淡竹葉碳量子點(diǎn)的微波法制備及在細(xì)胞成像中的應(yīng)用探究

胡妙言，劉凱，高詩(shī)雨，孫天懿，史繼晨，徐長(zhǎng)妍，2，3*，徐麗，2，3*

（1.南京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210000；2.南京林業(yè)大學(xué)江蘇省林產(chǎn)品高效加工利用聯(lián)合創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210000；3.南京林業(yè)大學(xué)綠色生物質(zhì)燃料與化學(xué)品江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210000；4.2019年江蘇省研究生工作站：靖江國(guó)林木業(yè)有限公司（工作站編號(hào)：2019_099），江蘇 靖江 214500）

1 引 言

碳量子點(diǎn)（Carbon quantum dots，CQDs）是一種零維碳基納米材料，具有良好的生物相容性和優(yōu)異的光致發(fā)光性能[1]，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞成像[2]、藥物傳遞[3]、離子檢測(cè)[4]等領(lǐng)域。碳量子點(diǎn)的物理化學(xué)性質(zhì)受碳源和制備方法的直接影響，如雜原子的引入，可以改善CQDs的性質(zhì)[5]。生物質(zhì)材料一般具有豐富的雜原子，可實(shí)現(xiàn)CQDs合成過(guò)程中的雜原子自摻雜，無(wú)需引入新的摻雜劑或者經(jīng)過(guò)繁雜的鈍化過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)雜原子誘導(dǎo)而形成新的表面態(tài)，從而提高CQDs的熒光量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度[6-7]。此外，生物質(zhì)碳源還具有環(huán)保、成本低、來(lái)源廣泛的優(yōu)點(diǎn)，還可以一定程度上替代昂貴的化學(xué)試劑[8-9]。近年來(lái)，一些生物質(zhì)碳源如葡萄籽[5]、西蘭花[6]和大蒜[10]等已被用于合成雜原子摻雜的CQDs，且憑借其生物相容性良好、細(xì)胞毒性較低、熒光穩(wěn)定性良好而在細(xì)胞成像等領(lǐng)域體現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。

碳量子點(diǎn)的合成方法包括微波法[11]、水熱法[12]、激光銷(xiāo)蝕法[13]和電弧放電法[14]等。其中，微波法相對(duì)于其他CQDs制備方法，是一種應(yīng)用廣泛、綠色、快速、高效的碳量子點(diǎn)制備方法，通過(guò)高頻率電磁波作用，在短時(shí)間內(nèi)使碳量子點(diǎn)的碳源發(fā)生碳化、裂解從而達(dá)到快速制備碳量子點(diǎn)的目的[15]。但是，通過(guò)微波法制備的CQDs目前仍然存在粒徑分布不均勻、性能可控性較差等問(wèn)題[16]，這主要是因?yàn)槠渲苽涔に噮?shù)的選取不合理所致?，F(xiàn)有有關(guān)微波法制備CQDs工藝參數(shù)優(yōu)化的研究多采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，雖然可以在一定程度上優(yōu)化CQDs制備工藝，但不能用于系統(tǒng)分析各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響主次順序、各因素兩兩組合的交互作用、對(duì)指定工藝下制備的碳點(diǎn)進(jìn)行性能預(yù)判[11,15-16]。因此，科學(xué)優(yōu)化CQDs的微波法制備工藝對(duì)于提高微波法制備CQDs的效率、改善CQDs的結(jié)構(gòu)和性能從而促進(jìn)其應(yīng)用具有重要意義。

淡竹葉（Lophatherum gracile）是一種藥食同源的多年生草本植物，廣泛分布于中國(guó)、日本、韓國(guó)等亞洲國(guó)家[17-19]，已被中國(guó)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)批準(zhǔn)為功能性食品工業(yè)中的天然添加劑[20]。淡竹葉富含的類(lèi)黃酮、多糖、酚酸等生物活性物質(zhì)和礦質(zhì)元素賦予其良好的藥理作用，為建立具有良好生物相容性的CQDs的活性功能基團(tuán)提供了機(jī)會(huì)[21]。但現(xiàn)階段淡竹葉除部分莖葉得到入藥利用以外，均被丟棄浪費(fèi)[22]。如何提高淡竹葉的功能化、高附加值的轉(zhuǎn)換利用是該產(chǎn)業(yè)面臨的一個(gè)難題。

響應(yīng)曲面法（Response surface methodology，RSM）是一種所需要的試驗(yàn)組數(shù)相對(duì)較少的統(tǒng)計(jì)學(xué)試驗(yàn)方法，可以找出各因素水平的最佳組合，揭示試驗(yàn)指標(biāo)與各因子間的定量規(guī)律。此外，采用該方法還可以在多元線性回歸的基礎(chǔ)上主動(dòng)收集數(shù)據(jù)，獲得具有較好擬合效果的回歸方程的同時(shí)建立復(fù)雜多維空間曲面，使得預(yù)測(cè)較接近實(shí)際情況[23]。

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淡竹葉的C、O、Si、N元素含量較高，是合成氮硅自摻雜碳量子點(diǎn)（N/Si-CQDs）的理想材料，而利用淡竹葉制備CQDs的相關(guān)研究還未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道[24]。值得注意的是，生物相容性和地球豐富度俱佳的氮（N）和硅（Si）元素，近年來(lái)由于適宜的原子大小、化學(xué)價(jià)態(tài)以及化學(xué)惰性和低毒性的優(yōu)點(diǎn)，在CQDs摻雜過(guò)程中，易于引入多種官能團(tuán)，提供更多的活性位點(diǎn)，產(chǎn)生更多的表面缺陷，可以獲得較高的量子產(chǎn)率和熒光強(qiáng)度，因而在CQDs摻雜領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[4,7,12]。但現(xiàn)階段隨著雜原子的加入，引起了CQDs的粒徑增大，且由于摻雜CQDs的粒徑大小在細(xì)胞毒性與熒光特性方面起著重要的影響作用，CQDs的粒徑控制與尺寸均勻性不佳，在一定程度上限制了CQDs的實(shí)際使用。而近年來(lái)發(fā)展的極小CQDs（指粒徑小于3 nm的CQDs）由于平均粒徑較小、粒徑分布均勻，在生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域展現(xiàn)出更好的效果[9]。因此，本研究將淡竹葉作為唯一原料，以響應(yīng)曲面法優(yōu)化極小N/Si-CQDs的微波法制備工藝，并采用步驟簡(jiǎn)單、應(yīng)用廣泛的CCK-8實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估N/Si-CQDs對(duì)轉(zhuǎn)染效率高、增長(zhǎng)速度快、對(duì)外界微環(huán)境較為敏感的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞毒性[25]，探索其在細(xì)胞成像中的應(yīng)用潛力。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料見(jiàn)表S1，所有試劑均為分析純，無(wú)需進(jìn)一步純化即可使用。

2.2 N/Si-CQDs的微波法制備

2.2.1 實(shí)驗(yàn)方案

采用微波法制備淡竹葉氮硅自摻雜碳量子點(diǎn)（N/Si-CQDs）的工藝參數(shù)優(yōu)化包括兩步。首先，以N/Si-CQDs的熒光量子產(chǎn)率（QY）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合已有研究[1,16]，采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，初步確定微波作用時(shí)間（T，min）、微波功率（W，W）和淡竹葉與去離子水的料液比（R，mg/mL）的取值范圍，見(jiàn)表S2。其中，單因素實(shí)驗(yàn)T的范圍為5～25 min，步長(zhǎng)為5；W的范圍為200～1 000 W，步長(zhǎng)為200；R的范圍為5～25 mg/mL，步長(zhǎng)為5。然后，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以T、W和R為自變量，以QY為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，綜合考慮T、W和R對(duì)QY的協(xié)同作用，得到三個(gè)自變量的最優(yōu)取值，并建立QY的預(yù)測(cè)模型。其中T的范圍為10～20 min，步長(zhǎng)為5；W的范圍為400～800 W，步長(zhǎng)為200；R的范圍為15～25 mg/mL，步長(zhǎng)為5，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表Tab.1 Response surface test factor level coding table

2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

按照表S2中微波作用時(shí)間（T）、微波功率（W）和淡竹葉與去離子水的料液比（R）的取值，采用以下步驟制備N(xiāo)/Si-CQDs：第一步，使用250 mL的燒杯盛裝，選擇指定料液比的淡竹葉粉末與分散劑（去離子水10 mL）；第二步，利用磁力攪拌器（MYP11-2，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，中國(guó)）攪拌10 min，轉(zhuǎn)速為500 r/min，使淡竹葉粉充分分散在水中，并將燒杯放入微波爐（G90F23CN3LV-C2（S5）,Galanz,China）中進(jìn)行微波處理；第三步，取出燒杯，加入30 mL去離子水?dāng)嚢?，得到反?yīng)液，使用0.22μm濾微孔濾膜純化，以去除殘留物和大顆粒，并將過(guò)濾的反應(yīng)液利用離心機(jī)（H-1650,Cence,China）以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，得到的上清液即為N/Si-CQDs水溶液；第四步，將上述N/Si-CQDs水溶液冷凍1 d后（-20℃），采用真空冷凍干燥機(jī)（Alpha 1-2 LDplus,BMH,China）在-60℃下干燥處理3 d，得到固體N/Si-CQDs，用于配制指定濃度的N/Si-CQDs水溶液及后續(xù)表征。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.3 N/Si-CQDs的性能表征

2.3.1 N/Si-CQDs的物理形貌表征

采用高倍率透射電子顯微鏡（JEM-2100 UHR,JEOL,Japan）表 征N/Si-CQDs的物理形貌。采用滴管將配制的N/Si-CQDs分散液（0.5 mg/mL）滴于超薄碳支撐膜上，自然晾干后，使用高倍率透射電子顯微鏡觀察N/Si-CQDs的形貌。

2.3.2 N/Si-CQDs的化學(xué)結(jié)構(gòu)表征

采用拉曼光譜儀（HORIBA LabRAM.,HR Evolution,Fr）、傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS10,Thermo Electron Corp.,Madison,WI,USA）和X射線光電子能譜儀（AXIS Ultra ADLD,Shimadzu,Japan）表征N/Si-CQDs的化學(xué)結(jié)構(gòu)。取N/Si-CQDs粉末（2 mg）與純KBr（200 mg）研細(xì)均勻，壓片（厚度1 mm，直徑13 nm），即可用于測(cè)定紅外光譜。取N/Si-CQDs粉末（0.1 g），壓片（厚度1 mm，直徑5 nm），即可用于測(cè)定XPS，結(jié)合能根據(jù)284.6 eV的C 1s峰校準(zhǔn)。

2.3.3 N/Si-CQDs的光致發(fā)光特性表征

分別通過(guò)熒光分光光度計(jì)（LS55,Perkin-Elmer,USA）和紫外分光光度計(jì)（LAMBDA950,Perkin-Elmer,USA）在掃描速度均為300 nm/min的條件下，獲得配制的N/Si-CQDs水溶液（0.5 mg/mL）的熒光光譜和紫外-可見(jiàn)吸收光譜。本研究將獲得的熒光光譜峰值數(shù)據(jù)最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)定義為N/Si-CQDs的最佳激發(fā)波長(zhǎng)。

根據(jù)公式（1）計(jì)算N/Si-CQDs的熒光量子產(chǎn)率QY（ηQY）[26]。選擇溶解在0.1 mol/L硫酸中的硫酸奎寧作為參比物（ηQY=54%），在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm處分別測(cè)定參比物和N/Si-CQDs水溶液樣品的熒光光譜和吸光度曲線。

其中，ηQY為N/Si-CQDs的熒光量子產(chǎn)率；I為測(cè)得的熒光光譜的積分面積，下標(biāo)R代表參比物，X代表N/Si-CQDs樣品；A為360 nm激發(fā)波長(zhǎng)處的吸光度；η為折射率，在本研究中，ηX/ηR=1。熒光量子產(chǎn)率是研究弛豫過(guò)程和光化學(xué)歷程的重要參數(shù)，它表示物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)化成熒光的性能。熒光量子產(chǎn)率也與物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，在定量的光化學(xué)中，熒光量子產(chǎn)率是一個(gè)十分有用的參量[26]。

碳量子點(diǎn)的熒光穩(wěn)定性直接關(guān)系到在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用效果，因此，本研究還探討了N/Si-CQDs的熒光穩(wěn)定性，主要考察了紫外光（365 nm）照射與氯化鈉濃度以及不同pH對(duì)N/Si-CQDs熒光強(qiáng)度的影響，即N/Si-CQDs的抗光漂白性試驗(yàn)、抗鹽性試驗(yàn)和N/Si-CQDs在不同pH條件下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)[27-28]。在N/Si-CQDs的抗光漂白性試驗(yàn)中，先將配制的N/Si-CQDs水溶液（0.5 mg/mL）密封于透明離心管并放置在暗室中，使用紫外燈持續(xù)照射不同時(shí)間（0，1，2，3，4，5，6 h）后，再利用熒光分光光度計(jì)記錄N/Si-CQDs溶液在最佳激發(fā)波長(zhǎng)處的熒光光譜數(shù)據(jù)；在N/Si-CQDs的抗鹽性實(shí)驗(yàn)中，為考察N/Si-CQDs受共存分子和離子的干擾情況，在pH=7的條件下分別在配制的N/Si-CQDs水溶液（0.5 mg/mL）中加入不同克重的Na-Cl，使NaCl的濃度達(dá)到指定值（0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mol/mL），再記錄N/Si-CQDs在不同NaCl濃度下在最佳激發(fā)波長(zhǎng)處的熒光光譜數(shù)據(jù)；在N/Si-CQDs在不同pH條件下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，為考察N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度受不同pH條件的干擾情況，本研究將熒光光譜數(shù)據(jù)中的峰值定義為N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度（FL）。

2.4 N/Si-CQDs的細(xì)胞毒性試驗(yàn)與細(xì)胞成像試驗(yàn)

培養(yǎng)基配制：先將胎牛血清在56℃下滅活0.5 h，然后配制10%胎牛血清血清和1%雙抗的培養(yǎng)基；胰蛋白酶配制：精確稱定0.25 g胰蛋白酶到100 mL容量瓶中，加磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解定容；細(xì)胞懸液配制：細(xì)胞株中加入上述配制培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃，5% CO2），每隔24 h換液，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%。用胰蛋白酶將細(xì)胞消化為細(xì)胞懸液。

細(xì)胞毒性試驗(yàn)：采用CCK-8試劑盒測(cè)定N/Si-CQDs對(duì)人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）的毒性。先將預(yù)先制備好的HEK293細(xì)胞懸液按每孔100μL加入到96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞密度為1×105個(gè)；然后將培養(yǎng)板在細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)（37℃，5% CO2）24 h，再?gòu)呐囵B(yǎng)箱里取出。每孔加入10μL不同質(zhì)量濃度（12.5，20，50，100，200μg/mL）的N/Si-CQDs溶液（以無(wú)菌去離子水配制）后，放回培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）持續(xù)孵育24 h。從培養(yǎng)箱里取出培養(yǎng)板，再向每孔加入10μL的CCK-8溶液，再次放回培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）孵育2 h。拿出培養(yǎng)板，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。按照公式（2）計(jì)算細(xì)胞存活率（Cell viability）：

其中，As為實(shí)驗(yàn)孔吸光度（含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液、N/Si-CQDs溶液），Ac為對(duì)照孔吸光度（含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液、不含N/Si-CQDs溶液），Ab為空白孔吸光度（含培養(yǎng)基、CCK-8溶液、不含細(xì)胞、N/Si-CQDs溶液）。

細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)：先將預(yù)先制備好的細(xì)胞懸液接種到含有培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中，再將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h（37℃，5% CO2），然后用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）緩沖液（pH=7.4）洗滌細(xì)胞。將濃度為200μg/mL的N/Si-CQDs溶液加入孔中，并進(jìn)一步孵育24 h。然后，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）（pH=7.4）洗滌三次，去除多余的沒(méi)有進(jìn)入細(xì)胞的N/Si-CQDs，并使用共聚焦激光掃描顯微鏡（NIKON Eclipse Ti,NIKON,Japan）系統(tǒng)在405 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光成像情況。

3 結(jié)果與討論

3.1 N/Si-CQDs的微波法制備工藝優(yōu)化

3.1.1 單因素試驗(yàn)

如圖1（a）～（c）所示，本研究通過(guò)控制單一變量分別得到了三因素（T、W、R）對(duì)熒光量子產(chǎn)率（QY）的影響。隨著微波時(shí)間自5 min增加至25 min，QY數(shù)值呈現(xiàn)出明顯的先增大后減小的變化趨勢(shì)，且在T=15 min時(shí)QY達(dá)到最高值1.34%（圖1（a））。當(dāng)W由200 W增加至600 W時(shí)，QY由1.10%增至1.37%；但當(dāng)W繼續(xù)從600 W增 至1 000 W時(shí)，QY反而由1.37%緩慢降低至1.36%（圖1（b））。此外，隨著R由5 mg/mL增至25 mg/mL，QY也呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢(shì)，且在R=20 mg/mL時(shí)QY達(dá)到最高值1.54%（圖1（c））。綜上所述，在微波法合成N/Si-CQDs的過(guò)程中，需要經(jīng)過(guò)“氧化分解-交聯(lián)-碳化”過(guò)程。為了使氧化分解發(fā)生，需要一定的溫度和反應(yīng)時(shí)間閾值，這與微波功率及微波作用時(shí)間密切相關(guān)[15]。在單因素實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，相對(duì)較低的功率和較短的反應(yīng)時(shí)間可以觸發(fā)前驅(qū)體碳材料初步形成N/Si-CQDs碳核結(jié)構(gòu)，具有相對(duì)較低的熒光；而功率的提升和反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，往往使得前驅(qū)體進(jìn)一步碳化，這造成了碳量子點(diǎn)材料表面官能團(tuán)破壞與粒子聚集等，從而降低其熒光。綜合考慮三因素T、W、R對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)QY的影響，后續(xù)響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)選擇T的范圍為10～20 min，步長(zhǎng)為5；W的范圍為400～800 W，步長(zhǎng)為200；R的 范圍為15～25 mg/mL，步長(zhǎng)為5。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析：（a）T，（b）W，（c）R。Fig.1 Analysis of single factor test results：（a）T，（b）W，（c）R.

3.1.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)曲面法詳細(xì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表S3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。應(yīng)用Design-expert統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合得到：ηQY=1.61-0.1432*T+0.0348*W-0.0566*R+0.0125*TW-0.0270*TR+0.0187*WR-0.3018*T2-0.1281*W2-0.1336*R2。

由表2可知，本研究回歸模型（P＜0.001）顯著，失擬項(xiàng)（P=0.112 2＞0.05）[30]表明失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著。因此，該模型對(duì)試驗(yàn)的擬合程度良好，能較好地反映各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行分析。由F與P值的大小可以推斷，在所選擇的試驗(yàn)范圍內(nèi)，3個(gè)因素對(duì)QY影響的順序?yàn)椋篢＞R＞W(wǎng)。二次項(xiàng)T2、W2和R2的影響極顯著，一次項(xiàng)T、R也達(dá)到極顯著水平，表明各提取工藝參數(shù)對(duì)量子產(chǎn)率的影響不是簡(jiǎn)單線性關(guān)系[31]。根據(jù)回歸方程得到模擬的響應(yīng)曲面圖及相應(yīng)的等高線圖，如圖2（a）～（f）所示，響應(yīng)面的坡度越大，等高線的形狀越接近橢圓形，說(shuō)明響應(yīng)面對(duì)該影響因素有較高的敏感度[32]，即對(duì)QY影響較大。

表2 回歸方程方差分析Tab.2 Variance analysis of regression equation

如圖2（a）～（f）所示，QY隨著三因素（T、W、R）的變化趨勢(shì)均呈現(xiàn)出一定弧度，但隨T因素變化，響應(yīng)曲面變化更大，R因素次之，隨W因素響應(yīng)曲面變化最小，說(shuō)明T比R與W對(duì)量子產(chǎn)率具有更顯著的影響[23,32]，與方差分析結(jié)果一致。響應(yīng)面分析得到最優(yōu)工藝 為：T為14.056 min、W為618.52 W、R為19.8 mg/mL（10 mL去離子水），此時(shí)QY達(dá)到1.632%?？紤]到試驗(yàn)的可行性與設(shè)備實(shí)際調(diào)節(jié)范圍，我們選擇T為14 min、W為600 W、R為19.8 mg/mL（10 mL去離子水），進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，其平均QY值為1.625%，與理論QY值（1.632%）相對(duì)偏差僅為0.215%，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測(cè)響應(yīng)值的擬合性良好，證明該模型真實(shí)可信。因此，在后續(xù)的碳量子點(diǎn)結(jié)構(gòu)和性能表征中，只選擇在上述最優(yōu)工藝條件下制得的N/Si-CQDs為研究對(duì)象。

圖2 T與W（（a）～（b））、T與R（（c）～（d））、W與R（（e）～（f））對(duì)QY的影響。Fig.2（a），（b）Influence of T and W on QY.（c），（d）Influence of T and R on QY.（e），（f）Influence of W and R on QY.

3.2 N/Si-CQDs的結(jié)構(gòu)與性能

3.2.1 N/Si-CQDs的物理形貌和化學(xué)結(jié)構(gòu)

本研究采用高分辨率透射電子顯微鏡（TEM）研究了N/Si-CQDs的尺寸和形貌。如圖3所示，N/Si-CQDs均勻分布在水中，其顆粒多為球形，具有典型的非晶態(tài)碳質(zhì)結(jié)構(gòu)，無(wú)明顯晶格[33]。使用Nano measurer軟件隨機(jī)選取100個(gè)顆粒測(cè)量粒徑，得到N/Si-CQDs的平均粒徑為1.35 nm。與現(xiàn)有報(bào)道中采用微波法制備的生物質(zhì)碳量子點(diǎn)相比，本研究制備的N/Si-CQDs粒徑更小、粒徑分布更窄，這更有利于其在細(xì)胞成像等領(lǐng)域的應(yīng)用[34]。為進(jìn)一步了解N/Si-CQDs分子結(jié)構(gòu)研究，采用拉曼光譜法分析，如圖S1所示，在1 342 cm-1和1 588 cm-1處存在兩個(gè)主要峰值，分別是D-峰和G-峰[27]。D-峰和G-峰的強(qiáng)度比（I（D）/I（G））約為1.31，表明合成的N/Si-CQDs結(jié)構(gòu)中存在大量的無(wú)定形碳，與上述TEM結(jié)果相互印證。

圖3 N/Si-CQDs的透射電鏡圖，插圖：N/Si-CQDs的粒徑分布圖。Fig.3 TEM image.Inset：particle size distribution of N/Si-CQDs

本研究借助紅外光譜和XPS光譜兩種表征手段，分析了前驅(qū)體淡竹葉與N/Si-CQDs所含元素、官能團(tuán)和化學(xué)鍵，如圖S2、圖S3、圖4和圖5所示。在圖4中，3 270.39 cm-1處的寬峰對(duì)應(yīng)于N—H鍵的拉伸振動(dòng)或O—H伸縮振動(dòng)，較寬峰的原因是：N、O的較強(qiáng)電負(fù)性導(dǎo)致其所對(duì)應(yīng)的—NH2與—OH官能團(tuán)可與溶H2O形成氫鍵[35]。在2 933.55 cm-1附近的峰表明N/Si-CQDs結(jié)構(gòu)中存在C—H伸縮振動(dòng)[36]；2 130.86 cm-1附近區(qū)域的峰表明N/Si-CQDs結(jié)構(gòu)中存在炔烴的伸縮振動(dòng)[37]；在1 574.09 cm-1的峰對(duì)應(yīng)C=C鍵或N—H鍵的拉伸振動(dòng)[35]；在1 361.12 cm-1處的吸收峰歸因于C—H鍵的彎曲振動(dòng)[38]；在1 107.70 cm-1和1 041.83 cm-1處 的峰則應(yīng)屬于Si—O和Si—N鍵伸縮振動(dòng)[7]。與前驅(qū)體淡竹葉的的紅外光譜、XPS圖譜對(duì)比可知，經(jīng)水相微波反應(yīng)后，N/Si-CQDs相較于前驅(qū)體，親水性官能團(tuán)含量提升，Si—O、Si—N等化學(xué)鍵大量生成，由此形成了N/Si-CQDs復(fù)雜表面態(tài)。

圖4 N/Si-CQDs的FT-IR光譜Fig.4 FT-IR spectrum of N/Si-CQDs

圖5 （a）N/Si-CQDs的XPS譜；（b）N/Si-CQDs的元素含量；（c）C 1s的高分辨率XPS譜；（d）N 1s的高分辨率XPS譜；（e）O 1s的高分辨率XPS譜；（f）Si 2p的高分辨率XPS譜。Fig.5 XPS of the N/Si-CQDs（a），element content（b），C 1s（c），N 1s（d），O 1s（e）and Si 2p（f）spectra of the N/Si-CQDs.

在圖5中，N/Si-CQDs的XPS全光譜顯示出4個(gè)主要的特征峰，分別對(duì)應(yīng)于C 1s（284.8 eV）、N 1s（400.0 eV）、O 1s（532.2 eV）和Si 2p（102.2 eV）的結(jié)合能，這表明N/Si-CQDs含有C（72.1%）、N（1.1%）、O（23.7%）和Si（3.1%）4種元素。通過(guò)分峰擬合操作，得到C 1s、N 1s、O 1s和Si 2p的高分辨率XPS光譜（圖5（c）～（f））。其中，C 1s譜顯示出284.9，286.4，288.3 eV的3個(gè)峰，分別歸屬 于C—C[39]、C—O[40]和C=O鍵[41]。N 1s圖 中399.4 eV和400.2 eV處的峰分別歸因于N—Si[42]和N—H鍵[41]。在O 1s圖中，532.3 eV處有1個(gè)擬合峰歸屬于C—O鍵[39]；101.9 eV和102.7 eV的峰分 別 歸 屬 于Si—N[42]和Si—O鍵[43]。總 之，N/Si-CQDs的XPS譜圖分析表明，其結(jié)構(gòu)中含有C—C、C—O、C=O、N—H、Si—N和Si—O鍵等，證實(shí)了N/Si-CQDs表面存在親水基團(tuán)以及N/Si雜原子的成功摻雜，該結(jié)果與N/Si-CQDs的紅外光譜分析結(jié)果相互印證。

3.2.2 N/Si-CQDs的熒光性能及熒光穩(wěn)定性

N/Si-CQDs的熒光發(fā)射呈現(xiàn)出激發(fā)波長(zhǎng)依賴性，如圖6（a）。在370～430 nm激發(fā)波長(zhǎng)條件下，N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，且當(dāng)最佳激發(fā)波長(zhǎng)為400 nm時(shí)，在400 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，如圖6（b）所示，N/Si-CQDs在492 nm處出現(xiàn)最大熒光發(fā)射峰，該發(fā)射波長(zhǎng)位于綠光波段區(qū)域[44]。如上所述，最佳工藝制備的N/Si-CQDs表面富含多種官能團(tuán)，這些官能團(tuán)可以形成缺陷位點(diǎn)的捕獲中心[12]。一般來(lái)說(shuō)，碳量子點(diǎn)的熒光機(jī)制與碳量子點(diǎn)表面態(tài)中電子和空穴之間的輻射復(fù)合有關(guān)[11]。即在一定激發(fā)波長(zhǎng)條件下，本研究制備的N/Si-CQDs表面發(fā)生了電子與空穴的輻射復(fù)合，并被光捕獲。因此，制備的N/Si-CQDs的熒光行為受N/Si-CQDs表面狀態(tài)的支配。由目前對(duì)CQDs材料激發(fā)依賴性熒光機(jī)理探討的報(bào)道可知，表面多種官能團(tuán)的存在會(huì)在其能隙之間形成多重能級(jí)及相應(yīng)的多重電子躍遷，引起CQDs材料的激發(fā)依賴行為[12,15]。因此，本研究認(rèn)為制備的N/Si-CQDs復(fù)雜的表面態(tài)導(dǎo)致了激發(fā)態(tài)的多樣性，即不同表面官能團(tuán)的存在導(dǎo)致不同躍遷模式或引起多種不同能級(jí)，進(jìn)而導(dǎo)致N/Si-CQDs的激發(fā)依賴現(xiàn)象。

為了進(jìn)一步闡明N/Si-CQDs的光學(xué)性質(zhì)，如圖6（b）所示，本研究對(duì)配制的N/Si-CQDs水溶液（0.5 mg/mL）進(jìn)行了紫外-可見(jiàn)吸收光譜與熒光光譜分析，N/Si-CQDs樣品在260～350 nm的紫外波長(zhǎng)范圍內(nèi)表現(xiàn)出吸收，這通常歸屬于C=C鍵的π-π*躍遷，表明了N/Si-CQDs中共軛結(jié)構(gòu)的形成[45]。此外，由圖6（b）中的插圖可見(jiàn)，N/Si-CQDs水溶液在可見(jiàn)光下呈淺黃色，在365 nm紫外光下表現(xiàn)藍(lán)色熒光。N/Si-CQDs具有的良好光致發(fā)光特性可能是由于芳香族sp2結(jié)構(gòu)域的帶隙躍遷、N/Si-CQDs的量子尺寸效應(yīng)和表面缺陷所致[46]。

圖6 （a）不同激發(fā)波長(zhǎng)下N/Si-CQDs的發(fā)射光譜；（b）N/Si-CQDs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜，插圖：N/Si-CQDs水溶液分別在可見(jiàn)光（左）和紫外光365 nm（右）下的照片。Fig.6（a）Emission spectra of N/Si-CQDs at different excitation wavelengths.（b）UV-Vis absorption spectra and fluorescence spectra of N/Si-CQDs.Inset：photograph of N/Si-CQDs aqueous solution under visible light（left）and ultraviolet light（365 nm，right）.

圖7為N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度（FL）IFL穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。圖7（a）的橫坐標(biāo)表示波長(zhǎng)為365 nm的紫外光照射時(shí)長(zhǎng)（0，1，2，3，4，5，6 h），本研究將“紫外燈照射時(shí)長(zhǎng)0 h”的熒光強(qiáng)度定義為I1FL0。圖7（a）的縱坐標(biāo)表示紫外燈照射不同時(shí)長(zhǎng)下N/Si-CQDs對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度I1FL與I1FL0的比值，即為N/Si-CQDs經(jīng)紫外燈照射不同時(shí)長(zhǎng)后的熒光強(qiáng)度保留率（I1FL/I1FL0）。

圖7（b）的橫坐標(biāo)表示NaCl水溶液濃度（0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mol/mL），本 研究 將“NaCl水溶液濃度為0 mol/mL”的熒光強(qiáng)度定義為I2FL0。圖7（a）的縱坐標(biāo)表示N/Si-CQDs在不同濃度的NaCl水溶液中對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度I2FL與I2FL0的比值，即為N/Si-CQDs在不同濃度的NaCl水溶液中的熒光強(qiáng)度保留率（I2FL/I2FL0）。本研究發(fā)現(xiàn)制備的N/Si-CQDs在6 h紫外燈照射后，熒光強(qiáng)度保留率為92.25%。此外，即使氯化鈉濃度高達(dá)0.1 mol/L，N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度保留率仍可達(dá)到98.90%。

圖7 （a）365 nm紫外燈照射時(shí)間對(duì)N/Si-CQDs熒光強(qiáng)度的影響；（b）不同濃度的NaCl對(duì)N/Si-CQDs熒光強(qiáng)度的影響；（c）不同pH對(duì)N/Si-CQDs熒光強(qiáng)度的影響。Fig.7（a）Effect of illumination time under 365 nm UV light on the fluorescence intensity.（b）Effect of NaCl concentrations on the fluorescence intensity.（c）Effect of pH on the fluorescence intensity.

本研究將“pH=4”的熒光強(qiáng)度定義為I3FL0，圖7（c）的縱坐標(biāo)表示N/Si-CQDs在不同pH水溶液中對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度I3FL與I3FL0的比值，即為N/Si-CQDs在不同pH的水溶液中的熒光強(qiáng)度保留率（I3FL/I3FL0）。如圖7（c）所示，隨著pH從4增加到10，N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度保留率為94.24%，F(xiàn)L在酸性和中性環(huán)境下幾乎保持不變。由于大多數(shù)的生物活性反應(yīng)發(fā)生在這個(gè)pH范圍內(nèi)，所以N/Si-CQDs在pH=4～10范圍內(nèi)的高穩(wěn)定性使其在生物應(yīng)用中潛力巨大[27]。

由于N/Si-CQDs溶液的熒光強(qiáng)度FL與N/Si-CQDs在水介質(zhì)形成的膠體和其形態(tài)穩(wěn)定性高度相關(guān)。因此，本研究也進(jìn)行了N/Si-CQDs 7 d內(nèi)的吸光度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，N/Si-CQDs水溶液在避光低溫（4℃）條件下儲(chǔ)存7 d后，吸光度基本維持不變（吸光度保持率大于98.7%），見(jiàn)圖S4。結(jié)合上述對(duì)N/Si-CQDs物理形貌和化學(xué)結(jié)構(gòu)的表征分析，本研究推測(cè)N/Si-CQDs具有較高熒光穩(wěn)定性的原因是N、Si雜原子的成功摻雜誘導(dǎo)形成了大量的表面官能團(tuán)與表面缺陷。這其中N/Si-CQDs表面親水官能團(tuán)的存在使N/Si-CQDs具有良好的水溶性；同時(shí)，N/Si-CQDs表面具有相同或近似的表面官能團(tuán)與表面缺陷，容易造成N/Si-CQDs納米粒子具有相同的表面電荷進(jìn)而造成N/Si-CQDs納米粒子間互斥，即在水中呈現(xiàn)出均勻單分散狀態(tài)，在水介質(zhì)中形成膠體并具有一定的形態(tài)穩(wěn)定性。不僅提高了N/Si-CQDs的熒光量子產(chǎn)率與熒光強(qiáng)度，同時(shí)也提高了N/Si-CQDs的熒光強(qiáng)度穩(wěn)定性[5-6]。

3.3 N/Si-CQDs的細(xì)胞毒性與細(xì)胞成像分析

圖8為HEK293細(xì)胞與不同濃度N/Si-CQDs孵育24 h后的相對(duì)細(xì)胞活性。即使在較高的N/Si-CQDs濃度（200μg/mL）下，HEK293細(xì)胞的存活率（92.95%）仍然超過(guò)90%，這說(shuō)明淡竹葉衍生的N/Si-CQDs具有優(yōu)越的生物相容性[36]。

圖8 HEK293細(xì)胞與不同濃度N/Si-CQDs孵育24 h后的相對(duì)細(xì)胞活性Fig.8 Cell viability of HEK293 cells in the presence of diffferent concentrations of N/Si-CQDs for 24 h

綜上所述，N/Si-CQDs展現(xiàn)出的良好的水分散性、高熒光穩(wěn)定性以及低細(xì)胞毒性，均證明其在細(xì)胞成像領(lǐng)域的應(yīng)用潛力[3,38]。為此，本研究進(jìn)行了體外細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步測(cè)試了N/Si-CQDs作為細(xì)胞成像劑的可行性。圖9為N/Si-CQDs的熒光共聚焦細(xì)胞成像圖片。在含有N/Si-CQDs（200μg/mL）的培養(yǎng)基中孵育24 h后，在405 nm激發(fā)下，HEK293細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)出綠色熒光，細(xì)胞形態(tài)正常。由此推測(cè)，N/Si-CQDs很容易通過(guò)內(nèi)吞作用被細(xì)胞吸收,具有良好的細(xì)胞通透性，并明確區(qū)分細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[43]。體外活細(xì)胞成像是研究活細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的重要手段，可進(jìn)一步加深對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性質(zhì)的理解。本研究制備得到的N/Si-CQDs由于其亮度、光穩(wěn)定性、可調(diào)諧的熒光發(fā)射、低毒性、廉價(jià)的制備等特性，是傳統(tǒng)的熒光探針在細(xì)胞成像領(lǐng)域內(nèi)的有力替代品[1,15]。豐富的親水表面官能團(tuán)與極小的粒徑使這種納米顆粒很容易與細(xì)胞膜相互作用，并通過(guò)內(nèi)吞過(guò)程進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中[27]，在細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)出綠色熒光，表明N/Si-CQDs可能具有標(biāo)記特定的細(xì)胞器的能力，其光譜行為的變化與細(xì)胞和細(xì)胞器內(nèi)的化學(xué)變化相對(duì)應(yīng)的標(biāo)記有望為生物醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域研究提供助力[1,4]。N/Si-CQDs的低毒性使它們能夠在細(xì)胞中無(wú)害地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞成像，這一結(jié)果與前人報(bào)道的生物質(zhì)CQDs具有低細(xì)胞毒性、并可運(yùn)用在細(xì)胞成像領(lǐng)域的研究結(jié)果一致[2]。因此，本研究制備得到的N/Si-CQDs有望作為熒光探針用于活細(xì)胞成像和其他生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

圖9 HEK293細(xì) 胞與N/Si-CQDs（200μg/mL）孵育24 h，在激發(fā)波長(zhǎng)405 nm條件下的熒光圖像。Fig.9 Fluorescence image of HEK293 cells incubated with N/Si-CQDs（200μg/mL）for 24 h under excitation wavelength of 405 nm

4 結(jié) 論

本研究以熒光量子產(chǎn)率為指標(biāo)，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化淡竹葉自摻雜碳量子點(diǎn)N/Si-CQDs的微波制備工藝，確定了微波作用時(shí)間（T）、微波功率（W）、淡竹葉與去離子水的料液比（R）對(duì)熒光量子產(chǎn)率這一指標(biāo)的顯著性影響及其交互作用，確定了最佳工藝參數(shù)，并進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在實(shí)際最佳工藝條件下得到的N/Si-CQDs的水分散性良好、粒徑較小且分布均勻；具有激發(fā)依賴的熒光發(fā)射；N、Si雜原子成功自摻雜使N/Si-CQDs表現(xiàn)出良好的熒光穩(wěn)定性，在長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射后與NaCl濃度范圍較廣的水溶液中熒光強(qiáng)度保留率較高；由于沒(méi)有化學(xué)試劑參與合成，該N/Si-CQDs即使在高濃度下也對(duì)HEK293細(xì)胞表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。此外，N/Si-CQDs能被HEK293細(xì)胞有效吸收，這表明該碳量子點(diǎn)在細(xì)胞成像等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力。綜上所述，以淡竹葉為碳源，通過(guò)引入響應(yīng)曲面法優(yōu)化淡竹葉N/Si-CQDs的微波制備工藝，探究N/Si-CQDs在細(xì)胞成像中的應(yīng)用價(jià)值，不僅為緊迫的廢棄生物質(zhì)資源的高值化轉(zhuǎn)化利用提供了一條新思路，而且對(duì)于提高生物質(zhì)碳量子點(diǎn)的微波法制備效率、促進(jìn)其在細(xì)胞成像等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用具有參考價(jià)值。

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