CENPF通過上調(diào)ACKR3/CXCR7促進非小細胞肺癌EMT的研究

顧彤，姜瑜珩*，丁姝，陳煒，羅超，于偉勇，陳小飛

0 引言

肺癌是目前全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位居世界第二位和第一位[1]，尤其在中國，其5年生存率僅有19.7%[2]。NSCLC根據(jù)組織結(jié)構(gòu)異質(zhì)性又分為鱗癌（LUSC）和腺癌（LUAD）[3]。目前，盡管NSCLC的治療有了非常大的進步，但患者總體預后仍然較差，主要是多數(shù)患者確診時已經(jīng)是晚期且已發(fā)生轉(zhuǎn)移，另一個重要原因則是手術切除后復發(fā)[4]。因此尋找新的治療方法和治療靶點來改善NSCLC患者預后仍然是目前亟待解決的關鍵問題。人類著絲粒蛋白F（CENPF）是叉頭框蛋白M1（FOXM1）的已知靶點[5]，研究表明，CENPF的表達與多種腫瘤的進展及預后顯著相關[6-8]，且CENPF在LUAD中的功能尚未完全闡明，為此本研究將探討CENPF在LUAD中表達與患者臨床預后及病理分期的關系，同時初步探討其發(fā)揮功能的機制。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本

LUAD組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司（HLugA180Su07），樣本剔除失訪病例后共87例肺腺癌患者組織，其中男47例、女40例，平均年齡（63.8±8.72）歲，T1期患者16例、T2期患者46例、T3期患者20例、T4期患者5例；病理分級為Ⅰ級7例、Ⅱ級50例、Ⅲ級30例。

1.2 材料與設備

肺腺癌NCI-H2126細胞（中國科學院上海細胞庫）。DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、胎牛血清（FBS）（美國Hyclone公司）。青霉素、鏈霉素（美國Hyclone公司）。CENPF慢病毒由吉凱基因公司設計生產(chǎn)。SDS-PAGE試劑（上海生工公司）。ACKR3/CXCR7、E-cadherin、N-cadherin及GAPDH抗體（武漢三鷹）。主要設備有生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、垂直電泳儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)、Tecan酶標儀等。

1.3 免疫組織化學染色

SP法檢測組織芯片中CENPF的表達。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，加0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH6.0），高壓鍋進行抗原熱修復，加3%H2O2室溫避光孵育30 min，PBS洗滌3次。滴加10%的正常非免疫羊血清，37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。滴加CENPF一抗工作液（1:100），4℃孵育過夜，PBS洗滌3次。滴加二抗工作液（稀釋比例為1:500），37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉卵白素，37℃孵育60 min，PBS洗滌3次。DAB顯色、蘇木精對比染色、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。采用TissueGnostics全景組織掃描儀對染色結(jié)果進行掃描，根據(jù)染色結(jié)果，以所有患者的平均吸光度值的中位表達值為截斷值將所有患者分為CENPF高表達組和CENPF低表達組。

1.4 Western blot 檢測

細胞用RIPA裂解液進行裂解，超聲后離心取上清液。BCA試劑盒（上海生工公司）測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳用5%的濃縮膠與12%的分離膠進行。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA封閉。分別加CENPF（1:1 000）、ACKR3（1:1 000）、E-cadherin（1:1 000）、N-cadherin（1:1 000）及GAPDH（2:1 000）4℃孵育過夜。洗滌，二抗（1:5 000，武漢三鷹公司）室溫孵育，洗滌，曝光顯色。

1.5 CENPF穩(wěn)定敲除細胞株建立

根據(jù)人CENPF的mRNA序列設計siRNA慢病毒干擾序列（正義引物: 5’-TAAGAGTCCCATTCTCTTGGG-3’，反義引物:5’-TAAGAGTCCCATTCTCTTGGG-3’）。參照慢病毒轉(zhuǎn)染說明書感染NCI-H2126細胞，并用嘌呤霉素進行篩選。篩選至第14天時，將篩選細胞進行Western blot鑒定，檢測CENPF表達，獲得穩(wěn)定敲除CENPF的單克隆細胞株。

1.6 RNA-seq檢測

細胞提取RNA后，按照RNA-seq測序要求制備樣品后送第三方測序公司（諾禾致源公司）完成mRNA測序，并對測序結(jié)果進行生物信息學分析。

1.7 細胞遷移能力檢測

Transwell小室下室加入500 μl含10% FBS的完全培養(yǎng)基，上室中分別接種1×105個無血清培養(yǎng)基重懸的細胞。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用濕棉簽擦去上室面未遷移的腫瘤細胞，固定1 min，然后結(jié)晶紫染色，三蒸水洗2次后在普通光學顯微鏡下隨機選取5個視野計總數(shù)，取其平均值。

1.8 細胞侵襲能力檢測

按照說明將50 mg/L Matrigel（美國Corning公司）1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風干。纖維粘蛋白（FN）（美國Sigma公司）均勻涂抹在Transwell小室的下室面，24孔板中加入500 μl含10%FBS的完全培養(yǎng)基，然后將Transwell小室置于孔中，上室中接種1×105個無血清培養(yǎng)基重懸的細胞。37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，用濕棉簽擦去上室面未侵襲的腫瘤細胞。甲醇固定1 min，結(jié)晶紫染色，三蒸水洗2次后在顯微鏡下隨機選取5個視野計總數(shù)，取其平均值。

1.9 細胞增殖能力檢測

取對數(shù)期細胞做梯度稀釋。6孔板每孔種1 000個細胞，約兩周后從培養(yǎng)箱中取出，中間可視細胞生長情況給其換新鮮培養(yǎng)基；PBS小心清洗兩遍。每孔加入1 ml甲醇固定20 min后棄甲醇，每孔加入1 ml結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗兩遍，晾干后用核酸凝膠成像儀拍照，觀察克隆大小，計數(shù)超過50個克隆的數(shù)量。取對數(shù)期細胞接種于96孔板，每孔2 000個細胞。每孔加入10 μl CCK-8溶液，24、48和72 h時在37℃下孵育2 h。酶標儀測量實驗孔在450 nm處的吸光度值。

1.10 統(tǒng)計學方法

SPSS22.0和Graph Pad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析與作圖。計數(shù)資料用頻數(shù)和百分比表示，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示。Cox生存風險比例模型分析患者年齡、性別、TNM分期、腫瘤大小、病理分期及CENPF表達與患者死亡風險的關系；Kaplan-Meier分析CENPF表達與肺腺癌患者預后的關系；t檢驗分析獨立樣本之間差異，χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行計數(shù)資料分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CENPF在LUAD中表達及與患者預后的關系

GEPIA2數(shù)據(jù)庫（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）分析顯示，CENPF在LUAD中表達較正常組織顯著上調(diào)且與臨床病理分期正相關，與患者生存及無疾病進展呈負相關，見圖1A～D。免疫組織化學染色進行驗證，結(jié)果證實，LUAD中CENPF表達顯著升高，見圖1E～F，且其表達與患者預后顯著相關，低表達患者預后優(yōu)于高表達患者，見圖1G。

圖1 CENPF在LUAD中的表達及與患者臨床預后的關系Figure 1 Expression of CENPF in LUAD and correlated with clinical prognosis of patients

2.2 LUAD患者死亡風險因素分析

Cox風險比例回歸模型分析結(jié)果顯示，LUAD患者N分期及CENPF表達與患者死亡風險相關，而T分期、年齡、性別、病理分型及腫瘤大小則與患者死亡風險無關，見表1。

表1 Cox生存風險比例分析與患者死亡相關因素Table 1 Cox survival hazard ratio analysis of major factors associated with patient death

2.3 CENPF表達與患者臨床病理因素的關系

Kaplan-Meier生存分析中CENPF表達的截斷值將低表達患者定義為陰性，高表達患者定義為陽性，結(jié)果表明，除N分期與CENPF表達有關外，性別、年齡、T分期、病理分級及腫瘤大小均與CENPF表達無關，這表明CENPF的表達與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，見表2。

表2 CENPF表達與臨床病理因素之間的關聯(lián)Table 2 Association between CENPF expression and clinicopathological factors

2.4 CENPF表達對LUAD細胞表型的影響

體外細胞實驗表明，下調(diào)NCI-H2126細胞CENPF表達后，細胞增殖能力、遷移能力及侵襲能力顯著降低，見圖2。

圖2 下調(diào)CENPF表達對LUAD細胞增殖、侵襲及遷移的影響Figure 2 Effect of down-regulation of CENPF on proliferation,invasion and migration of LUAD cells

2.5 CENPF通過下調(diào)ACKR3/CXCR7抑制NCI-H2126細胞EMT

NCI-H2126細胞敲除CENPF表達后RNA-seq結(jié)果顯示，共有132個基因的表達出現(xiàn)顯著變化，見圖3A。KEGG富集分析顯示細胞趨化因子信號通路富集差異最為顯著，見圖3B，其中ACKR3/CXCR7表達下調(diào)最為明顯，Western blot驗證結(jié)果表明，CENPF敲除后，ACKR3/CXCR7表達顯著下調(diào)。而在聚類差異中分析顯示，EMT相關基因CDH1/E-cadherin表達顯著上調(diào)，而CDH2/N-cadherin表達顯著下調(diào)，見圖3C，蛋白檢測結(jié)果顯示，敲除CENPF的表達后，E-cadherin顯著上調(diào)，N-cadherin則顯著下調(diào)，見圖3D。

圖3 CENPF通過下調(diào)ACKR3/ CXCR7抑制NCI-H2126細胞EMTFigure 3 CENPF inhibited EMT in NCI-H2126 cells by downregulating ACKR3/CXCR7

3 討論

近年來以表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑為代表的分子靶向及免疫治療的發(fā)展顯著延長了NSCLC患者無進展生存期及總生存期[9]。盡管這些治療方法取得了一定的進展，但由于診斷時多數(shù)患者已經(jīng)是晚期且治療后易出現(xiàn)復發(fā)和耐藥性等，導致其治療前景不甚樂觀。因此研究肺癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點具有重要意義。

CENPF是FOXM1的已知靶點[6]，該蛋白于1993年由Yen和Lee鑒定，約367 kDa。CENPF因其與著絲粒-動粒蛋白復合物的結(jié)合特征而得名，但這種結(jié)合只是短暫的，CENPF還具備其他功能——通過蛋白質(zhì)相互作用對有絲分裂和細胞增殖進行調(diào)節(jié)[10-12]。研究表明，CENPF的表達在乳腺癌及膀胱癌中與患者的預后明顯相關[13-14]；在胃癌中，hnRNPR通過上調(diào)CENPF的表達促進胃癌進展[15]，但CENPF在胃癌中的作用機制仍然不清楚。研究表明[8,16]，在前列腺癌中，CENPF可通過與FOXM1協(xié)同調(diào)節(jié)靶基因表達和激活與前列腺癌惡性相關的關鍵信號通路，協(xié)同促進前列腺癌生長。此外，F(xiàn)OXM1和CENPF的聯(lián)合表達還是前列腺癌預后不良和轉(zhuǎn)移的有力指標[17-18]。盡管以上研究都表明CENPF可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的作用，但CENPF在腫瘤中發(fā)揮的功能及其作用機制卻仍未被完全闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，在LUAD中，CENPF的表達顯著上調(diào)，且與患者N分期及臨床預后顯著相關，這表明，CENPF在LUAD中發(fā)揮著非常重要的作用。

腫瘤細胞要入侵周圍的組織并最終形成轉(zhuǎn)移需要上皮細胞經(jīng)歷一個去分化的過程，這一過程稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。在EMT期間，上皮細胞失去其極性和細胞間黏附，并獲得具有更高運動性的間充質(zhì)表型[19]。在EMT過程中，上皮細胞黏附連接的蛋白（E-cadherin）被能提供更大連接靈活性的蛋白（N-cadherin）取代，從而導致細胞分離和細胞運動性增強。E-cadherin介導鈣依賴性細胞黏附并在正常組織發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用。在正常組織和細胞中，E-cadherin的表達是可以檢測且表達相對較高的，而N-cadherin則只在心肌、平滑肌及睪丸細胞中表達較高，其他的正常組織細胞表達量則較低或基本檢測不到[20]。而在大部分的腫瘤細胞中，癌細胞為發(fā)動侵襲轉(zhuǎn)移，N-cadherin則經(jīng)常被上調(diào)，E-cadherin則經(jīng)常被下調(diào)。在本研究中，敲除CENPF的表達后，LUAD細胞中被上調(diào)的N-cadherin則被逆轉(zhuǎn)消除，而E-cadherin的表達則被恢復，這表明CENPF能夠通過影響LUAD的EMT過程促進其發(fā)生轉(zhuǎn)移，結(jié)果與患者臨床樣本組織中CENPF的高表達與患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關相符合。

E-cadherin的表達在多個水平上受到調(diào)節(jié)，如表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾等。在轉(zhuǎn)錄水平上，E-cadherin受到許多轉(zhuǎn)錄因子（E-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子，EcTRs）的抑制，如ZEB1、ZEB2、SNAI1、SNAI2、E12/E47和Twist1/2[9]。EcTRs能夠與E-cadherin啟動子區(qū)域結(jié)合從而抑制其表達，在本研究中，RNA-seq測序未發(fā)現(xiàn)LUAD細胞在CENPF表達被改變后EcTRs的表達發(fā)生改變，這表明，CENPF可能不是通過調(diào)控一系列EcTRs的表達，而可能是通過其他途徑抑制了EcTRs與E-cadherin啟動子區(qū)域的結(jié)合。研究表明，ACKR3/CXCR7能夠促進TGF-β1介導的EMT發(fā)生[16]，而本研究中，RNA-seq結(jié)果顯示，趨化因子富集信號通路改變顯著，其中ACKR3/CXCR7表達變化最大，蛋白質(zhì)表達驗證結(jié)果進步一證實，在CENPF敲除后，ACKR3/CXCR7的表達被下調(diào)，本研究發(fā)現(xiàn)CENPF通過調(diào)控ACKR3/CXCR7進而促進肺腺癌細胞的EMT，在后續(xù)研究中對CENFP調(diào)控EMT標志蛋白E-cadherin及N-cadherin的詳細機制仍需要進一步深入研究。

綜上所述，CENPF在LUAD中表達上調(diào)且與患者預后和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關，它能夠通過上調(diào)ACKR3/CXCR7進而促進LUAD細胞EMT的進展。本研究也存在一定的局限性，CENPF調(diào)控ACKR3/CXCR7的詳細機制尚未解釋清楚，仍需要進一步的深入研究。