非編碼RNA在口腔癌中的研究進展

傅雨婷，楊汶峻，蔣斌元

0 引言

口腔癌是口腔惡性腫瘤的總稱，包括牙齦、舌、軟硬腭、頜骨、口底、咽部、涎腺等位置的癌變，以鱗狀上皮細胞癌為主。近年我國口腔癌發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢，吸煙、酒精、嚼檳榔以及HPV感染都是口腔癌發(fā)生的風(fēng)險因素[1]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在手術(shù)技術(shù)、放療和化療方面均已取得巨大進步，但口腔癌患者的5年生存率近30年來提升緩慢，人種、年齡、性別、生活習(xí)慣等多種因素均影響著口腔癌患者的生存時間[2-3]?？谇话谋举|(zhì)上來說是一種多基因異常改變導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，從基因的角度探索口腔癌診療的新途徑具有重要意義。非編碼RNA（ncRNAs）是一類低編碼蛋白潛能的轉(zhuǎn)錄本序列，占人類轉(zhuǎn)錄本總數(shù)的95%以上，包括小分子RNA（miRNAs）、長鏈非編碼RNA（lncRNAs）、環(huán)狀RNA（circRNAs）等，是基因表達調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的重要分子。癌癥研究領(lǐng)域中非編碼RNA越來越受到研究者的關(guān)注，探索口腔癌中非編碼RNA的功能及其作為口腔癌診斷標志物或治療靶點的可能性具有重要的意義。

1 miRNA與口腔癌

miRNA是一類長度為20～25個核苷酸的短片段RNA，成熟的miRNA由初級轉(zhuǎn)錄物pri-miRNA、前體pre-miRNA逐級加工產(chǎn)生，誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）與靶基因位點結(jié)合，從而實現(xiàn)翻譯抑制及RNA降解，完成基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。人類60%的基因受到miRNAs的調(diào)控，涉及細胞增殖、細胞凋亡、組織分化、免疫調(diào)控等生理過程。小分子RNA功能的多樣性及表達的特異性使其在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注，是腫瘤診斷與靶向治療研究的焦點。

1.1 miRNA對口腔癌生物學(xué)功能的影響

miRNA與口腔癌的生物學(xué)進程密切相關(guān)，Xu等[4]報道口腔癌中miR-340的減少導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1（Glut1）的異常增加，提升口腔癌細胞葡萄糖攝取率，導(dǎo)致腫瘤細胞生長加快；Zheng等報道[5]口腔癌細胞中miR-92a表達明顯增加，使用miR-92a抑制劑后恢復(fù)了靶基因KLF4的表達及對Wnt/β-catenin信號通路的負調(diào)控，從而減弱了腫瘤細胞的增殖和抗凋亡能力；Wang等報道[6]口腔癌細胞的miR-210-3p經(jīng)外泌體途徑進入內(nèi)皮細胞后，靶向減少內(nèi)皮細胞ephrinA3的表達，激活PI3K/AKT信號通路及增強血管形成能力；Liu等[7]發(fā)現(xiàn)腫瘤抑制因子miR-150在口腔癌中同樣表達降低，伴隨靶基因HMGA2的表達升高，口腔癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移能力增強。

1.2 miRNA與口腔癌預(yù)后

多種miRNA的表達改變與口腔癌患者病情發(fā)展密切相關(guān)，miRNA具有組織時序表達特異性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和體液循環(huán)的特點，具有成為理想口腔腫瘤標志物的潛質(zhì)，是開發(fā)口腔癌診斷標志物的重要途徑之一。

Lopes等分析發(fā)現(xiàn)miR-21可區(qū)分口腔癌組織與正常組織（AUC=0.968;95%CI: 0.920～1.00）[8]，Dioguardi等分析了體液循環(huán)系統(tǒng)中miR-21表達的相關(guān)研究，認為miR-21是極具開發(fā)潛力的口腔癌腫瘤標志物[9]；Clague等對比136例口腔癌前病變患者（黏膜白斑病/黏膜紅斑?。┡c136例健康對照者之間血液樣本中21個miRNAs基因的SNP位點差異，發(fā)現(xiàn)pri-miR-26a-1rs7372209 C＞T位點突變（OR=2.09;95%CI: 1.23～3.56）的患者口腔癌癌前病變的風(fēng)險增加[10]；Langevin等指出miR-137啟動子區(qū)域的甲基化與口腔癌及部分頭頸部腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)（OR=4.80,95%CI: 1.23～18.82），在口腔癌早期組織中有較好的特異性[11]；Manikandan等指出口腔癌組織中miR-1275的表達與口腔癌的局部淋巴轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，miR-223的表達則與腫瘤的分期呈負相關(guān)[12]；MacLellan等分析口腔癌患者血清樣本后指出miR-16、let-7b、miR-338-3p、miR-223和miR-29a可組成口腔癌診斷的聯(lián)合指標[13]。此外口腔癌患者血清中miR-9與口腔癌預(yù)后呈正相關(guān)[14]，miR-150-5p、miR-222-3p和miR-423-5p作為聯(lián)合診斷指標可有效區(qū)分早期口腔癌和癌前病變（AUC=0.917,95%CI=0.861～0.973）[15]；在口腔癌患者的唾液中miR-15a和miR-16-1表達顯著減少[16]。以上不同樣本來源的miRNA指標都有作為口腔癌早期診斷標志物的應(yīng)用潛力。

1.3 miRNA與口腔癌的藥物研發(fā)

小核酸藥物將是繼化合藥物、蛋白質(zhì)藥物之后的第三代藥物。目前的小核酸類藥物包括反義寡核苷酸（ASO）、小發(fā)夾RNA（shRNA）、小干擾RNA（siRNA）等，小核酸藥物針對靶基因設(shè)計核酸序列大幅減少了藥物研發(fā)的盲目性，開發(fā)流程快耗時短，并可實現(xiàn)個性化治療方案[17]。

基于miRNA治療癌癥的基本策略主要有兩種：一是使用miRNA抑制劑如antagomirs或miRNA競爭物阻止具有促癌作用的miRNA靶向目的基因，亦或使用基因編輯技術(shù)消除基因組上該miRNA的表達位點，前文中所提的致癌類miRNAs如miR-340、miR-92a、miR-210-3p等可用此策略；二是miRNA替代療法，即在體外合成相應(yīng)miRNA的模擬物，導(dǎo)入生物體后恢復(fù)相關(guān)功能，前文中所提的抑癌類miRNAs如miR-150等可用此策略。小核酸藥物還可輔助增強放化療或免疫治療對口腔癌的效果，如沉默miR-218可抑制Wnt通路的激活增強口腔癌細胞的順鉑敏感度[18]；miR-29a-3p的模擬物可抑制AMDM12表達增強口腔癌細胞的放療敏感度[19]。免疫治療方面，使用miR-197的模擬物可抑制PD-L1表達并減少細胞毒性淋巴細胞的抑制和腫瘤細胞的免疫逃逸[20]。

核酸類藥物傳遞方式主要包括病毒類和非病毒類，其中病毒類包括慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒（AAV）介導(dǎo)的傳遞系統(tǒng)，高效但有一定的免疫原性和安全隱患；非病毒類包括脂質(zhì)體、陽離子聚合物、細胞外囊泡和無機載體，安全性好但效率有待提升。鑒于外泌體核酸傳遞的高效性，Li等利用γδT細胞來源的細胞外囊泡（γδTDEs）傳遞miR-138進入口腔癌細胞[21]，在傳遞抗腫瘤核酸藥物的同時又刺激了對腫瘤細胞的免疫反應(yīng)。核酸類藥物傳遞方式的改進將一直伴隨此類藥物的發(fā)展。

鑒于腫瘤分子機制的復(fù)雜性，小核酸類藥物靶向治療腫瘤的應(yīng)用難度將遠遠大于單基因罕見病治療，目前大量研究都還處于臨床Ⅰ期試驗，小核酸類藥物開發(fā)既是未來的趨勢卻又充滿挑戰(zhàn)。

2 長鏈非編碼RNA與口腔癌

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200 nt的RNA轉(zhuǎn)錄本，與蛋白或核酸物質(zhì)結(jié)合后發(fā)揮其相應(yīng)的功能，參與了染色質(zhì)修飾、RNA轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、蛋白質(zhì)合成等多個生理過程，幾乎涉及生物體內(nèi)全部的生理病理過程[22]。在口腔癌發(fā)生發(fā)展過程中l(wèi)ncRNA同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用，且大量未知有待研究。

2.1 lncRNA對口腔癌生物學(xué)功能的影響

lncRNA通過參與表觀遺傳調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后修飾影響口腔癌細胞的增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)進程。Jia等研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FALEC可與轉(zhuǎn)錄抑制因子復(fù)合物PRC2的催化亞基EZH2結(jié)合，并協(xié)助其定位至細胞外基質(zhì)蛋白ECM1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點，增加H3K27me3甲基化修飾，使ECM1基因表達降低，從而降低口腔癌細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力[23]。此外Huang等發(fā)現(xiàn)在口腔癌中l(wèi)ncRNA NKILA削弱核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性從而減少Twist等EMT相關(guān)蛋白的表達，抑制口腔癌的遷移和侵襲[24]。Ai等發(fā)現(xiàn)LINC00941誘導(dǎo)CAPRIN2基因啟動子區(qū)域DNA片段發(fā)生環(huán)化，增強轉(zhuǎn)錄因子CTCF與該區(qū)域的結(jié)合從而加速口腔癌細胞的增殖[25]。此外lncRNA RC3H2通過內(nèi)源競爭性RNA（ceRNA）機制與miRNA-101-3p結(jié)合，導(dǎo)致miRNA-101-3p靶點EZH2基因的表達增加和口腔癌的惡性進展[26]。lncRNA還存在如增強子RNA（eRNA）及短肽翻譯等功能[27]，但口腔癌中尚無相關(guān)報道，有待研究和補充。

2.2 LncRNA與口腔癌預(yù)后

LncRNA功能的多樣性及表達的特異性使其同樣具有作為腫瘤標志物的開發(fā)潛力，目前口腔癌相關(guān)lncRNA標志物的取材主要來自血液、唾液及口腔組織。Jia等使用基因芯片檢測口腔癌患者及健康對照組血漿中l(wèi)ncRNA表達差異，發(fā)現(xiàn)ENST00000588803與NR_038323的組合可有效區(qū)分口腔癌癌前病變與健康對照（AUC: 0.954,95%CI: 0.886～1），NR_131012與ENST00000588803的組合可有效區(qū)分口腔癌與癌前病變（AUC: 0.924,95%CI: 0.837～1），此外NR_131012、ENST00000588803、NR_038323三者組合可有效區(qū)分早期口腔癌和晚期口腔癌（AUC:0.926,95%CI: 0.864～0.987）[28]。Zhang等發(fā)現(xiàn)口腔癌Ⅰ期和Ⅱ期患者血漿中l(wèi)ncRNACACS15表達顯著高于癌前病變和正常對照組（AUC: 0.88,95%CI:0.85～0.95）[29]。Shao等檢測口腔癌患者組織和血清樣本均發(fā)現(xiàn)lncAC007271.3明顯高于對照組（AUC: 0.873,95%CI: 0.815～0.931），具有較好的特異性和敏感度[30]。唾液樣本中，Tang等發(fā)現(xiàn)HOTAIR在發(fā)生轉(zhuǎn)移的口腔癌患者唾液中高表達[31]。Yang等報道口腔癌組織中CASC9的表達量與患者的平均總生存期負相關(guān)，認為CASC9能作為口腔癌預(yù)后的獨立預(yù)測因子[32]。

2.3 LncRNA與口腔癌的藥物研發(fā)

LncRNA數(shù)量龐大，涉及生物體內(nèi)多種功能。隨著對lncRNA研究的逐漸深入，有望成為基因治療藥物開發(fā)的最大靶點庫。基因治療旨在將外源性的核酸序列引入腫瘤細胞，修正腫瘤細胞中的異常基因，從根本上治療腫瘤?；蛑委煵呗灾饕兴姆N：基因修正、基因置換、基因失活和基因修飾，CRISPR/CaS系統(tǒng)可便捷地進行基因編輯，表達CaS蛋白和gRNA的核酸藥物通過病毒類或非病毒類傳遞方式進入生物體從而實現(xiàn)基因治療[33]。

目前l(fā)ncRNA相關(guān)的基因治療嘗試在抑制腫瘤惡性發(fā)展和輔助傳統(tǒng)治療方面都取得了一定的研究數(shù)據(jù)。靶向LINC00460的siRNA有效抑制了LINC00460表達和口腔癌細胞的遠端轉(zhuǎn)移能力[34]；Wang等使用慢病毒載體表達靶向lnc-p23154的shRNA，顯著降低了口腔癌細胞體內(nèi)外的侵襲與轉(zhuǎn)移能力[35]；Liu等在口腔癌細胞小鼠移植瘤部位注射靶向FOXD2-AS1的ASO反義核苷酸藥物后顯著抑制了腫瘤的生長[36]；Chang等利用CRISPR/Cas9靶向消除miR-31宿主基因MIR31HG（miR-31 host gene）序列中miR-31的表達位點，miR-31表達缺失的口腔癌細胞惡性程度顯著降低[37]。此外，沉默HOXA11-AS能提高口腔癌耐藥細胞的化療敏感度[38]；沉默lncRNA BLACAT1可降低口腔癌細胞的放療耐受[39]。在免疫治療方面，增強lncMX1-215[40]和lncRNA CRNDE[41]表達均顯著抑制口腔癌細胞的增殖和免疫逃逸。

目前l(fā)ncRNA靶點的基因治療臨床轉(zhuǎn)化同樣面臨著如藥物精準遞送、免疫反應(yīng)等問題，為實現(xiàn)lncRNA精準治療Jin等建立了lncRNA功能元件篩選體系，在動物模型中成功實現(xiàn)了骨質(zhì)疏松的精準靶向基因治療[42]，期待口腔癌lncRNA靶點精準基因治療的成果早日出現(xiàn)。

3 環(huán)狀RNA與口腔癌

環(huán)狀RNA（circRNA）是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且不受RNA外切酶的影響，表達具有組織、細胞和發(fā)育階段的特異性[43]。近年來腫瘤相關(guān)circRNA研究非?；馃?，是腫瘤基因研究和標志物開發(fā)的新焦點。

3.1 CircRNA對口腔癌細胞生物學(xué)功能的影響

CircRNA機制和功能研究最多的是通過競爭性內(nèi)源性RNA機制（ceRNA）與miRNA結(jié)合，改變miRNA對靶基因表達的影響。He等發(fā)現(xiàn)circPVT1競爭性結(jié)合miR-125b后導(dǎo)致靶基因STAT3表達增加，從而增強口腔癌細胞的增殖能力[44]；circRNA_0000140結(jié)合miR-31后抑制Hippo信號通路，削弱口腔癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力[45]。此外circRNA可與蛋白質(zhì)結(jié)合并影響蛋白質(zhì)功能，如circGSK3β與GSK3β結(jié)合后抑制GSK3β對β-catenin蛋白的磷酸化調(diào)控，導(dǎo)致口腔癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強[46]。CircRNA中人工引入核糖體進入位點和GFP編碼序列后成功表達GFP蛋白質(zhì)[47]，隨后發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)天然存在這一現(xiàn)象，并有RNA N6-甲基腺苷（m6A）修飾介導(dǎo)circRNA的蛋白翻譯功能[48]。

3.2 CircRNA對口腔癌預(yù)后的影響

CircRNA不僅具備miRNA和lncRNA作為口腔癌診斷和預(yù)后標志物的優(yōu)點，其分子結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、半衰期更長，經(jīng)人工修飾后還可實現(xiàn)特定的分子功能，將具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

CircRNA的表達與口腔癌病理進程密切相關(guān)，hsa_circ_0008309[49]、hsa_circ_000334[50]、hsa_circ_006740[50]在口腔癌組織中表達顯著高于正常對照；hsa_circ_009755在口腔癌T1-T2期患者腫瘤組織中表達顯著高于T3-T4期腫瘤組織（AUC:0.782,95%CI: 0.667～0.854）[51]；hsa_circ_0109291[52]和circPVT1[53]與口腔癌患者的預(yù)后呈負相關(guān)，可作為口腔癌的預(yù)后生物標志物。Zhao等發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001874和hsa_circ_0001971在口腔癌患者唾液中表達顯著增加，而術(shù)后的口腔癌患者唾液中兩者表達顯著降低，hsa_circ_0001874與hsa_circ_0001971的組合可用于口腔癌的早期診斷（AUC: 0.922,95%CI: 0.883～0.961）[54]。

3.3 CircRNA與口腔癌的藥物研發(fā)

與其他致癌類基因的處理策略類似，致癌的circRNA依舊可采用小核酸類藥物或CRISPR/CaS系統(tǒng)抑制其表達，但在設(shè)計circRNA敲降靶點時要避免選擇與其線性轉(zhuǎn)錄本序列相同的區(qū)段，敲降靶點應(yīng)該落在circRNA的頭尾連接處。在口腔癌細胞中，敲低circ_0001971在抑制口腔癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的同時增加了口腔癌細胞對順鉑的敏感度[55]；敲低circKRT1后口腔癌細胞的增殖和免疫逃逸能力減弱[56]。對于抑癌類circRNA可體外合成circRNA或?qū)⒈磉_質(zhì)粒通過特定的傳遞方式導(dǎo)入生物體內(nèi)，如增加口腔癌細胞中circFLNA的表達可顯著抑制腫瘤細胞增殖[57]；過表達circATRNL1則有效增加口腔癌細胞的放療敏感度[58]。

目前circRNA影響腫瘤惡性進展的研究大多集中在ceRNA方向，但是circRNA最大的優(yōu)勢還是在于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和低的免疫原性，基于circRNA靶向抑制蛋白質(zhì)的功能可設(shè)計特異性強、不良反應(yīng)小的蛋白抑制劑；基于經(jīng)RNA甲基化修飾后的circRNA可穩(wěn)定表達蛋白序列的功能，可在生物體內(nèi)持續(xù)表達目的蛋白，用于制造circRNA疫苗及開展基因治療。這些circRNA新的功能將極大拓展circRNA類核酸藥物的應(yīng)用前景。

4 總結(jié)與展望

非編碼RNA在口腔癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，參與了口腔癌大量生物過程。miRNA、lncRNA和circRNA對口腔癌生物學(xué)特性的影響、預(yù)后及治療的相關(guān)研究內(nèi)容見表1。雖然有大量可用于腫瘤分子診斷和基因治療的基因，但是絕大部分治療腫瘤的核酸類藥物僅處于臨床Ⅰ期或Ⅱ期的實驗階段，大多數(shù)為miRNA模擬物和miRNA抑制物，基于lncRNA和circRNA的核酸類藥物極少。腫瘤相關(guān)非編碼RNA從基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化還有一段較長的路走，但前景依舊廣闊。伴隨著測序技術(shù)的進步，生物信息會發(fā)生爆炸式的增長，病例資料結(jié)合基因信息篩選腫瘤相關(guān)基因也必將成為研究者關(guān)注的重點。近年逐漸成熟的加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析可對基因關(guān)聯(lián)模式進行分析，幫助研究者厘清基因表達、生物過程以及疾病之間的關(guān)系。隨著對口腔癌研究的深入，希望通過基因表達模塊與特定性狀、表型之間的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)microRNA、lncRNA、circRNA和mRNA可能存在的規(guī)律，為口腔癌的診斷和治療提供參考，總結(jié)出核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合的規(guī)律和功能位點，從而高效地開發(fā)出具有應(yīng)用前景的口腔癌診斷標志物和治療靶點。

表1 口腔癌中非編碼RNA概況Table 1 Summary of non-coding RNAs in oral carcinoma