EGFR對宮頸癌SiHa細胞調(diào)控作用機制的體外研究*

熱依蘭木·買賽地，韓莉莉

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，烏魯木齊 830001)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在全球女性惡性腫瘤中均處于第四位[1]。宮頸癌的致病因素已明確，通過篩查可早期發(fā)現(xiàn)癌前病變，但我國宮頸癌篩查尚未廣泛普及[2]，大部分病例就診時已處于晚期，術(shù)后復發(fā)率也較高。中晚期宮頸癌的標準治療方案是以放射治療聯(lián)合以順鉑為基礎(chǔ)的同步化學療法為主[3]，但腫瘤細胞耐藥性阻礙了疾病的治療，造成晚期宮頸癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)。因此，制定宮頸癌個體化治療方案，克服化療耐藥性，研究開發(fā)作用于特定靶點的高選擇性的新型抗癌藥物已成為宮頸癌研究的熱點[4]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)作為肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的抗腫瘤藥物的靶基因，其在宮頸癌中的機制也成為研究熱點[5]。本研究對EGFR在宮頸癌中的作用及其機制進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 宮頸癌SiHa細胞株(上海中喬新舟生物科技有限公司)，微量移液器、超凈工作臺(蘇州集團安泰空氣技術(shù)有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO)，低速離心機(Eppendorf)，酶標儀(Thermo)，細胞培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)瓶(Corning)，小鼠單抗EGFR(160kD)。武漢俊杰JT-12J電腦生物組織脫水機，德國Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機，日本羽毛R35一次性刀片，武漢俊杰JK-6生物組織攤烤片機，載玻片及蓋玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)，抗原修復用電陶爐(SKG)，奧林巴斯BX53型生物顯微鏡，包埋機(武漢俊杰JB-P5)，無水乙醇、二甲苯、蘇木素、包埋石蠟、中性樹膠均來自國藥集團。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 宮頸癌SiHa置于DMEM+10%FBS+1%(Penicillin-Streptomycin Solution)培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)至78%匯合度時，根據(jù)實驗分組參照說明書將EGFR過表達和敲除載體和空載體轉(zhuǎn)染至SiHa細胞。分組：正常組(無添加載體)、過表達對照組(OE-NC)、過表達組(OE)、敲除組(395、1211、1499：針對靶基因，設計并合成3條siRNA采用PCR篩選出一條最佳序列，構(gòu)建干擾質(zhì)粒)，敲除對照組(si-NC)，對過表達質(zhì)粒、干擾質(zhì)粒進行細胞順時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24h后進行檢測。轉(zhuǎn)染5h后以新鮮培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，48h后以胰蛋白酶消化收集各組細胞，實時熒光定量PCR和Western blot法檢測各組細胞中EGFR表達水平以評價轉(zhuǎn)染效果。EGFR-siRNA由上海中喬新舟生物科技有限公司合成,其干擾序列見表1。

表1 干擾序列表

1.2.2 檢測宮頸癌SiHa細胞生物學行為 轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細胞48、72h，MTT檢測細胞增殖能力，酶標儀測定各孔490nm波長下的OD值。細胞侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲能力，劃痕試驗檢測各組細胞的遷移行為，流式細胞技術(shù)分析細胞周期。

1.2.3 Western blot檢測SiHa中STAT3、EGFR、PKM2表達 將PBS洗凈細胞中加120μL含PMSF裂解液，于冰上裂解30min，4℃ 12000r/min離心5min，取適當稀釋的上清液，BCA法來測定蛋白濃度。調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，Western blot法檢測細胞中STAT3、EGFR、PKM2表達，結(jié)果用Quantity-one圖像軟件分析并進行光密度值掃描，分別計算目的蛋白條帶與GAPDH強度比值(%)。

2 結(jié) 果

2.1 EGFR轉(zhuǎn)染效果驗證 RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，過表達組的EGFR mRNA和蛋白相對表達量顯著高于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。3條EGFR敲除組中EFGR mRNA相對表達量顯著低于空白對照組和EGFR NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中395組效果最好，后期細胞實驗選擇該干擾組，見圖1。

圖1 RT-PCR和Western blot驗證EGFR過表達和敲除的效果

2.2 EGFR轉(zhuǎn)染后對宮頸癌SiHa細胞增殖能力的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，過表達組的SiHa細胞增殖活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低表達EGFR組的SiHa細胞增殖活性較空白對照組明顯降低，P<0.05。提示，抑制EGFR表達可顯著抑制宮頸癌SiHa細胞增殖，且具有時間依賴效應，見圖2。

2.3 EGFR轉(zhuǎn)染后對宮頸癌SiHa細胞侵襲和遷移能力的影響 侵襲實驗結(jié)果顯示，EGFR過表達組的侵襲細胞數(shù)顯著高于空白對照組和空載組，敲除組的侵襲細胞數(shù)明顯降低。劃痕實驗結(jié)果顯示，EGFR過表達組的SiHa細胞遷移能力顯著高于其余對照組。敲除組的細胞遷移能力明顯降低，見圖3。

圖2 MTT檢測細胞增殖活性

圖3 侵襲和遷移實驗

2.4 Western blot法檢測PKM2、STAT3、EGFR蛋白表達 過表達EGFR組的EGFR、PKM2、STAT3蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。EGFR敲除組的EFGR、PKM2、STAT3蛋白表達顯著低于空白對照組和EGFR NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 Western blot檢測PKM2、STAT3、EGFR蛋白表達

2.5 EGFR轉(zhuǎn)染后對宮頸癌SiHa細胞周期的影響 EGFR過表達組的G1期細胞數(shù)顯著減少、S期顯著升高，EFGR敲除組的G1期細胞數(shù)增加，G2期和S期相對減少。表明EGFR過表達組的宮頸癌SiHa細胞生長失控，分裂活躍，S期和G2期細胞明顯增多。見圖5。

圖5 EGFR轉(zhuǎn)染后對宮頸癌SiHa細胞周期的影響

3 討 論

人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持續(xù)感染是宮頸癌的致病因素。HPV感染可增加細胞膜上暴露的EGF受體數(shù)量[6]。研究發(fā)現(xiàn)，HPV感染與未感染細胞比較時，作為HPV病毒主要轉(zhuǎn)化蛋白的E5、E6與E7都通過EGFR通路增強增殖信號[7]。各研究報道，宮頸癌細胞中EGFR表達上調(diào)6%～90%，這可能與檢測方法不一致有關(guān)[8]，且EGFR高表達與宮頸癌進展[9-10]及低生存率相關(guān)[11]。EGFR被認為是一種參與宮頸癌進展的受體，但具體機制仍不清楚。

魏莉等[12]通過體內(nèi)外實驗證實，EGFR是miR-186的下游靶因子之一，miR-186通過下調(diào)EGFR來抑制宮頸癌SiHa、HeLa細胞的增殖。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，轉(zhuǎn)染miR-134-5模擬物的宮頸癌HeLa和SiHa細胞的EGFR mRNA和EGFR蛋白表達顯著下調(diào)，其中SiHa細胞下調(diào)41%，該變化間接影響SiHa細胞G0/G1期細胞比例顯著上升，細胞凋亡率顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)[14]，HeLa細胞在低糖高乳酸環(huán)境中的存活狀況更好，且EGFR和mTOR基因表達水平升高。多項研究表明，EGFR高表達與宮頸癌的多重惡性生物學行為有關(guān)。這與本研究結(jié)果類似，EGFR高表達能促進SiHa宮頸癌細胞生長、增殖、凋亡、侵襲等生物學行為，抑制EGFR表達可影響宮頸癌細胞的增殖。目前關(guān)于EGFR下游蛋白分子及其機制的研究較少，且與EGFR相關(guān)的信號通路繁雜[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，PKM2、STAT3與EGFR表達存在正相關(guān)，EGFR可能通過PKM2/STAT3途徑參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。

EGFR在肺癌中研究最為廣泛，EGFR抑制劑在肺癌的應用更使其成為癌癥化療的關(guān)鍵靶標之一[16]。深入探討EGFR介導的PKM2-STAT3信號通路在宮頸癌中的作用機制，進而探尋EGFR對宮頸癌細胞的作用及其與下游PKM2、STAT3受體、癌細胞增殖抑制與功能蛋白表達的關(guān)系，明確其作用機制，為臨床開展相關(guān)藥物提供理論基礎(chǔ),是一個極具臨床應用價值的研究領(lǐng)域。