蛋白質(zhì)羰基化及茶多酚的預(yù)防作用研究進(jìn)展

左高隆，黃 霞，林 勇*，林海燕，陳美艷，劉仲華

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

氧化應(yīng)激會(huì)引起蛋白質(zhì)發(fā)生可逆與不可逆修飾。其中，可逆修飾主要發(fā)生在半胱氨酸殘基上，且可通過特異性抗氧化酶進(jìn)行修復(fù)[1]。而不可逆修飾如羰基化修飾則無法被體內(nèi)的抗氧化防御機(jī)制修復(fù)[2]。因此，羰基化蛋白質(zhì)會(huì)隨時(shí)間增加慢慢聚集，并引起多種信號(hào)通路改變和細(xì)胞功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3]。蛋白質(zhì)羰基化已被認(rèn)為是機(jī)體氧化損傷的通用標(biāo)志，且與各種疾病的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)[4-5]。

機(jī)體雖無法修復(fù)羰基化蛋白質(zhì)，但可利用各種抗氧化劑或抗氧化酶來抑制氧化應(yīng)激過程從而減少羰基化蛋白質(zhì)的形成，茶多酚便是一種優(yōu)異的抗氧化劑。茶多酚是茶葉中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表兒茶素（EC）及其他約30種酚類化合物的總稱[6]，其抗氧化活性對(duì)于抑制蛋白質(zhì)羰基化和防治相關(guān)疾病具有很好的效果。

1 蛋白質(zhì)羰基化

1.1 羰基化蛋白質(zhì)形成的原因和途徑

活性氧（ROS）被認(rèn)為是有氧代謝的有毒副產(chǎn)物，并且是生物大分子損傷的主要原因[7]。體內(nèi)的ROS 如自由基主要由線粒體電子傳遞鏈上的電子泄露產(chǎn)生[7]。泄漏的電子與氧氣結(jié)合后形成超氧化物陰離子自由基，并在錳、鐵超氧化物歧化酶的作用下被催化生成過氧化氫[8]。一部分過氧化氫與金屬離子發(fā)生芬頓反應(yīng)生成羥基自由基[9]。膜磷脂和甘油三酯的不飽和側(cè)鏈在羥基自由基的作用下，形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如4-羥基壬烯醛（4-HNE）[10]。隨后4-HNE與組氨酸、半胱氨酸和賴氨酸殘基側(cè)鏈發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)修飾進(jìn)而導(dǎo)致羰基化[11]。此外，羰基還可以通過α-酰胺化途徑或谷氨酰胺氧化途徑、賴氨酸殘基與活性羰基衍生物的二次反應(yīng)和氨基酸殘基的金屬催化氧化反應(yīng)產(chǎn)生[12-13]。

1.2 羰基化位點(diǎn)和羰基化蛋白質(zhì)

由于羰基化位點(diǎn)是羰基化蛋白質(zhì)功能改變或缺失的決定性因素，因此鑒定羰基化位點(diǎn)及其在蛋白質(zhì)中的作用對(duì)于了解蛋白質(zhì)羰基化過程和相關(guān)發(fā)病機(jī)理至關(guān)重要。最近一篇綜述報(bào)道了208種蛋白質(zhì)中的456個(gè)非冗余位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)最容易被修飾的殘基是賴氨酸和脯氨酸，其次是精氨酸和蘇氨酸[14]。脯氨酸殘基的高羰基化程度可能因其存在于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的柔性環(huán)中，更容易與氧分子接觸。而蘇氨酸殘基由于擁有疏水側(cè)鏈，因此被埋藏在蛋白質(zhì)中，不易被氧化[15]。另外蛋白質(zhì)羰基化位點(diǎn)容易聚集，這種聚集趨勢(shì)可能由金屬結(jié)合位點(diǎn)引發(fā)，第一個(gè)氨基酸殘基被羰基化后會(huì)發(fā)生連鎖反應(yīng)刺激其它位點(diǎn)進(jìn)一步羰基化[16]。因此，羰基化位點(diǎn)與其在蛋白質(zhì)中所處區(qū)域是否有金屬結(jié)合位點(diǎn)密切相關(guān)。蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞區(qū)室中的位置也是影響其遭受氧化損傷的因素之一。有報(bào)道顯示，44%的羰基化蛋白質(zhì)來自線粒體，28%的來自細(xì)胞溶膠[17]，原因可能是因?yàn)榫€粒體是ROS 的主要來源。

1.3 羰基化蛋白質(zhì)與疾病

羰基化蛋白質(zhì)產(chǎn)生后由于無法被體內(nèi)的抗氧化防御機(jī)制修復(fù)，因此會(huì)隨時(shí)間增長(zhǎng)慢慢聚集，導(dǎo)致多種信號(hào)通路關(guān)鍵酶的功能改變或缺失，進(jìn)而引發(fā)一系列與蛋白質(zhì)羰基化有關(guān)的疾病。

1.3.1 炎癥

有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎患者血漿中的羰基化蛋白質(zhì)濃度顯著增加，并且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[18]。因此，血漿蛋白的羰基化似乎與炎癥的發(fā)展息息相關(guān)。另外，在接受通氣治療的早產(chǎn)兒的氣管吸出物中也觀察到羰基化蛋白質(zhì)增加，并且羰基化蛋白質(zhì)含量與髓過氧化物酶活性具有相關(guān)性[19]。

1.3.2 糖尿病

對(duì)糖尿病患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，年輕I 型糖尿病患者血漿中的羰基化蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康同齡人，而II 型糖尿病患者血漿羰基化蛋白質(zhì)含量甚至更高[20]。并且有證據(jù)表明羰基化蛋白質(zhì)的積累有助于糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展，如動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)功能障礙以及視網(wǎng)膜病變[21-23]。

1.3.3 阿爾茨海默病

脂質(zhì)過氧化衍生的羰基化產(chǎn)物如丙二醛的增加是阿爾茨海默病的一個(gè)特征[24]。在患有輕度認(rèn)知障礙的人的大腦中也觀察到羰基化蛋白質(zhì)含量升高，而這種情況通常在阿爾茨海默病發(fā)病前發(fā)生，這表明蛋白質(zhì)羰基化可能是阿爾茨海默病發(fā)病和持續(xù)惡化的早期原因之一[25]。

2 茶多酚對(duì)蛋白質(zhì)羰基化的預(yù)防作用

2.1 茶多酚的抗氧化能力及機(jī)制

2.1.1 直接清除體內(nèi)自由基

茶多酚可以通過清除ROS 并產(chǎn)生更穩(wěn)定的酚類自由基來減少氧化應(yīng)激，其還可在氧化過程的早期階段通過降低黃嘌呤氧化酶活性來抑制ROS 的生成[6]。

2.1.2 預(yù)防脂質(zhì)過氧化

ROS 與生物膜的多不飽和脂肪酸側(cè)鏈及核酸等生物大分子物質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如丙二醛（MDA）和4-HNE，并引起細(xì)胞膜通透性和流動(dòng)性改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損[10]。茶多酚不僅可以清除電子傳遞鏈上的氧自由基，還可以清除電子傳遞鏈反應(yīng)的中間產(chǎn)物如脂質(zhì)過氧化自由基和烷氧自由基，從而阻止自由基的擴(kuò)增[26]。

2.1.3 螯合金屬離子

金屬離子是許多自由基產(chǎn)生過程中的催化劑，尤其是Fe2+，不僅能夠催化自由基的產(chǎn)生，還能夠介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[9]。茶多酚能夠螯合金屬離子鐵和銅，從而防止金屬離子作為催化劑催化自由基的生成[27]。

2.1.4 增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力

核因子Nrf 2 信號(hào)通路是目前發(fā)現(xiàn)抵御外源性刺激和有毒物質(zhì)的核心轉(zhuǎn)錄因子。有研究表明，EGCG 通過抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中P21的表達(dá)來激活Nrf 2 信號(hào)通路，以阻止由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老[28]。并且我們推測(cè)PI3k 和蛋白激酶B 也可能參與了茶多酚對(duì)Nrf 2 抗氧化防御途徑的調(diào)節(jié)[29]。此外，綠茶多酚還可通過抑制核因子kB、細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和絲裂原活化蛋白激酶的活化來起抗氧化作用[30]。在H2N2誘導(dǎo)人真皮層纖維細(xì)胞損傷實(shí)驗(yàn)中，EGCG 可通過增強(qiáng)超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX-px）活性以及降低MDA 水平來減少氧化損傷[26]。最后，EGCG 還通過與特異性受體如67KD 層粘連蛋白受體結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)的第二信使如Ca2+增加，而這些信使能夠刺激如蛋白激酶B、一氧化氮合酶和酸性鞘磷脂等生物活性分子來抑制氧化應(yīng)激[31]。

2.2 茶多酚抑制蛋白質(zhì)羰基化作用及機(jī)制

當(dāng)機(jī)體內(nèi)抗氧化與氧化能力失衡后，會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)被羰基化。茶多酚的抗氧化能力能夠減少機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其可通過多種途徑抑制蛋白質(zhì)羰基化過程（圖1）。目前已有許多報(bào)道表明了茶多酚對(duì)蛋白質(zhì)羰基化的抑制作用。

一是茶多酚可通過螯合金屬離子、抑制黃嘌呤氧化酶活性以及直接與體內(nèi)ROS 結(jié)合來減少機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的ROS，以此來抑制蛋白質(zhì)羰基化。有報(bào)道表明，EGCG 可以通過螯合鐵離子來抑制蛋白質(zhì)羰基化，并改善由1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導(dǎo)的神經(jīng)缺陷[32]。

二是茶多酚可通過增強(qiáng)體內(nèi)的抗氧化酶活性來抑制蛋白質(zhì)羰基化。在體能恢復(fù)試驗(yàn)中，兒茶素預(yù)處理能夠降低跑步后比目魚肌中的羰基化蛋白質(zhì)含量，這可能是因?yàn)閮翰杷氐臄z入使肌原纖維蛋白和抗氧化酶活性增加，并以此減少骨骼肌收縮功能障礙和肌肉萎縮[33]。GPX-px 是一種減少脂質(zhì)過氧化物的重要酶，而脂質(zhì)過氧化物與羰基化的形成密切相關(guān)。在氟化鈉的肝毒性實(shí)驗(yàn)中，EGCG 可以防止由氟化鈉導(dǎo)致的肝臟羰基化蛋白含量增加[34]。同時(shí)，喂食綠茶兒茶素能夠降低老齡小鼠大腦中的羰基化蛋白質(zhì)水平[35]。這可能是通過增強(qiáng)機(jī)體中GPX-px 的活性來達(dá)到抑制羰基化蛋白的作用。另一篇文獻(xiàn)也報(bào)道了服用綠茶兒茶素可以防止老年小鼠大腦海馬中SOD 和GPX-px 活性的下降并使羰基化蛋白質(zhì)含量減少[36]。

三是茶多酚還可通過減少脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物來抑制蛋白質(zhì)羰基化。研究人員發(fā)現(xiàn)EGCG和綠茶水提取物均能夠在結(jié)腸生理模擬條件下猝滅4-HNE[37]。這可能是減少羰基化蛋白產(chǎn)生的原因之一。在用EGCG 給老齡大鼠灌胃30 d后，老齡大鼠的脂質(zhì)過氧化水平和蛋白質(zhì)羰基含量顯著降低[38]。此外，通過給老齡大鼠喂食富含多酚的綠茶提取物，在其心臟組織中同樣觀察到脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)羰基化被抑制以及GPX-px 活性的增加[39]。

3 總結(jié)與展望

蛋白質(zhì)羰基化是否能夠成為疾病的致病原因，其中羰基化位點(diǎn)是至關(guān)重要的。只有在鑒定羰基化位點(diǎn)后，才能評(píng)估蛋白質(zhì)羰基化對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)位點(diǎn)決定了蛋白質(zhì)的功能，并且未來我們需要進(jìn)一步闡明羰基化蛋白質(zhì)豐度和羰基化的目標(biāo)蛋白在疾病發(fā)生與發(fā)展中的重要作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)羰基修飾與多種健康疾病相關(guān)，如衰老、神經(jīng)退行性疾病、癌癥和II 型糖尿病等。而茶多酚具備很強(qiáng)的抗氧化能力，它能夠通過多種途徑去抑制蛋白質(zhì)羰基化過程，這為防治蛋白質(zhì)羰基化相關(guān)疾病提供了可能。隨著對(duì)茶多酚預(yù)防蛋白質(zhì)羰基化過程的繼續(xù)深入研究，并最終運(yùn)用于臨床試驗(yàn)，將一定能為蛋白質(zhì)羰基化疾病的治療和茶葉保健功能的開發(fā)利用提供理論支撐。