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    cfDNA在胰腺癌中的診斷價值

    2023-01-09 10:51:04徐亦君竺明晨
    腫瘤防治研究 2022年12期
    關(guān)鍵詞:敏感度胰腺癌特異性

    徐亦君,竺明晨

    0 引言

    胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是一種常見的惡性實體腫瘤,其發(fā)病率和死亡率持續(xù)升高[1-3]。手術(shù)是胰腺癌最重要的治療手段。由于癥狀不典型和缺乏有效的篩查工具,許多患者在診斷時已發(fā)展到不可切除的狀態(tài),據(jù)統(tǒng)計只有20%的病例可以切除病灶[4]。此外,即使在治愈性手術(shù)后,復發(fā)率也很高,且長期生存率比其他癌癥短[5-6]。因此探索胰腺癌診斷和預后相關(guān)標志物對于改善胰腺癌患者預后意義重大。

    液體活檢利用外周循環(huán)血液代替組織標本進行檢測,可提供腫瘤輔助診斷和治療相關(guān)信息,成為近年來的研究熱點。作為液體活檢之一的游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)是一類由壞死或者凋亡細胞產(chǎn)生的存在于體液中的DNA,在腫瘤中可由腫瘤細胞釋放到血液中,因此cfDNA越來越多地引起腫瘤研究者關(guān)注[7-11]。研究顯示cfDNA Stat3在乳腺癌中升高,并與腫瘤體積相關(guān),cfDNA還可作為非小細胞肺癌患者預后的生物標志物和療效預測指標[12-13]。此外,cfDNA檢測在分析腫瘤衍生突變、腫瘤突變負擔、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、突變特征和體細胞突變來源等方面提供許多信息[14]。目前有關(guān)cfDNA在胰腺癌中的應用價值探討較少,因此本課題擬研究血漿cfDNA檢測在胰腺癌中的臨床價值。

    1 資料與方法

    1.1 資料

    選取江蘇省腫瘤醫(yī)院2018年1月—2021年12月收治的胰腺癌患者467例以及129例健康體檢者(健康對照組),其中男332例,女264例,年齡17~86歲,中位年齡62歲(53~69歲)。納入標準:均經(jīng)病理確診為胰腺癌;均無除胰腺癌外其他惡性腫瘤;均知情同意并自愿參與本次研究;術(shù)前未行任何抗腫瘤藥物治療。排除標準:有既往腫瘤病史;有嚴重心、肝、腎等功能不全。收集的胰腺癌患者病理資料包括年齡、性別、腫瘤TNM分期(參照美國癌癥聯(lián)合委員會胰腺癌第八版分期標準)、血清CEA和CA19-9。本研究通過江蘇省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準。

    1.2 方法

    抽取受試者2 ml靜脈全血,EDTA-K2抗凝,1 900g離心15 min后獲得血漿。使用帝基(南京)生物科技有限公司生產(chǎn)的QuantiDNA Direct cfDNA Test(DiaCarta)試劑盒檢測cfDNA濃度,主要過程如下:在90 μl PBS中加入10 μl血漿,95℃加熱10 min,然后放置冰上5 min,DNA標準品采用相同處理。配置74 μl裂解液、1 μl封閉液、4 μl人類Alu探針、捕獲磁珠和0.1 μl蛋白酶K作為每孔的工作液,然后進行雜交,采用Luminex MAGPIX?儀器讀取結(jié)果,操作步驟詳見試劑說明書。cfDNA的Cut off值為12 ng/ml。使用Roche e 601電化學發(fā)光儀檢測患者血清CEA和CA19-9水平。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    采用Spass16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性分布檢驗,偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和25%~75%百分位形式顯示,組間數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney U檢驗。cfDNA與胰腺癌病理資料的關(guān)系采用卡方檢驗。繪制ROC曲線評估相關(guān)指標作為標志位的效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 cfDNA在胰腺癌和健康對照組中的水平

    采用cfDNA檢測試劑盒,建立cfDNA濃度標準曲線,見圖1。統(tǒng)計分析467例胰腺癌患者和129例健康對照組血漿cfDNA含量,兩組均不呈正態(tài)分布,健康對照組cfDNA中位數(shù)15.15(9.65~32.48)ng/ml,胰腺癌cfDNA中位數(shù)20.85(12.9~35.96)ng/ml,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0027,Mann-Whitney U=24932)。cfDNA在胰腺癌中的陽性率為77.73%(363/467),高于健康對照組中的陽性率59.68%(77/129)。

    圖1 cfDNA檢測標準曲線Figure 1 Standard curve of cfDNA test

    2.2 cfDNA與胰腺癌患者病理資料的關(guān)系

    分析47例病理資料完整的胰腺癌手術(shù)患者cfDNA水平和患者性別、年齡、TNM、CEA和CA19-9等病理資料關(guān)系,發(fā)現(xiàn)cfDNA水平與這些因素不同分組間無顯著相關(guān)性,見表1。

    表1 cfDNA與胰腺癌病理資料的關(guān)系Table 1 Relationship between cfDNA and clinicopathologic features of patients with pancreatic cancer

    2.3 cfDNA作為胰腺癌診斷標志物的臨床價值

    cfDNA、CEA和CA19-9作為診斷標志物的敏感度分別為62.65%、64.04%和60.32%,特異性分別為61.05%、70.53%和87.37%,見表2。cfDNA聯(lián)合檢測CEA和CA19-9敏感度為77.26%,特異性為53.58%。cfDNA、CEA、CA19-9和聯(lián)合檢測曲線下面積分別為0.62、0.67、0.74和0.67。cfDNA作為腫瘤標志物的敏感度高于CA19-9,但是特異性低于CA19-9,此三項指標聯(lián)合檢測敏感度得到顯著提高,見圖2。

    圖2 ROC曲線評估cfDNA、CEA和CA19-9作為胰腺癌診斷標志物的效能Figure 2 Performance of cfDNA,CEA and CA19-9 as pancreatic cancer diagnostic biomarkers evaluated by ROC curves

    表2 cfDNA、CEA和CA19-9作為胰腺癌診斷標志物的效能Table 2 Performance of cfDNA,CEA,and CA19-9 as pancreatic cancer biomarkers

    3 討論

    胰腺癌惡性程度高,目前缺乏可靠的早期篩查方法,5年生存率僅為9%[15-16]。因此,在臨床治療中,迫切需要找到影響胰腺癌預后的生物標志物,便于對患者的預后進行評估,并通過對患者的個體化治療來改善預后。但目前對于胰腺癌臨床上缺乏特異性的生物標志物[17],常用的主要血清標志物是CEA和CA19-9,然而,它們的敏感度不夠理想[18]。

    近年來血漿cfDNA檢測作為一種新的液態(tài)活檢方法逐漸成為研究熱點。腫瘤發(fā)生過程中更高的壞死和凋亡率與cfDNA濃度增加有關(guān)[19]。癌癥患者cfDNA攜帶了腫瘤發(fā)生相關(guān)的遺傳改變信息,例如DNA含量、DNA完整性、雜合性缺失及癌基因和抑癌基因的突變等,這些改變與癌癥的發(fā)展、進展和對治療的抵抗有關(guān),為臨床診斷和治療提供了有用信息[19-22]。據(jù)報道,cfDNA片段的大小對晚期胰腺癌患者具有預后價值,較短的cfDNA片段與較差的預后有關(guān)[23]。既往研究證實突變體K-RAS可作為胰腺癌的關(guān)鍵驅(qū)動基因,一項對正在接受手術(shù)/化療的晚期胰腺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)突變循環(huán)K-RAS水平降低,證實了該化療方案的有效性,循環(huán)K-RAS DNA狀態(tài)的改變可以提供預測治療反應的關(guān)鍵信息[24]。何建新等采用實時熒光定量PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)40例胰腺癌患者血漿cfDNA水平高于健康對照組[25],本研究采用SuperbDNA?技術(shù)檢測596例樣本,得出結(jié)果與何建新等的相符,胰腺癌患者的血漿cfDNA水平高于健康對照組。此外,結(jié)果顯示cfDNA與胰腺癌病理資料之間無顯著相關(guān)性,雖然cfDNA在16例胰腺癌遠端轉(zhuǎn)移組和31例非轉(zhuǎn)移組之間差異無統(tǒng)計學意義,但發(fā)現(xiàn)5例遠端轉(zhuǎn)移的患者cfDNA水平較轉(zhuǎn)移前顯著升高。由于觀察的例數(shù)過少,是否具有統(tǒng)計學意義還有待驗證,未來需要擴大病例數(shù)進一步論證cfDNA與胰腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

    CA19-9是一種低聚糖腫瘤相關(guān)抗原,在胰腺癌患者血清中升高,大量研究表明其在胰腺癌篩查、診斷、預后和療效評估方面具有重要作用[26]。雖然CA19-9被認為是胰腺癌的早期診斷標志物,但也有報道其存在一些不足,包括診斷的敏感度和特異性較差,不能滿足臨床需求[27]。CEA主要用于結(jié)腸癌的診斷和療效監(jiān)測,并在約60%的胰腺癌患者血清中升高,但關(guān)于CEA在胰腺癌中的臨床價值討論較少。據(jù)報道其診斷胰腺癌的敏感度僅為30%左右,并存在非特異性結(jié)腸炎和重度吸煙等干擾因素。然而,對于診斷為胰腺癌的患者,CEA可用于評估治療的有效性和復發(fā)監(jiān)測[28]。值得注意的是,在轉(zhuǎn)移性和局部進展性胰腺癌中,CEA被認為是比CA19-9更好的預測生物標志物,但在生存和早期復發(fā)方面,它的預測價值不是很理想[29]。這些腫瘤標志物單獨應用時診斷效能不高,一般推薦聯(lián)合檢測。本研究發(fā)現(xiàn)CA19-9在診斷胰腺癌方面具有較高的特異性,但是敏感度不高,聯(lián)合應用CA19-9、CEA和cfDNA后,敏感度顯著提高。此外,到三個指標聯(lián)合檢測后特異性相比單個指標的特異性有所降低,這可能與采用不同的Cut off值有關(guān)。我們認為僅通過監(jiān)測cfDNA濃度得到的信息有限,需要深入挖掘這些DNA突變或者DNA片段完整性等相關(guān)信息,才能充分發(fā)揮cfDNA在胰腺癌診斷和治療監(jiān)測方面的價值。

    綜上,腫瘤患者的cfDNA以一種液態(tài)活檢形式在腫瘤診斷和治療方面具有無創(chuàng)、采樣方便可動態(tài)監(jiān)測等特點。本研究發(fā)現(xiàn)cfDNA在胰腺癌患者中水平高于健康對照組,聯(lián)合檢測cfDNA和常規(guī)標志物可一定程度地改善胰腺癌的診斷效能。cfDNA在胰腺癌中的臨床生物學價值需要更多的研究來挖掘,為胰腺癌的診斷和治療提供更好的標志物指標。

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