抑制上游轉(zhuǎn)錄因子2的表達(dá)對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王緒斌，高慎碩，張智凱，馬巖，郭曉波

0 引言

我國(guó)胃癌的發(fā)病率和病死率均處于較高水平[1-3]。胃癌的早期癥狀不明顯，確診時(shí)大多已經(jīng)發(fā)展到晚期階段。目前，胃癌的治療手段主要是手術(shù)和放化療，患者癥狀有所改善但總體生存率仍然不高。近年來(lái)，癌癥基因?qū)用娴臋z測(cè)和治療應(yīng)用越來(lái)越廣。上游轉(zhuǎn)錄因子2（upstream transcription factor 2,USF2）已被證實(shí)在多種腫瘤中發(fā)揮作用[4-5]，本課題組前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)USF2在胃癌組織中高表達(dá)[6]，但USF2基因是否參與胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡尚不明確。本研究旨在分析USF2與胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系，因此我們通過(guò)敲低胃癌細(xì)胞中USF2的表達(dá)，觀察胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的變化，為尋找胃癌診療的新思路提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株GES-1、AGS、HGC-27、MKN-45、MGC-803、SGC-7901和BGC-823購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。BGC-823細(xì)胞在RPMI1640完全培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含10%胎牛血清。在溫度37℃、含5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶試劑購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；USF2 siRNA和陰性對(duì)照siRNA均購(gòu)自上海吉滿公司；PCR引物及試劑盒購(gòu)自廣州銳博公司，Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑和兔多克隆抗體（USF2）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。兔抗人GAPDH抗體和二抗均購(gòu)自武漢三鷹公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，用1×PBS（pH7.4）洗滌，然后使用Lipofectamine?3000將siRNA-USF2、siRNA-NC分別轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞中，空白對(duì)照組不轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、siRNA-NC組和siRNA-USF2組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)USF2 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)mRNA的表達(dá)，β-actin用作內(nèi)源對(duì)照。解鏈曲線用于評(píng)估非特異性擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95℃持續(xù)30 s，95℃ 5 s和60℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如下：USF2：Forward-AAAGGAGGGATCCTGTCCAA，Reverse-CAGGGCGTTCTCATTCTTCA;β-actin：Forward-GCATCGTCACTGGGGAC，Reverse-ACCTGG CCGTCAGGCAGCTC。

1.2.3 Western blot檢測(cè)USF2蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，用冷PBS沖洗細(xì)胞兩次。吸干水分后用RIPA裂解液裂解細(xì)胞獲取細(xì)胞總蛋白，然后用BCA（bicinchoninic acid）蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，使用10%聚丙烯酰胺凝膠通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)（每個(gè)樣品30 μg）。蛋白質(zhì)通過(guò)電泳按分子量分離，然后通過(guò)轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移到NC膜上。用快速封閉液封閉NC膜，再與適當(dāng)?shù)囊豢梗筓SF2，抗GADPH）在4℃孵育過(guò)夜，所有抗體均在4℃按說(shuō)明書(shū)稀釋。第二天將NC膜用TBST洗滌3次，每次5～10 min，然后在室溫下與HRP連接的二抗共同孵育1 h。GADPH用作內(nèi)部對(duì)照。通過(guò)Amersham Imager 680，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光方法對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行曝光。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將上述轉(zhuǎn)染24 h后的三組細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、48、72和96 h采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，即在各時(shí)間點(diǎn)每孔分別加入10 μl CCK-8試劑，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在450 nm處的光密度值，細(xì)胞增殖活性=實(shí)驗(yàn)組光密度值-空白組光密度值。

1.2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 將上述轉(zhuǎn)染24 h后的三組細(xì)胞以每個(gè)培養(yǎng)皿1 000個(gè)的密度重新鋪板，每組設(shè)3個(gè)平皿。每3天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)14天后棄培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，1%結(jié)晶紫染色20 min，沖洗干凈后以進(jìn)行可視化和計(jì)數(shù)，比較克隆形成率。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將上述轉(zhuǎn)染24 h后的三組細(xì)胞常規(guī)消化后，用冷PBS洗滌細(xì)胞，然后離心收集細(xì)胞，重復(fù)1次，用1 ml的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別添加5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，輕輕搖勻細(xì)胞，室溫（25℃）避光孵育15 min，然后每管再加入4 ml結(jié)合緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。分析各組細(xì)胞的凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值（SEM）表示。使用SPSS19.0軟件執(zhí)行兩個(gè)獨(dú)立的樣本t檢驗(yàn)或方差單向分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞系和GES-1細(xì)胞中USF2 mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果示，USF2 mRNA在各組細(xì)胞中的表達(dá)，見(jiàn)圖1。與GES-1細(xì)胞相比較，各組胃癌細(xì)胞系中USF2 mRNA的表達(dá)均升高（P值分別為0.1514，0.1206，0.0694，0.0230，0.0015，0.0001）。因此我們選擇表達(dá)最高的BGC-823細(xì)胞敲低后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 胃癌細(xì)胞系和GES-1細(xì)胞USF2 mRNA的表達(dá)Figure 1 USF2 mRNA expression in gastric cancer cell lines and GES-1 cells

2.2 各組BGC-823細(xì)胞中USF2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平比較

BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染USF2 siRNA 48 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果示，空白對(duì)照組、siRNA-NC組和siRNA-USF2組BGC-823細(xì)胞中USF2 mRNA的表達(dá)水平分別為1.00±0.07、0.96±0.00和0.44±0.09，siRNA-USF2組BGC-823細(xì)胞中USF2 mRNA的表達(dá)水平明顯降低，與空白對(duì)照組和siRNA-NC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0001、0.0002）。BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染USF2 siRNA 72 h后，Western blot法檢測(cè)結(jié)果示，空白對(duì)照組、siRNANC組和siRNA-USF2組BGC-823細(xì)胞中USF2蛋白的表達(dá)水平分別為0.25±0.01、0.26±0.00和0.08±0.00，siRNA-USF2組BGC-823細(xì)胞中USF2蛋白的表達(dá)水平明顯降低，與空白對(duì)照組和siRNA-NC組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0001），見(jiàn)圖2。

圖2 各組BGC-823細(xì)胞中USF2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平Figure 2 The mRNA and protein expression levels of USF2 in BGC-823 cells

2.3 各組BGC-823細(xì)胞的增殖和克隆形成能力比較

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和siRNA-NC組相比，siRNA-USF2組BGC-823細(xì)胞在第1、2、3和4天時(shí)的吸光度值均明顯降低（第1天：P=0.1224、0.0559；第2天：均P＜0.0001；第3天：均P＜0.0001；第4天：P=0.0001、＜0.0001），見(jiàn)表1、圖3。平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、siRNA-NC組和siRNA-USF2組的克隆形成數(shù)分別是81.67±10.02、85.67±9.30和38.00±6.25個(gè)。siRNA-USF2組BGC-823細(xì)胞的克隆數(shù)明顯減少，與空白對(duì)照組和siRNA-NC組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0020、0.0013），見(jiàn)圖4。

圖3 CCK-8法檢測(cè)各組胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖能力Figure 3 Proliferation of BGC-823 cells in each group detected by CCK-8 method

圖4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組BGC-823細(xì)胞的克隆形成能力Figure 4 Clonogenesis ability of BGC-823 cells in each group detected by plate clonogenesis assay

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖活性Table 1 Proliferation activity of BGC-823 cells at different time points in each group

2.4 各組BGC-823細(xì)胞的凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，空白對(duì)照組、siRNANC組和siRNA-USF2組的BGC-823細(xì)胞凋亡率分別是（3.67±1.58）%、（2.87±0.15）%和（11.27±0.65）%。siRNA-USF2組BGC-823細(xì)胞的凋亡率明顯升高，與空白對(duì)照組和siRNANC組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0002、P=0.0001），見(jiàn)圖5。

圖5 USF2 siRNA對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡率的影響Figure 5 Effect of USF2 siRNA on apoptosis rate of gastric cancer BGC-823 cells

2.5 各組BGC-823細(xì)胞的PCNA、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平比較

Western blot法檢測(cè)顯示，空白對(duì)照組、siRNA-NC組和siRNA-USF2組PCNA蛋白的表達(dá)量分別為1.30±0.25、1.21±0.14和0.86±0.10，siRNA-USF2組PCNA表達(dá)量明顯降低，與空白對(duì)照組和siRNA-NC組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0487、P=0.0456）?？瞻讓?duì)照組、siRNANC組和siRNA-USF2組Bax蛋白的表達(dá)量分別是1.10±0.00、0.10±0.00和0.18±0.00，siRNA-USF2組Bax蛋白的表達(dá)量明顯升高，與空白對(duì)照組和siRNA-NC組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0001）；空白對(duì)照組、siRNA-NC組和siRNAUSF2組Bcl-2蛋白的表達(dá)量分別是0.68±0.13、0.68±0.13和0.18±0.24，siRNA-USF2組Bcl-2蛋白的表達(dá)量明顯下降，與空白對(duì)照組和siRNA-NC組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.0001），見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot法檢測(cè)各組胃癌BGC-823細(xì)胞中PCNA、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平Figure 6 Expression levels of PCNA,Bax and Bcl-2 proteins in GC BGC-823 cells of each group detected by Western blot

3 討論

胃癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國(guó)癌癥發(fā)病率中居第六位，致死率高居第二位，嚴(yán)重影響著人們的健康生活和生命安全[1-3]。目前胃癌的治療仍以手術(shù)和放化療為主。隨著胃癌分子分型及發(fā)病機(jī)制研究的不斷進(jìn)展，胃癌治療也逐漸進(jìn)入靶向治療、精準(zhǔn)醫(yī)療及免疫治療的新時(shí)代，基因靶向治療的發(fā)展為臨床提供了新思路。通過(guò)靶向抑制胃癌促癌基因或上調(diào)抑癌基因的表達(dá)，探討其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲、凋亡等生物學(xué)特性的影響，已經(jīng)成為了胃癌基因治療研究的主要思路。人上游轉(zhuǎn)錄因子最初是從HeLa細(xì)胞中提取獲得的兩個(gè)表觀分子量分別為43和44 kDa的USF多肽，分別稱為USF1和USF2[6-8]。USF2是由異二聚體和重疊基因編碼的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子。剪接產(chǎn)生的同型在特定的啟動(dòng)子環(huán)境中表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄活性。盡管人們普遍認(rèn)為不同組織中USF2的表達(dá)和相對(duì)豐度不同，但它在組織中與其他因子協(xié)同作用，并具有刺激特異性轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用[9-10]。USF2是一個(gè)蛋白編碼基因，編碼一個(gè)亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，編碼的蛋白質(zhì)可以通過(guò)富含嘧啶的啟動(dòng)子（Inr）元件和E-box基序激活轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程。

已有研究表明，USF2在肺癌、前列腺癌、乳腺癌和結(jié)直腸癌的發(fā)展中起著重要作用[4-5,11-17]。USF2與胃癌的關(guān)系尚不明確。本研究檢測(cè)了USF2在不同胃癌細(xì)胞系和GES-1細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)USF2在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)均高于GES-1細(xì)胞系，并選擇將表達(dá)最高的BGC-823細(xì)胞敲低后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將USF2 siRNA轉(zhuǎn)染至BGC-823細(xì)胞中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western blot實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效果，顯示轉(zhuǎn)染后USF2 mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯下降，說(shuō)明轉(zhuǎn)染USF2 siRNA能夠成功抑制BGC-823細(xì)胞中USF2的表達(dá)。抑制USF2的表達(dá)后，CCK-8實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，BGC-823細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力明顯減弱。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，BGC-823細(xì)胞的凋亡率明顯增加。這些結(jié)果說(shuō)明USF2 siRNA能明顯抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

PCNA為DNA聚合酶的輔助蛋白，與細(xì)胞DNA合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制BGC-823細(xì)胞中USF2的表達(dá)后，PCNA的表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明BGC-823細(xì)胞的增殖能力受到抑制。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成員，Bax可以通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞膜的通透性來(lái)促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Bcl-2的功能則剛好相反，其抑制細(xì)胞色素C的釋放，阻止細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Bax和Bcl-2的比例決定細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)與否。本研究Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制USF2表達(dá)后，Bax的表達(dá)水平明顯升高，Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，提示BGC-823細(xì)胞的凋亡增加。這些結(jié)果表明USF2 siRNA能夠抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與下調(diào)細(xì)胞中PCNA和Bcl-2蛋白以及促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，轉(zhuǎn)染USF2 siRNA抑制USF2的表達(dá)后，人胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖受到抑制，凋亡增多，這一過(guò)程可能與下調(diào)細(xì)胞中PCNA和Bcl-2蛋白以及促進(jìn)Bax蛋白的表達(dá)相關(guān)。本研究表明USF2在胃癌的增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，為胃癌的基因治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。