保育作用。

1 材料與方法

1.1 材 料

2019～2021年，中棉所73號(hào)種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院西部農(nóng)業(yè)研究中心(44°15′37″，87°20′12″)，播種日期為每年的4月中旬，種植密度、水肥、縮節(jié)胺化控等管理采用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理技術(shù)，共種植3個(gè)棉花小區(qū)。在棉花旁邊種植寬度為2 m的苜蓿條帶。整個(gè)生長(zhǎng)季棉田和苜蓿條帶均不施用任何化學(xué)農(nóng)藥。

多異瓢蟲(chóng)(Hippodamiavariegata)、方斑瓢蟲(chóng)(Propylaeaquatuordecimpunctata)、菱斑巧瓢蟲(chóng)(Oenopiaconglobata)、七星瓢蟲(chóng)(Coccinellaseptempunctata)成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)、草蛉類幼蟲(chóng)、食蚜蠅類等捕食性天敵均采自種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院西部農(nóng)業(yè)研究中心的棉田和苜蓿條帶，單頭采集并立即放入裝有無(wú)水乙醇的1.5 mL離心管中，用Parafilm膜封口后放置于-20℃低溫冰箱保存，用于DNA分子檢測(cè)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

每年5月下旬至8月中旬，采用斜線式5點(diǎn)取樣法，每隔7 d對(duì)每個(gè)小區(qū)中棉蚜種群數(shù)量進(jìn)行調(diào)查，每點(diǎn)調(diào)查10株棉花，每個(gè)小區(qū)合計(jì)調(diào)查50株棉花。

1.2.2 分子檢測(cè)

不同捕食性天敵中腸DNA提取采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明。反應(yīng)體系為20 μL，其中10×EasyTaqBuffer 2.0 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1.6 μL，上游引物(20 μm)0.3 μL，下游引物(20 μm)0.3 μL，EasyTaq(5 units/μL)0.2 μL，ddH2O 14.6 μL，DNA 模板 1 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30s，退火30s，72℃延伸 1 min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。在含有EB(0.5 μg/mL)的瓊脂糖凝膠(1.0%)上進(jìn)行電泳檢測(cè)，180 V電壓電泳20 min，電泳緩沖液為0.5×TBE。以標(biāo)準(zhǔn)分子量100 bp DNA Ladder作為參照物檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。表1

表1 棉蚜和三葉草彩斑蚜的引物序列和退火溫度

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003和SPSS 16.0對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中棉蚜種群動(dòng)態(tài)與捕食性天敵中腸棉蚜檢出率間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉蚜種群動(dòng)態(tài)與捕食性天敵中腸檢出率間的相關(guān)性

研究表明，2019年，棉蚜種群數(shù)量6月底至7月初呈緩慢的上升過(guò)程，7月中旬后快速增長(zhǎng)，于7月22日達(dá)到最高值，隨后迅速下降；捕食性天敵中腸棉蚜檢出率從采樣開(kāi)始一直持續(xù)上升，7月22日達(dá)到最大值，然后緩慢下降，7月29日后快速下降。棉蚜種群數(shù)量與其在捕食性天敵中腸的檢出率間密切相關(guān)，回歸方程為Y=0.026 8X+26.282，其中P<0.000 1，R2=0.848 7，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.921。圖1

2021年，棉蚜種群數(shù)量6月底開(kāi)始逐漸上升，至7月14日達(dá)到最高值，隨后逐漸下降；捕食性天敵中腸棉蚜檢出率從采樣開(kāi)始一直持續(xù)上升，至7月14日達(dá)到最高值，隨后緩慢下降，于8月初略有上升，然后緩慢下降。棉蚜種群數(shù)量與其在捕食性天敵中腸的檢出率間密切相關(guān)，回歸方程為Y=0.002 1X+33.811，其中P=0.001，R2=0.703 8，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.839。圖2

圖1 棉蚜種群數(shù)量與捕食性天敵中腸檢出率的動(dòng)態(tài)變化(2019年)

圖2 棉蚜種群數(shù)量與捕食性天敵中腸檢出率的動(dòng)態(tài)變化(2021年)

2.2 棉田優(yōu)勢(shì)捕食性天敵中腸棉蚜檢出率變化

研究表明，瓢蟲(chóng)類幼蟲(chóng)取食棉蚜數(shù)量較多，2019～2021年棉蚜檢出率分別為65.71%和59.02%，成蟲(chóng)中多異瓢蟲(chóng)取食棉蚜數(shù)量較多，檢出率分別為61.06%和50.24%；對(duì)于草蛉類幼蟲(chóng)，棉蚜檢出率分別為56.03%和48.95%，多異瓢蟲(chóng)是新疆棉田優(yōu)勢(shì)捕食性天敵。捕食性天敵中腸棉蚜的檢出率2019年和2021年分別為60.26%和48.32%，捕食性天敵對(duì)棉蚜控制的貢獻(xiàn)度較大。表2

表2 不同捕食性天敵中腸棉蚜的檢出率

2.3 棉蚜和三葉草彩斑蚜在捕食性天敵中腸的檢出率變化

研究表明，6月棉蚜未檢出，7月和8月棉蚜檢出率分別為21.10 %和38.71 %，呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而三葉草彩斑蚜在6月和7月的檢出率分別是52.50 %和73.70 %，呈上升趨勢(shì)，8月檢出率為27.95 %；對(duì)采自棉田的捕食性瓢蟲(chóng)進(jìn)行分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)棉蚜在6月檢出率為18.11%，7月檢出率達(dá)75.52 %，直線上升，到8月下降，檢出率為49.53 %，而三葉草彩斑蚜在6月檢出率高達(dá)92.12 %，7月和8月呈直線下降分別是29.60 %和5.61 %。棉蚜未發(fā)生或數(shù)量較少時(shí)，瓢蟲(chóng)以苜蓿條帶中的三葉草彩斑蚜為主，當(dāng)棉蚜發(fā)生時(shí)，瓢蟲(chóng)的取食以棲息生境的蚜蟲(chóng)種類為主。表3

表3 棉蚜和三葉草彩斑蚜在捕食性天敵中腸的檢出率

3 討 論

新疆棉田中有多種害蟲(chóng)的天敵，如瓢蟲(chóng)、草蛉、食蚜蠅、寄生蜂等，對(duì)蚜蟲(chóng)種群起到有效控制[12]。研究中，捕食性天敵的檢出率與棉蚜的種群數(shù)量具有顯著相關(guān)性，在害蟲(chóng)的生物防治中起主導(dǎo)作用。

新疆棉田常見(jiàn)的捕食性瓢蟲(chóng)主要有多異瓢蟲(chóng)、方斑瓢蟲(chóng)、菱斑巧瓢蟲(chóng)等[10]。多異瓢蟲(chóng)在棉田發(fā)生時(shí)間早、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、數(shù)量豐富、適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)棉蚜具有較強(qiáng)的控制作用[13-15]。研究以不同捕食性天敵中腸中棉蚜的檢出率做定量分析表明多異瓢蟲(chóng)為新疆棉田優(yōu)勢(shì)種，與上述結(jié)果一致。而且，在天敵樣品采集時(shí)也發(fā)現(xiàn)多異瓢蟲(chóng)在蚜蟲(chóng)發(fā)生期均可采集到，方斑瓢蟲(chóng)、菱斑巧瓢蟲(chóng)和七星瓢蟲(chóng)僅在7月中旬前采集到。

農(nóng)田生境對(duì)天敵的生長(zhǎng)發(fā)育、種群繁殖及其對(duì)害蟲(chóng)的控制能力等都有重要影響[16]。可以為天敵提供花粉、花蜜等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[17]，也可以為天敵提供取食棲息場(chǎng)所，如巨斑食蚜瓢蟲(chóng)(Coleomegillamaculata)喜歡在鐵莧菜(Acalyphaostryaefolia)上產(chǎn)卵，而孵化出的幼蟲(chóng)從鐵莧菜轉(zhuǎn)移到玉米上，促進(jìn)了玉米上瓢蟲(chóng)的種群發(fā)生，來(lái)控制玉米上的害蟲(chóng)[18]。呂昭智等[19]、李雪玲等[20]、羅延亮等[21]通過(guò)田間調(diào)查也明確了棉田邊緣雜草帶對(duì)棉田天敵的保育作用。運(yùn)用DNA分子檢測(cè)技術(shù)，對(duì)采自苜蓿條帶和棉田瓢蟲(chóng)對(duì)不同蚜蟲(chóng)的取食，當(dāng)棉蚜尚未發(fā)生或數(shù)量較少時(shí)，捕食性瓢蟲(chóng)主要在苜蓿條帶取食三葉草彩斑蚜，以獲取食物，苜蓿對(duì)瓢蟲(chóng)早期的繁育具有保護(hù)作用。

瓢蟲(chóng)又是一種多食性捕食天敵，可捕食多種獵物，當(dāng)多種獵物共存時(shí)，瓢蟲(chóng)對(duì)獵物，無(wú)明顯的捕食偏好性。在研究七星瓢蟲(chóng)對(duì)松大蚜(Cinarapintabulaeformis)和棉蚜的選擇效應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)七星瓢蟲(chóng)對(duì)棉蚜和松大蚜沒(méi)有明顯的捕食偏好，主要取決于2種蚜蟲(chóng)的種群數(shù)量[22]。異色瓢蟲(chóng)對(duì)蘋(píng)果綿蚜(Eriosomalanigerm)和繡線菊蚜(Aphiscitricola)的捕食偏好性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在2種蚜蟲(chóng)為低密度時(shí)，異色瓢蟲(chóng)對(duì)兩種蚜蟲(chóng)均未表現(xiàn)出偏好性，而在2種蚜蟲(chóng)處于高密度時(shí)，異色瓢蟲(chóng)對(duì)繡線菊蚜表現(xiàn)出偏好性[23]。在棉蚜發(fā)生后，瓢蟲(chóng)在棉田取食棉蚜，部分仍取食三葉草彩斑蚜，瓢蟲(chóng)的取食還是主要以棲息生境的蚜蟲(chóng)種類為主，未表現(xiàn)出明顯的偏好性。

刈割棉田邊的苜蓿，可有效利用天敵防治棉蚜[24]，2021年試驗(yàn)表明，在6月中旬苜蓿刈割前，來(lái)自苜蓿條帶的瓢蟲(chóng)檢測(cè)到取食三葉草彩斑蚜，而未檢測(cè)到棉蚜，來(lái)自棉田的瓢蟲(chóng)分別可以檢測(cè)到三葉草彩斑蚜和棉蚜。而在苜蓿刈割后，棉田的瓢蟲(chóng)檢測(cè)不到三葉草彩斑蚜。為有效利用棉田周邊生境中的天敵，要適時(shí)鏟除棉田周邊雜草。

DNA分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，為天敵與害蟲(chóng)捕食關(guān)系的評(píng)價(jià)和分析提供了技術(shù)支撐，但DNA分子檢測(cè)技術(shù)也有其缺點(diǎn)[25]。在實(shí)際應(yīng)用中需要運(yùn)用多種方法，以獲得較為完整的信息，科學(xué)評(píng)價(jià)天敵與害蟲(chóng)捕食關(guān)系。

4 結(jié) 論

采用田間種群系統(tǒng)調(diào)查棉蚜種群數(shù)量和DNA分子檢測(cè)技術(shù)定量分析，棉田棉蚜種群數(shù)量動(dòng)態(tài)和捕食性天敵中腸棉蚜的檢出率密切相關(guān)；2019年和2021年，Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.921和0.839，比較以不同捕食性天敵對(duì)棉蚜的檢出率定量分析，2019年和2021年瓢蟲(chóng)類幼蟲(chóng)取食棉蚜檢出率分別為65.71%和59.02%，多異瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)取食棉蚜檢出率分別為61.06%和50.24%，多異瓢蟲(chóng)為新疆棉田優(yōu)勢(shì)捕食性天敵；當(dāng)棉蚜種群未發(fā)生或數(shù)量較少時(shí)，捕食性瓢蟲(chóng)以取食苜蓿條帶中的三葉草彩斑蚜為主，當(dāng)棉蚜和三葉草彩斑蚜同時(shí)發(fā)生時(shí)，捕食性瓢蟲(chóng)以取食棲息生境的蚜蟲(chóng)種類為主。利用DNA分子檢測(cè)技術(shù)可以定量評(píng)估捕食性天敵對(duì)棉蚜的控害功能作用。鄰近棉田邊緣的苜蓿條帶可以為捕食性天敵提供替代食物，對(duì)其具有重要的保育作用。

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